Summary
מודל orthotopic זה של סרטן הערמונית אנושי מאפשר כימות של גודל גידול, תאים סרטניים במחזור, והיווצרות של גרורות שונות לריאות. ככל שתאים חייבים לברוח האיבר העיקרי, להזין את זרם הדם, ולהשתיל לאתר משניים, מודל זה ביעילות משחזר את התרחיש בבני אדם.
Abstract
המעבדה שלנו פיתחה מודל השתלת orthotopic רומן של סרטן הערמונית האנושי (PCA). כמוות PCA לא בשל הגידול הראשוני, אלא היווצרות של גרורות שונות, את היכולת למודל יעיל התקדמות זה מראש מבחינה קלינית היא בעלי ערך גבוה. במודל זה, תאים מושתלים ישירות לאונת הגחון של הערמונית בBALB / ג athymic עכברים, ואפשרו להתקדם ל4-6 שבועות. בסיום ניסוי, ניתן למדוד כמה נקודות קצה שונות, כגון גודל ואפיון מולקולרי של הגידול הראשוני, הנוכחות והכימות של מחזורי תאים סרטניים בדם ומח עצם, והיווצרות של גרורות לריאות. בנוסף למגוון רחב של נקודות קצה, מודל זה מספק תמונה של יכולת תאים לפלוש ולברוח האיבר העיקרי, הזן ולשרוד במערכת הדם, ושתל ולגדול באתר המשני. דגם זה נעשה שימוש יעיל למדוד גרורתיתגובה לשני השינויים בביטוי חלבונים, כמו גם לתגובה לתרופות מולקולה קטנות, בזמן אספקה קצר.
Introduction
סרטן הערמונית (PCA) הוא הסרטן הנפוץ ביותר שאובחן אצל גברים, והסיבה המובילה השניה למוות מהסרטן בארצות הברית 1. מוות מPCA הוא לא עקב היווצרות של הגידול הראשוני, אלא היווצרות של גרורות. לכן, מניעה של גרורות בחולים היא בעל חשיבות גבוהה. מודלים עכבר של PCA מציעים מגוון של אפשרויות כדי לחשוף מידע ביולוגי ביקורתי על מחלה זו.
מגוון רחב של דגמי עכבר של PCA קיים, כל אחד עם יתרונות ומגבלות מובנות. בעוד התדירות של PCA בבני האדם היא גבוהה, PCA טבעית היא נדירה מאוד בעכברים 2, למרות רגישות שווה של עכברים הכוללים לסרטן 3. חריג מכרסם אחד הוא הפיתוח של PCA בחולדות Lobund Wistar, אשר יכול להשיג שיעורים של PCA של 90% על ידי 12 חודשים של גיל באמצעות אינדוקציה של methylnitrosourea וטסטוסטרון 4. מסיבה זו, הנגרם על מערכות מודל, כמו הנווד(אדנוקרצינומה המהונדס של ערמונית העכבר) המודל נמצאת בשימוש נפוץ. מודל הנווד יכול לגרום לביטוי transgene במיוחד בערמונית, ועובר את ההתקדמות הנורמלית של PCA, מהיפרפלזיה לneoplasia intraepithelial ערמונית (PIN) לימפטי וגרורות ריאתי 5-6. מודלים אלה מספקים את היתרונות של להיות מסוגל למדוד את הטווח המלא של התקדמות גידול, כמו גם להכיל את מערכת חיסונית ללא פגע. עם זאת, האירועים המולקולריים שבבסיס פיתוח PCA יכולים להשתנות בין עכברים ובני האדם, ומתאמים בין עכברים ומחקרים קליניים בבני אדם הראו השתנות. בנוסף, שני הדגמים האלה הם זמן רב, כדוגמא מודל הנווד דורש כ 28 שבועות על מנת לפתח גרורות.
