Summary
ヒト前立腺癌の同所このモデルは、循環腫瘍細胞、腫瘍サイズの定量化を可能にし、肺への明確な転移の形成。細胞が原発臓器をエスケープする必要がありますように、血流に入り、セカンダリサイトへのインプラントは、このモデルは効果的にヒトでシナリオを再現。
Abstract
当研究室では、ヒト前立腺癌（PCA）の新規同所移植モデルを開発しました。 PCaの死は、原発腫瘍が原因ではなく、明確な転移の形成のように、効果的にプレ臨床的に、この進行をモデル化する能力は高い価値がある。このモデルでは、細胞を直接のBALB / c胸腺欠損マウスの前立腺の腹葉に注入され、4〜6週間進行させている。実験終了時に、いくつかの別個のエンドポイントは、そのような大きさおよび分子特性の原発腫瘍、血液および骨髄中の循環腫瘍細胞の存在および定量化、および肺への転移の形成として、測定することができる。エンドポイントの様々に加えて、このモデルが侵入し、脱出原発臓器を入力し、循環系の中で生き残るし、インプラントとセカンダリサイトで増殖する細胞の能力の画像を提供しています。このモデルは、転移を測定するために効果的に使用されているタンパク質発現の両方の変化にだけでなく、短いターンアラウンドタイムの小さな分子治療への応答に反応。
Introduction
前立腺癌（PCA）は、男性で最も一般的に診断される癌、および米国の1の癌による死亡原因の第2位である。 PCaの死は、原発腫瘍の形成によるものではなく、転移の形成。したがって、患者における転移の防止は非常に重要である。 PCAをマウスモデルは、この病気についての重要な生物学的情報を明らかに選択肢の多様性を提供します。
PCAをマウスモデルの様々な固有の利点と限界を、それぞれ存在する。ヒトでのPCA頻度が高いですが、天然に存在するPCAは、がん3への全体的なマウスの同等の感受性にもかかわらず、マウス2で非常に一般的ではありません。一つのげっ歯類の例外はメチルニトロソ尿素およびテストステロン4の誘導により生後12カ月で90％のPCAを速度を実現することができますLobund WistarラットにおけるPCAを開発、である。このため、例えば、TRAMPなどのモデル系を、誘導性モデル（マウス前立腺のトランスジェニック腺癌）が一般的に使用される。 TRAMPモデルは、前立腺で特異的に導入遺伝子の発現を誘導し、過形成からリンパや肺転移5-6に前立腺上皮内腫瘍（PIN）に、PCAを正常な進行を受けることができます。これらのモデルは、腫瘍進行の完全な範囲を測定できるという利点を提供するだけでなく、無傷の免疫系を含有する。しかし、PCaの開発の根底にある分子事象は、マウスおよびヒトの間で異なることができ、マウスおよびヒトの臨床研究の間の相関関係が変動性を示した。さらに、これらのモデルの両方が、時間がかかり、一例として、TRAMPモデルが転移を発生するために、約28週間を必要とする。
転移を研究するには、頻繁に尾静脈または左心室注入モデルが使用される。このモデルは、迅速なターンアラウンドタイムの恩恵、さらに骨metastasの存在を測定することができます特定の細胞系および条件を用いている。 Yang らは、GFP-陽性PC3細胞の皮下注射が広く普及骨転移7および尾静脈注射intercardiacはまた、骨転移の発達8-9を生成した引き起こす可能性があることを報告している。これらのモデルの主な制限は、前立腺自体の中に存在する原発性腫瘍の欠如に関連する。さらに、循環への癌細胞の注入時に依存したモデルのために、これは転移カスケードの全体の前半をバイパスします。それによって生物学的に転移性転換の重要な尺度である原発臓器を通して侵略を含む初期段階、、の検討を妨げる。転移性転換の多くのレギュレータは、直接、早期細胞浸潤に影響を与える。癌細胞が普及一旦、クローン変異は、それによって生物学を増加させる、大きく膨張する転移カスケードにおける初期のステップは、治療的標的化のための高優先サイトを構成するらの多様性と効果的な治療標的化を減少。
これらのモデルの制約の多くに対応しようとして、私たちの研究室では、人間のPCa PC3-M細胞株を直接のBALB / c胸腺欠損マウスの前立腺に移植されたヒトのPCA同所モデルを開発しました。 4〜6週間、腫瘍の大きさ、循環腫瘍細胞（CTCの）の存在下、肺およびリンパ節への転移は、すべての後に定量することができる。我々は、効果的にヒトのPCa 10転移を阻害するために4 '、5,7 -トリヒドロキシイソフラボン（ゲニステイン）の有効性を評価するために、このモデルを使用している。ゲニステインの食物消費量は、前立腺癌の転移および死亡11-12の減少に関連しているが、以前にまだ研究がゲニステインの投与は、動物又は男性におけるPCaの転移を変化させることができるかどうかを決定なかった。本研究では、ゲニステインでの処置が大きく肺転移の数を減少させることを実証した。さらに、当社は、ゲニステインらが決定焦点接着キナーゼ（FAK）、p38マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPKのp38）、および熱ショックタンパク質27（HSP27）を含む、原発性腫瘍のいくつかの重要な炎症転移タンパク質の活性化および発現をtered。
これらの結果は、診療所での観測値と一致した。マウスから得られた血液を使用して、我々は正確にゲニステインの血中濃度を測定することができたとゲニステインの定期的な食物摂取によるヒトにおけるレベルに類似して、これらを観察した。我々のグループによって実行される第II相試験は、ゲニステインで処理すると、その決定に加えて、男性は、特にマトリックスメタロタイプ2（MMP-2）13を細胞浸潤や転移に関連する遺伝子の前立腺組織mRNA発現の減少を経験した。
我々はまた、ヒトのPCa転移14上原発腫瘍に改変された遺伝子産物発現の効果を評価するために、このモデルを使用している。腫瘍SUPPR当該プロセッサのグリンは、TGFβスーパーファミリーのメンバーであり、15シグナリングのSmadの変化を経由してインビトロでヒトのPCa細胞浸潤を抑制します。我々は、ヒトPCaの転移に対するエンドグリンの効果を決定するためにこれらの研究を拡張した。安定したノックダウンエンドグリン、発現細胞株上のベクトル制御又はエンドグリンをマウスに移植した。グリンノックダウン細胞は、マウスの38％で最も高い肺転移の数だけでなく、CTCのを示した。コントロールベクターを移植したマウスは、マウスのわずか18％でマウスあたり少ない肺転移で、メディア応答を示し、CTCの。高グリン移植されたマウスは、肺転移のほぼ完全に抑制し、CTCの完全な抑制を示した。
これらは、この技術が持つ多種多様なアプリケーションのほんの2つの例である。創薬から、分子生物学におけるモデリングの変化に、このモデルは、腫瘍増殖およびモルに様々な機能の効果を評価するハイスループット方法を提供するcularが変化すると、CTCの存在、および肺やリンパ節の明らかな転移の形成。
Protocol
動物に関わるすべての手続きのために、プロトコルは、ノースウェスタン大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認された。外科技術および動物ケアの条件は、獣医スタッフによって観察し、動物のストレスまたは死亡率を最小化するために修飾した。個々の機関が異なる要件を持つことができ、この手術法を開発し、実行する際には、動物実験委員会および動物のスタッフと連携することが重要です。
1。注射用細胞の調製
- このステップは、手術の開始のできるだけ近くに行われるべきである。実験に使用されてトリプシン処理細胞を、プレートから除去し、培地を中和する。安定的にGFPをトランスフェクトしたPC3-MヒトのPCa細胞株は、正常に起因PC3-M細胞の急速な成長条件に、これらの実験に使用されている。 GFPは、肺組織試料中の肺転移の検出の追加の容易さ、および迅速な決定のために添加した循環腫瘍細胞を同定するために、血液および骨髄から得られた培養物における免疫細胞に対する癌細胞。関心対象の特定の遺伝子を改変する場合、この遺伝子の変化を有する安定な細胞株の作成は、GFPでのトランスフェクションに続いて、最初に実行される。 GFPは、目的のこの遺伝子の機能を改変する場合は、GFPには、省略することができる。これは肺転移の検出がより困難、まだ達成可能になります。さらに、このようなルシフェラーゼに基づくIVISのような蛍光マーカーを使用して、特定のイメージング技術を使用する場合、他の蛍光タンパク質が代わりに使用することができる。
- 225 X gで5分間遠心分離します。
- 2.5×10 5細胞を分離し、225×gで5分間遠心分離します。
- 上清を除去し、滅菌生理食塩水20μlに細胞を再懸濁。
- 永久28½G針で0.5ミリリットルシリンジに吸引細胞懸濁液（推奨：ケンドールMonojetを、他のブランドには問題を引き起こしているように）、空気を確保していないが、針らに入る懸濁液とONG。
- 無菌ホイルでシリンジをラップし、使用するまで氷上で保存する。
2。ヒト前立腺癌細胞の同所移植