בחקר גרורות, משמש לעתים קרובות מודל הזרקת חדר זנב וריד או שמאל. מודל זה נהנה מזמן אספקה מהיר, ובנוסף ניתן למדוד את הנוכחות של metastas העצםהוא באמצעות שורות תאים ספציפיות ותנאים. יאנג et al. דיווחו כי הזרקה תת עורית של תאי PC3-GFP החיובי יכולה לגרום לתפוצה רחבה גרורות בעצמות 7, וגם וריד זנב וזריקות intercardiac יצרו פיתוח גרורות בעצמות 8-9. המגבלות העיקריות של מודלים אלה מתייחסים לחוסר גידול ראשוני המתגורר בתוך בלוטת הערמונית עצמו. יתר על כן, למודלים נשענים על הזרקה של תאים סרטניים למחזור הדם, זה עוקף את המחצית הראשונה כולה של המפל גרורתי. זה ובכך מונע בדיקה של צעדים ראשונים, כוללים פלישה דרך האיבר העיקרי, שהן מבחינה ביולוגית אמצעים חיוניים של שינוי גרורתי. רגולטורים של שינוי גרורתי רבים משפיעים ישירות על פלישת תאים מוקדמת. שלבים מוקדמים במפל גרורתי מהווים אתרי עדיפות גבוהים למיקוד טיפולי, כמו פעם תאים סרטניים להפיץ, וריאציה משובט מרחיבה באופן משמעותי, ובכך להגדיל ביולוגיגיוון אל וצמצום מיקוד טיפולי יעיל.
בניסיון לתת מענה לרבים מהמגבלות של המודלים האלה, המעבדה שלנו פיתחה מודל orthotopic של PCA האנושית שבה שורת תאי PCA PC3-M אדם מושתלת ישירות לתוך הערמונית של BALB / ג athymic עכברים. אחרי 4-6 שבועות, גודל גידול, נוכחותם של תאים סרטניים במחזור (CTCs), וגרורות לריאות ובלוטות לימפה יכולים להיות כל כימות. יש לנו להשתמש ביעילות במודל זה כדי להעריך את היעילות של 4 ',5,7-trihydroxyisoflavone (גניסטאין) לעכב גרורות PCA אדם 10. הצריכה תזונתית של גניסטאין נקשרה לירידה בגרורות סרטן ערמונית ולמוות 11-12, אבל קודם לכן אין מחקר שקבע אם ניהול של גניסטאין יכול לשנות גרורות PCA בבעלי חיים או בני אדם. במחקר זה הראינו כי טיפול עם גניסטאין הקטין את מספר גרורות ריאות באופן משמעותי. בנוסף, קבענו אל גניסטאיןחזר אחורנית ההפעלה וביטוי של מספר חלבונים חשובים פרו גרורתי בגידול הראשוני, כוללים קינאז מוקד הידבקות (FAK), קינאז p38 מופעל mitogen החלבון (MAPK p38), וחלבון חום הלם 27 (HSP27).
תוצאות אלו תואם עם תצפיות במרפאת. באמצעות דם שהתקבל מהעכברים, שהיינו מסוגל למדוד במדויק את הריכוזים של גניסטאין הדם ונצפיתי האלה כדי להיות דומים לרמות בבני אדם עם הצריכה תזונתית רגילה של גניסטאין. בנוסף, מחקר השלב השני מבוצע על ידי הקבוצה שלנו קבע כי על טיפול עם גניסטאין, גברים חווים ירידה בביטוי mRNA רקמת ערמונית של גנים הקשורים לפלישה גרורה סלולריים, במיוחד מטריקס פרוטאינאז סוג 2 (MMP-2) 13.