- 6〜8週齢の雄のBalb / cの無胸腺マウスを使用する。手術の理想的なマウス体重19〜21 gで、マウスは、手術の前に少なくとも18 gまで増殖させるべきである。小さい動物は、技術的に操作することがより困難である。より大きな動物は、腫瘍増殖および転移のより遅い速度を経験する傾向がある。動物は、動物のストレスを最小限にするために手術前に少なくとも1週間動物施設に収容されるべきである。実験設計に応じて、薬物治療は、手術の前に一週間を開始することができる。
- 動物施設の説明書に従って手術前鎮痛剤を注入する。 1mlシリンジに取り付けられた30½Gの針を用いて0.1 mg / kg体重の皮下Buprenexが示唆される。
- イソフルラン室に動物を置き、動物が完全になるまで待つnesthetized。筋緊張のないつま先の反射は、この時点では存在してはならない。この方法は推奨されるが、利用できない場合には、麻酔の他の方法は、動物施設の指示に従って使用することができる。
- 無菌手順フードにイソフルラン室から動物を移動します。ノーズコーン装置に動物を置き、その動物が進む前に、完全な麻酔の下で再確認してください。
- ベタジン溶液で拭いてアルコールで拭いて、滅菌した綿球でベタジンスクラブで下腹部を消毒し、最終的なスプレー。乾燥することができます。
- 滅菌メスや鋭利に無菌手術用ハサミのいずれかを使用して、約3〜4程度の低い腹部正中切開を行う。優しく鉗子を使用して膀胱を持ち上げ、前立腺の腹葉を識別します。これら2葉は、膀胱のすぐ下に位置しています。一部のマウスを静かに滅菌綿棒を使用して脇に移動させることができ、前立腺をカバーする脂肪の薄い層を持つことになります。最小限に抑えるため、Eすべての臓器の動きや筋肉、可能な場合。
- 漏れを最小限に抑え、小さな気泡が観察さを確保し、前立腺に20μlの体積細胞溶液を注入する。
- 膀胱を交換して、簡単な中断パターンで4.0吸収性ビクリルモノフィラメント縫合糸を使用して、筋層を閉じます。
- 無菌9ミリメートルのステープルを使用して、スキン層を閉じます。
- イソフルラン麻酔から動物を削除して、目を覚まし、通常移動するまで監視します。回復期間中加熱パッド上に置きます。
- 複数の手術が行われている場合、手術の間、70％エタノールですべてのツールをきれいにし、ガラスビーズ滅菌器を用いて滅菌する。ツールは次の動物の前に完全に冷却します。縫合糸、コットンボール、または滅菌綿棒は再使用しないでください。
3。動物を監視する
- 動物施設の指示に基づいて、鎮痛薬を管理します。 1 mg / kg体重で皮下uのメロキシカムの単回投与の4時間術後投与1ミリリットルのシリンジに取り付けた30½G針を歌うには、提案され、追加の用量で、次の48時間ごとに12から24時間後に続いている。
- 傷が治癒した後のステープルは、手術後7〜10日の動物から削除することができます。
- 動物の体重、食物消費を監視し、実験終了まで、週に2回、腫瘍に対してマウスを触診。腫瘍が有意な腫瘍の負担又は強迫の下で動物をチェックする目に見えるようになるとき、一日おきまで頻度を上げる。原発腫瘍が尿流を遮断することができるように、このモデルから早期死亡は、大規模な原発腫瘍負荷によるものなので、15％を超える体重または直径1.5cmに達した原発性腫瘍の消失を持つ動物は、直ちに剖検する必要があります尿路閉塞や動物の死を防ぐ。
- 動物の環境のさらなる濃縮の必要性を監視。手術のストレスは動物の内紛を向上させます。代わりに、1と追加行動のケージあたり2プラスチック小屋の追加アル濃縮は、これらの事件を減らすことができます。動物がで収容されている施設で利用可能な獣医スタッフのオプションを使用して説明します。彼らが目を刺激することができますようにマウスのこの株にまつげの欠如を考えると、紙製の小屋と濃縮はお勧めできません。
4。剖検手順
- 4-6週間後、腫瘍が完全に明らかであり、動物が増加し、腫瘍負荷のために体重を失い始める。腫瘍は通常、触診および/または視覚的に明らかであることができます。剖検は、この時点で実行する必要があります。 1ミリリットルのシリンジに取り付けた30½ゲージの針を使用して260 mg / kg体重でネンブタールの腹腔内注射を行い、動物が無つま先反射や筋緊張の存在を完全に意識不明になることができます。
- 動物を麻酔した後、滅菌した手術用ハサミやメスを用いて、動物の側に沿って脇下に垂直にして、直接、胸郭の下で動物の胴体全体に水平にカット、心臓を露出。動物からできるだけ多くの血液を得、血液凝固を防ぐためにDPBS中の4％クエン酸ナトリウムでフラッシュした1mlシリンジに取り付けた30½Gの針を用いて末端心穿刺を行う。
- 外科ハサミやメスで気管を切断することにより動物から肺を取り出して、すぐに組織培養カセットに、10％ホルマリンに入れる。
- 個別に腫瘍に接続されているすべての血管を切断し、このような精管や精嚢などの追加の臓器を確保していないことにより、動物から原発性前立腺腫瘍を除去が付属します。
- 腫瘍の重さと大きさを記録します。実験室規模でのグラム単位での腫瘍の重量を測定する。ノギスを使用して、センチの腫瘍の最長径、対応する垂直軸の長さを測定します。腫瘍の大きさを得るために、これらの値を掛けます。使用目的に応じて、直ちに液体窒素、および/または場所でフリーズスナップ10％ホルマリンに組織カセットである。
- 外科ハサミやメスで、股関節と膝関節を露出させ、脚の関節を外して、そのまま骨を維持するように注意しながら。動物から大腿骨を削除し、滅菌生理食塩水に入れる。
- 関心のある他の臓器や資料を入手して、あなたの研究所の指示に従って動物を処分。具体的には、局所リンパ節に転移を有する傾向がある、それらを保有する場合に拡大される傾向にあり、収穫することができる。これは外科的処置によって生じる静水圧の変化によって影響を受けることができるように、しかし、注意を払うべきである。
5。肺組織サンプルの処理および免疫染色
- PBS中の10％ホルマリンに組織を置くことの24〜48時間以内に、パラフィンに肺を埋め込む。
- セクション2月3日、隣接する4μmの肺組織切片を取って45ミクロン段部での肺、。
- GFP陽性細胞は（推奨）を使用した場合、免疫染色を行うGFPについて。そうでない場合、標準的なヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）染色を行う。
NOTE：InvitrogenのGFP抗体と組み合わせたダコエンビジョン+キットは、製造業者の説明書に従って成功裏に使用されてきたが、これは、任意の免疫組織化学的手順に変更することができる。
- 盲検法で転移をスコア。 GFP陽性の場合、腫瘍細胞は大きく、独特の核を有することに加えて褐色染色する。第一のスコアリング時転移、正確なスコアリングを確保し、腫瘍細胞の存在を確認するために、H＆E染色した肺組織を使用するために病理学者に相談して、免疫細胞の浸潤はない。
6。血と骨髄から循環腫瘍細胞の同定
- 1.5ミリリットルの遠心分離管に剖検から収集されたすべての血液を追加します。 800×gで5分間遠心。
- 血漿を除去し、1mlのACK溶解バッファーを追加（154.95 mMの塩化アンモニウム、9.99 mMのカリウムBicarboネイト、0.0995のEDTA、）。血液は室温3〜5分で座ることができます。
- 800×gで5分間遠心。
- 上清を除去し、抗生物質を含む細胞培養培地の1ミリリットルを加える。細胞培養培地の9ミリリットルを含むT75フラスコにセルを追加。
- 2-3日ごとにCTCの存在をチェックする、10日間の5％CO 2を含む加湿雰囲気中で37℃で培養細胞。
- 骨髄では、はさみ、かみそりの刃、またはメスを用いて大腿骨からすべての筋肉組織を削除します。できるだけ両端近くに、骨の末端を削除します。
- 23¾G針を使用して、穏やかに1.5ミリリットルの遠心管に大腿骨から骨髄を取り出す。
- 細胞培養培地1mlに加え、穏やかに混合するためによくピペット。
- 細胞培養培地の9ミリリットルを含むT75フラスコにセルを追加。
7。腫瘍の分子特性
- ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）アッセイのためのsは、液体窒素中で急速凍結した腫瘍試料は、第1のドライアイス上で粉砕し、次いで1ミリリットルのTRIzolに3〜5分間、組織ホモジナイザーを用いてホモジナイズする。トリゾール抽出は、製造者の指示に従って行われる。製造業者の説明書に従ってをRNeasy RNA単離キットを用いてRNAを精製する。製造業者の指示に従ってたTaqMan試薬を用いてcDNA合成および定量的リアルタイムPCR（定量RT / PCR）を行うことが推奨され、現在使用される任意のPCR法に変更することができる。
- 、PBS（137mMのNaCl、10mMのリン酸Na、2.7mMのKCl）、0.5％トリトンX-100、1mMのEDTA：ウェスタンブロットアッセイのために、溶解緩衝液1mlで3〜5分間、組織ホモジナイザーを用いて組織をホモジナイズ2.5mMのピロリン酸ナトリウム、プロテアーゼインヒビターカクテル、リン阻害剤カクテル2および3、10mMのフッ化ナトリウム、および1mMのオルトバナジン酸ナトリウムを添加して1mMのβ-グリセロリン酸、。細胞溶解混合物を1.5 mlの遠心管に入れる。
- セント13,000×gで10分間rifuge細胞溶解物。
- 新しい1.5 ml遠心チューブに上清と場所を削除し、13,000×gで10分間再度遠心分離した。細胞の破片がまだ存在する場合、追加の遠心分離工程を行うことができる。