יש לנו גם השתמשתי במודל זה כדי להעריך את ההשפעה של ביטוי גנים, מוצר הוא שינה בגידול הראשוני בגרורות PCA אדם 14. Suppr הגידולendoglin essor הוא חבר של superfamily TGFβ ומדכא פלישה סלולרית PCA אדם במבחנה באמצעות שינוי של סמאד איתות 15. אנחנו הרחבנו את המחקרים הללו כדי לקבוע את ההשפעה של endoglin על גרורות PCA אנושיות. מציאה endoglin יציבה, בקרת וקטור או endoglin על שורות תאי ביטוי הושתלה לעכברים. תאי מציאה Endoglin הראו את המספר הגבוה ביותר של גרורות ריאות, כמו גם CTCs ב38% מהעכברים. עכברים מושתלים עם וקטור ביקורת הראו תגובה בינונית, עם פחות גרורות ריאות לכל עכבר, וCTCs ב18% בלבד מעכברים. עכברי endoglin גבוה מושתלים הראו דיכוי כמעט מוחלט של גרורות ריאות, ודיכוי של CTCs מלא.
אלו הן רק שתי דוגמאות למגוון הרחב של יישומים לטכניקה זו. מגילוי תרופות, לשינויי מודלים של ביולוגיה מולקולרית, מודל זה מציע שיטת תפוקה גבוהה של הערכת ההשפעות של פונקציות שונות על גידול ושומהשינויי cular, נוכחות של CTCs, והיווצרות של גרורות שונות בצומת הריאות והלימפה.
Protocol
לכל ההליכים כרוכים בבעלי חיים, פרוטוקולים אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים ושימוש המוסדית (IACUC) באוניברסיטת נורת'ווסטרן. טכניקות ניתוחיות ותנאי טיפול בבעלי החיים נצפו על ידי צוות וטרינרים ושונים כדי למזער את הלחץ של בעלי חיים או התמותה. ייתכן שיש מוסדות בודדים דרישות שונות וזה חשוב לעבוד עם צוות IACUC ובעלי החיים בעת פיתוח וביצוע טכניקה ניתוחית זו.
1. הכנת תאים להזרקה
- צעד זה צריך להתבצע קרוב ככל האפשר למתחיל ניתוחים. Trypsinize תאים המשמשים לניסוי, מורידים מצלחת, ולנטרל עם תקשורת. שורת PC3-M אדם PCA תא יציבות transfected עם GFP שמשה בהצלחה בניסויים אלה, בשל תנאי גידול מהירים של תאי PC3-M. GFP נוספו על מנת להקל נוסף של זיהוי של גרורות ריאות בדגימות רקמת ריאה, ונחישות מהירה שלתאים סרטניים לעומת תאים חיסוניים בתרבויות המתקבלים מהדם ומח עצם כדי לזהות תאים סרטניים במחזור. אם שינוי גנטי ספציפית של עניין, ולאחר מכן יצירת שורות תאי יציבות עם שינוי גנטי זה מבוצעת ראשון, ואחרי transfection עם ה-GFP. אם ה-GFP תהיה לשנות את תפקודו של גן זה של עניין, ניתן להשמיט GFP אותו. זה יהפוך את זיהוי של גרורות ריאות קשה יותר, אבל עדיין בר השגה. בנוסף, אם באמצעות טכנולוגיית הדמיה ספציפית באמצעות סמני ניאון, כגון IVIS מבוסס לוציפראז, ניתן להשתמש בחלבונים ניאון אחרים במקום.
- צנטריפוגה במשך 5 דקות ב225 x גרם.
- לבודד 2.5 x 10 5 תאים, ו צנטריפוגות במשך 5 דקות ב225 x גרם.
- הסר supernatant ותאי resuspend ב 20 μl של תמיסת מלח סטרילית.
- ההשעיה תא לשאוב לתוך מזרק 0.5 מיליליטר עם 28 קבועים ½ מחט G (מומלצת: קנדל Monojet, כמו מותגים אחרים שגרמו לבעיות), מה שמבטיח אוויר לא נכנסה לאל המחטאונג עם ההשעיה.
- לעטוף את המזרק בנייר סטרילי ולאחסן על קרח עד שימוש.