- 上清を除去し、通常の実験室条件に従ってウエスタンブロットを行う。
Representative Results
この実験のために、我々は、これらの外科的手順の間に得られたマウスの代表的なグループを示す。五匹のマウスは、対照ベクターを含有するGFP陽性PC3-M細胞を移植した。腫瘍は6週間増殖させた後、複数のパラメータを評価した。 図1Aおよび1Bには、それぞれ、体重およびマウスの飼料消費の変化を示す。麻酔による手術日の周りの体重及び摂餌量の小さなディップがあります。実験期間中、体重は徐々に手術後に増加し、その後腫瘍量が臨界レベルに達すると、実験の終わりに向かって減少し始める。これは、これらのマウスでの食物消費にマッチしている。
図2Aおよび2Bに、得られた代表的な腫瘍サイズが示されている。個々の腫瘍の大きさはさまざまですが、平均的に、我々は、約1グラムの腫瘍を達成した0.5〜1.5グラム、0.5〜1.5 cm 2の正常分散を有する1cm 2での腫瘍の大きさとの間の通常の分散。腫瘍の大きさは異なるが、これらは本論文では、我々の以前に出版された作品10の両方に示し、得られた転移の数と相関しない。しかしながら、このモデルから、人は薬物治療または腫瘍重量とサイズ上の分子変化の効果を決定することができる。実験のための適切なエンドポイントである場合、このモデルにおける重要な考慮事項である。 図2Cおよび2Dに、我々は、安定して4週目にGFPおよびコントロールベクターでトランスフェクトされた一つの特定のPC3-M細胞株および6週間における腫瘍重量および腫瘍サイズの変化を示す。最後の2週間で、平均腫瘍重量が2.7倍に増加し、腫瘍の大きさ1.9倍。これは実験上の1〜2週間余分の添加が劇的に結果に影響を与えることができます示しています。多数の要因には、腫瘍の成長を変化させることができるように目に見える腫瘍は大部分のマウスで観察されるまで、年齢やその他のマウスの大きさ、細胞の継代数は、我々は実験を終了しないことをお勧めします。
図3A〜3Cに、転移の数は、3つの異なる方法で定量化される。 図3Aに、GFP陽性のヒトのPCa細胞の総数を表現している。 図3Bにおいて、細胞遺伝子座、または転移性沈着物が存在する位置の数は、示されている。最後に、 図3Cに、別個の転移の数は、5個以上のGFP-陽性ヒトPCaの細胞を示す細胞の明らかに結合した基によって定義されるように、表示されている。これらの異なる条件の代表的な写真を図4A〜4Dに示されている。 図4Aでは、40倍の大きにおける個々の細胞を矢印で強調表示されます。茶色の染色、大きな明確な核を注意してください。 H＆E染色を用いて染色し、隣接する肺切片GFPことなく、癌細胞の検出は依然として容易に達成可能であることを確認し、 図4Bに示されている。この写真は40倍の大きさに取られ、セルが矢印で強調表示されます。 図4Cに、10倍の大きさに細胞数を変化させるいくつかの軌跡が表示され、各遺伝子座は、矢印で強調した。 。最後に、 図4Dに、10細胞の転移のデポジットが示されている。これらのメソッドはどのように影響するかのデータは、マウス1およびマウス3の違いによって示されている。マウス1は、肺切片当たり700セルの平均を持っているマウス3と比較して、肺切片あたり21.5セルの平均で、肺の中の全細胞数の減少がある。しかし、マウス3は、より少ない遺伝子座、あるいは細胞は、マウス1よりも存在している場所があります。マウス3は、転移の比較的少ない部位を有するが、面積あたりの細胞数は、いくつかの非常に多くの細胞数への転移に起因する遺伝子座あたり82個の細胞で非常に高い。これとは対照的に、マウス1は、より多くのユニークな遺伝子座を持っていますが、かなりF場所ごとに2つのセルの平均値のみで場所ごとの水差し細胞。これらの異なるパラメータは、肺と成長し、増殖し始めるする能力に人身売買細胞の動態に光を当てることができます。
また、 図3Dに、我々は4 6に対して週で剖検したマウスの肺あたりの総転移性細胞の変化を示す。 図2Cおよび2Dで説明したように、有意な変化は、実験の最後の2週間で腫瘍重量およびサイズにおいて観察される。これは、 図3Dにで要約されている。 6週間目のマウスは、評価した全てのマウスにおいて転移性細胞を示した四週間で剖検したマウスは、転移性のない現像を示さなかった。これにより、マウスの剖検が転移の形成が生じていることを確認するために、後期エンドポイントで実行されて確保することの重要性を示しています。
このモデルで追加された測定値は、内部で発生する分子の変化である原発腫瘍。 図5A〜5Cに、我々は3つの例示定量RT / PCR実験は、転移進行中の目的の3つの遺伝子の測定を示し、マトリックスメタロプロテアーゼ2型（MMP-2）、マトリックスメタロプロテアーゼ9型（MMP-9）、及び熱ショックタンパク質27（HSP27）それぞれ。定量RT / PCRを介して測定された関心対象の任意の遺伝子は、この技法を用いて検出することができる。さらに、タンパク質レベルは、ウェスタンブロット手順を用いて定量化することができる。
図1。 ）動物の体重及び摂餌量の観測された。AB）体重グラム、またはグラムでの一日あたりのマウスあたりの平均摂餌量、実験を通して記録され、Aに示されている）とB、それぞれ。
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図2。個々のマウスの群における腫瘍サイズと腫瘍重量。 AB）腫瘍重量はグラムおよび腫瘍サイズはcm表記に5代表的なコントロールマウスの二乗6週間の終わりに5匹のマウスの平均値をAに示されている）及びB）それぞれCD）グラムにおける腫瘍重量の比較マウスの群間の二乗センチの腫瘍の大きさは4と6週目に剖検。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。
図3。個々のマウスのグループで転移拡散。 AC）平均転移性sprea肺の5つの個別のマウスのためのセクションとセル（A）の総数のいずれかとして表される六週間、転移性細胞（B）の位置、又は別個の転移の終わりに5匹のマウスの平均当たり5 + dの中の細胞によって定義される明確に定義されたクラスタ（C）D）の 4および6週目に剖検したマウスとの間にマウス当たりの肺切片あたり転移性細胞の平均数を比較する。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。
図4。肺転移の代表的な画像。 A）40Xの目的で、個々のGFP陽性肺細胞を矢印で強調表示されます。、B）は 、隣接する肺H＆E染色の下で同じセルを示すAから区間）、。、C）は、細胞の様々な数字を含む7個々の遺伝子座で10倍の対物レンズでの1肺切片。D）に明確に一つのグループとして定義されている10の癌細胞を含む10X客観的に1つの異なる転移。
図5。関心対象の三転移性遺伝子のPCR分析。定量RT / PCRは、6週目にマウスから採取した個々の腫瘍試料について実施した。 MMP-2（A）、MMP-9（B）、およびHSP27（C）の相対的なmRNA転写レベルは、GAPDHに正規化して測定されています。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。
Discussion
本論文では、人間のPCa転移の新規マウスモデルを提供します。このモデルでは、ヒトのPCa細胞株PC3-Mは、同所4〜6週間発育させたBALB / c胸腺欠損マウスの前立腺腫瘍内に直接注入される。代表的な結果のセクションでは、我々は、マウスの体重および摂餌量、腫瘍サイズおよび体重、腫瘍の分子特性、および肺への明確な転移の形成を含む収集することができるデータの例を示す。さらに、追加の出力多種多様な特定の研究の興味に応じ研究することができる。一例は、血液および骨髄へのCTCの存在である。 CTCのは比較的まれな事象（我々は対照動物の約5から20までパーセントでのCTCを観察）であるように、我々はこれらの実験では5匹のマウスのいずれものCTCを開発していないことに驚いていなかった。私たちの研究室でも、核細胞形態を測定することにより、細胞接着の変化を決定するために、このモデルを使用しています前立腺組織10。我々はまた、前立腺腫瘍の14 Ki67およびTUNEL染色を用いて、原発腫瘍増殖およびアポトーシス状態を評価するために、このモデルを使用している。
得られるデータ出力の多種多様に加えて、このモデルは、両方のタンパク質発現の変化、ならびに小分子治療の効果を決定するために使用することができる。人間のPCa転移の多くの自発的および誘導のモデルと比較すると、唯一の4〜6週間の高いターンアラウンドタイムがあります。このような尾静脈またはintercardiacインジェクションモデルとして高いターンアラウンドタイムを持つ他のモデルは、このように完全にクリニック転移カスケードをrecapitulatingていない、ない、原発腫瘍の制限があります。我々のモデルでは、腫瘍細胞は、起源の原発部位から逃れる循環系に入り、生き残り、セカンダリサイトへのインプラントなければなりません。これは、タンパク質発現における治療的介入または変更を有効に提供できるれる追加の手順が用意されています。 ADDItionally、原発腫瘍の存在は、ルシフェラーゼベースのIVIS 16〜17などの新しいイメージング技術へのこのモデルの容易な適用を可能にする必要があります。