2. ההשרשה orthotopic של אדם תאי סרטן הערמונית
- / ג athymic עכברי BALB 6-8 בשבוע בן זכר משמשים. משקל גוף העכבר האידיאלי לניתוח הוא 19-21 גרם, ויש לאפשר לעכברים לגדול לפחות 18 גרם לפני הניתוח. בעלי חיים קטנים יותר מבחינה טכנית יותר קשה לתפעול ב. בעלי חיים גדולים יותר נוטים לחוות קינטיקה איטית יותר של גידול וגרור. בעלי חיים צריכים להיות שוכנו במתקן בעלי החיים לפחות שבוע לפני ניתוח כדי למזער את הלחץ של בעלי חיים. בהתאם לעיצוב ניסיוני, טיפול תרופתי עשוי להתחיל שבוע לפני הניתוח.
- להזריק תרופות לשיכוך כאבים לפני ניתוח על פי הוראותיו של מתקן לבעלי החיים. Buprenex תת עורית 0.1 מ"ג / קילוגרם משקל גוף באמצעות מחט 30 ½ G מצורפת מזרק 1 מיליליטר הוא הציע.
- הנח חיות לתוך תא isoflurane ולחכות עד שבעלי חיים הם באופן מלאnesthetized. לא רפלקס הבוהן של טונוס שרירים צריך להיות נוכח בשלב זה. שיטה זו מומלצת, אבל אם אינה זמינה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות של הרדמה על פי הנחיותיו של מתקן לבעלי החיים.
- להעביר בעלי חיים מתוך חדר isoflurane למכסת מנוע הליך סטרילי. הנח בעל חיים לתוך מנגנון חרטומו, ומחדש להבטיח חיים שהם תחת הרדמה מלאה לפני שתמשיכו.
- לחטא את אזור בטן תחתון עם פולידין לשפשף עם כדורי צמר גפן סטרילי, לנגב עם אלכוהול לנגב, וספריי סופיים עם תמיסת פולידין. לאפשר לו להתייבש.
- או באמצעות אזמל סטרילי או מספריים כירורגיות סטריליות חידדו, חתך בבטן קו האמצע נמוך של כ 3-4 מ"מ הוא עשה. רם בעדינות את שלפוחית השתן באמצעות מלקחיים ולזהות את אונת הגחון של הערמונית. שתי אונות אלה ממוקמות ישירות מתחת לשלפוחית השתן. עכברים מסוימים יש שכבה קטנה של שומן המכסה את הערמונית אשר ניתן להעביר בעדינות הצידה באמצעות מקלון צמר גפן סטרילי. Minimizדואר בכל התנועה של איברים והשרירים במידת האפשר.
- הזרק 20 פתרון נפח תא ul לתוך בלוטת הערמונית, מזעור זליגה והבטחת בועה קטנה הוא ציין.
- החלף שלפוחית השתן וסוגר את שכבת השריר באמצעות 4.0 תפרי monofilament vicryl נספגים בדפוס שהופסק פשוט.
- סגור את שכבת העור באמצעות סיכות 9 מ"מ סטרילי.
- הסר את בעלי החיים מההרדמה isoflurane ולפקח עד ער ונע בדרך כלל. מניחים על כרית חימום במהלך תקופת החלמה.
- אם ניתוחים רבים הן מתבצעים, בין ניתוחים, לנקות את כל הכלים עם 70% אתנול, ולעקר באמצעות מעקר חרוז זכוכית. לאפשר כלים לצינון מלא לפני החיה הבאה. אל תעשה שימוש חוזר תפרים, כדורי צמר גפן, או מטליות סטרילי.
3. ניטור בעלי חיים
- לנהל משככי כאבים הבוסס על הוראותיו של מתקן לבעלי החיים. מתן תרופה לאחר ניתוח 4 שעות של מנה אחת של Meloxicam תת עורית במ"ג / קילוגרם משקל גוף 1 uלשיר מחט 30 ½ G מצורפת מזרק 1 מיליליטר הוא הציע, ואחריו מנה נוספת בכל שעה 12-24 לשעה 48 הבאה.
- סטייפלס ניתן להסיר מבעלי החיים 7-10 ימים לאחר ניתוח ברגע שהפצע נרפא.