このモデルの利点は、様々にもかかわらず、考慮すべきいくつかの制限もあります。研究数の増加は、腫瘍微小環境および転移18の開発における免疫系の重要性を示している。胸腺欠損齧歯類の使用に起因するこのモデルでは、免疫系の効果を評価する能力は不可能である。第二の制限は、PC3-M細胞におけるアンドロゲン応答性の欠如である。 PCaの初期診断時に、患者はしばしば一次治療としてアンドロゲン療法を受ける。しかし、患者は最終的にはアンドロゲン性になり、腫瘍が再び成長し始めます。 PC3-M細胞はアンドロゲン受容体を欠いているように、このモデルは、ポストアンドロゲン耐性はc薬物治療タンパク質又は変調の影響を測定するアンサー。これが限界ですが、アンドロゲン応答性PCAは、現在十分に管理可能であり、効果的な治療法のさまざまなオプションを持っているため、アンドロゲン耐性癌を研究し、より目立つようになっています。このモデルはまた、特に、マウスの変動にマウスを最小限に抑えることがマウスの近交系を、使用しています。しかし、この株は、診療所にこのデータを外挿するときに、したがって注意を払うべきである、特定のタンパク質または小分子に特に応答することができる。
このモデルは4〜6週間の迅速なターンアラウンドタイムで薬効の効果的な測定を提供するが、これを考慮に影響を投与、長期的な薬を服用しないことがあります。多くの現在利用可能な治療に長時間さらされた後、患者が薬剤耐性癌に何年も治療後を返すことがあります。この技術の急速なターンアラウンドは、治療に抵抗性になる腫瘍の能力を効果的にモデル化することはできません。しかし、このEXの調整にperiment、治療抵抗性ヒト前立腺癌細胞を移植することができる、とのPCa腫瘍増殖および転移を予防するのに第二世代の治療の有効性はモデル化することができる。グループが時間をかけて、原発腫瘍の分子変化を研究しようとしていた場合にはさらに、このようなTRAMPモデルとして長期的なモデルは、おそらくこれらの研究のためのより効果的であろう。
このモデルのもう一つの制限は、リンパ節および動物の肺への転移の別個の普及である。ヒト暖かい解剖研究19によって示されるように、これらのサイトの両方が、転移の頻繁かつ臨床的に関連する部位である。しかしながら、臨床的に骨転移は、ヒトのPCaの顕著な特徴を構成しており、従ってこれをrecapitulatingモデルが重要である。残念ながら、これらは、尾静脈、intercardial注射、又は、直接注入せず、骨転移を示す非常に少数のモデルを、マウスモデルで再現するのが困難である骨20。骨への標的化キーの実験に重要である場合にはこのように、別のモデルは、より効果的であり得る。しかし、このモデルは、循環腫瘍細胞を骨髄の形態の骨へのトラフィックのいくつかの尺度を提供します。
これらの制限にもかかわらず、この技術は、人間のPCA強力なモデルである。短いターンアラウンドタイムで、原発腫瘍だけでなく、転移性形成の両方に効果を測定する能力は、多種多様なアプリケーションを提供しています。このモデルでは、細胞は、原発臓器をエスケープ入り、血流の中で生き残る、セカンダリサイトでのインプラント、ヒトでのプロセスをrecapitulating必要があります。付加的な原発腫瘍の分子特性の測定、細胞形態の変化、循環腫瘍細胞の存在は、一つのモデルからの情報の様息を提供する。この手順では、薬物発見の文脈において、ならびに腫瘍生物学の変化を研究するための両方に使用することができる。
Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、RCB、CA122985前立腺SPORE CA90386に、そしてJMP、NIH T32 AG000260「加齢性疾患における創薬研修」を、とウォルターS.とルシアンで国立衛生研究所（NIH）からの補助金によって支えられてノースウェスタン大学の生命科学におけるドリスキル大学院プログラム。我々はまた、ノースウェスタン大学のマウス表現型と組織学研究所病理基盤施設に感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 1 ml Syringe, Tuberculin, Slip-Tip | Becton Dickinson | 309659 | |
| 23 G 3/4 Precison Glide Needle | Becton Dickinson | 305143 | |
| 30 G 1/2 Precision Glide Needle | Becton Dickinson | 305106 | |
| Alcohol Wipes | Triad | 10-3001 | |
| Autoclip Applier, 9mm, Stainless Steel | Becton Dickinson | 427630 | |
| Clips, 9mm | VWR | 15431-673 | |
| Convertors Polyline Towel (Sterile) | Cardinal Health | 3520 | |
| Cotton-Tipped Applicators, 6 inch, Sterile, Wooden Shaft | Fisher | 23-400-125 | |
| Curad Sterile Cotton Balls | VWR | 500043-544 | |
| Derf Needle Holder, Integra Miltex, 121 mm (4 3/4") | VWR | 95039-192 | |
| Duraprene SMT Sterile Neoprene Powder-Free Surgical Gloves | Cardinal Health | 2D72PN70 | |
| Germinator 500 | Cell Point Scientific | SN 7030 | |
| Kendall Monojet Needles, 1/2 cc syringe with permanent 28 G 1/2 needle | Tyco | 1180528012 | |
| Medium Heating Pad | VWR | 100229-094 | |
| Merit Iris Scissors, Sklar, 11.4 cm (4 1/2") | VWR | 94000-000 | |
| Metric/English Vernier Caliper | VWR | 19155-057 | |
| PDS*11 Violet Monofilament Sutcher 4-0, 27" | Ethicon | Z304H | |
| VetEquip Inhalation Anesthesia System | Contact Your Animal Facility for Availability | ||
| VWR Premium Tissue Cassettes | VWR | 18000-010 | |
| VWR Specimen Forceps, Serrated, Straight, 114 mm (4 1/2") | VWR | 82027-440 | |
| Reagents | |||
| Betadine Surgical Scrub | Fisher Healthcare | 19-027132 | |
| Buprenex | Controlled Substance - Obtain from Animal Facility | ||
| Dako DAB + Chromagen | Dako | K3468 | |
| Dako Envision + System HRP-Labeled Polymer, Anti-Rabbit | Dako | K4003 | |
| Dako Envision Kit Protein Block | Dako | X0909 | |
| Formalin | VWR | 95042-908 | |
| GFP Antibody | Invitrogen | A11122 | |
| Hematoxylin | Mayer | MH580-2.5L | |
| Meloxican | Obtain from Animal Facility | ||
| Nembutal | Controlled Substance - Obtain from Animal Facility | ||
| Rneasy RNA Isolation Kit | Qiagen | 74104 | |
| Sterile Saline | Obtain from Animal Facility | ||
| Taqman Reverse Transcription Reagents | Life Technologies | N8080234 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4304437 | |
| Trizol | Invitrogen | 10296 | |
References
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