- לעקוב אחר המשקל של בעלי חיים, צריכת מזון, ולמשש עכברים לגידולים פעמיים בשבוע עד לסיומו של ניסוי. להגדיל את התדירות עד בכל יום אחר, כאשר הגידולים להיות גלויים כדי לבדוק לבעלי חיים תחת נטל גידול משמעותי או כפייה. מוות מוקדם ממודל זה נובע מניטל הגידול הראשוני הגדול, כמו גידולים ראשוניים יכולים לחסום את זרימת שתן, כך שכל בעלי חיים בהפסד של יותר מ 15% במשקל גוף או גידול ראשוני מגיע בקוטר של סנטימטר 1.5 צריכים בדיקה שלאחר מוות באופן מיידי כדי למנוע חסימת שתן ולמוות של בעלי חיים.
- לפקח על צורך בהעשרה נוספת של סביבת בעלי החיים. הלחץ של ניתוח מגביר את המאבקים פנימיים של בעלי חיים. התוספת של שתי בקתות פלסטיק לכל כלוב במקום אחד והתנהגות נוספתהעשרת אל יכול להקטין תקריות אלה. לדון עם אפשרויות צוות וטרינרים זמינות במתקן בעלי החיים הם שוכנו ב. בהתחשב בחוסר ריסים בזן זה של עכברים, בקתות והעשרה עשויה מנייר אינן מומלצים כפי שהם יכולים לגרות את העיניים.
4. נהלי נתיחה לאחר מוות
- אחרי 4-6 שבועות, גידולים ניכרים באופן מלא ובעלי החיים מתחילים לרדת במשקל בשל נטל גידול מוגבר. בדרך כלל ניתן מיששו גידולים ו / או מבחינה ויזואלית נראות לעין. נתיחה לאחר מוות יש לבצע בשלב זה. לבצע זריקת intraperitoneal הנמבוטאל ב260 מ"ג / קילוגרם משקל גוף באמצעות מחט מד 30 ½ מצורפת מזרק 1 מיליליטר, ולאפשר לבעלי החיים הפכו למודעים באופן מלא, ללא רפלקס הבוהן או בהווה טונוס שרירים.
- ברגע שבעל החיים הוא מורדם, באמצעות מספריים כירורגיות סטריליות או אזמל, לחתוך בצורה אופקית על פני גופו של בעל החיים מתחת לכלוב הצלעות באופן ישיר, ואז במאונך לבית השחי בצד של בעלי החיים, לחשוף את הלב. בצע לנקב לב מסוף באמצעות מחט 30 ½ G מצורפת מזרק 1 מיליליטר סמוק עם 4% ציטרט הנתרן בDPBS כדי למנוע קרישה, השגת כמה שיותר דם ככל האפשר מבעלי החיים.
- הסר את הריאות מבעלי החיים על ידי חיתוך קנה הנשימה עם מספריים כירורגיות או אזמל ואת המקום באופן מיידי לקלטת תרבית רקמה ולפורמלין 10%.
- הסר את הגידול בערמונית העיקרי מבעלי החיים על ידי בנפרד חיתוך כל כלי דם מחוברים לגידול והבטחה אין איברים נוספים כגון זרע הזרע או שלפוחית זרע מחוברים.
- רשום את המשקל והגודל של הגידול. מדוד את המשקל של הגידול בגרם בקנה מידה מעבדתי. באמצעות מחוגה, למדוד את האורך של הקוטר הארוך ביותר של הגידול בסנטימטרים, וציר המאונך המקביל. הכפל את הערכים הללו כדי להשיג גודל גידול. בהתאם לשימוש מיועד, לצלם מייד הקפאה בחנקן, ו / או מקום נוזליים בלקלטת רקמה לתוך פורמלין 10%.
- לחשוף את מפרקי ירך והברך במספריים כירורגית או אזמל, ומפרקי רגל ניתוק, להיות זהיר כדי לשמור על עצם הירך בשלמותה. הסר את עצמות הירך מבעלי החיים ומקום לתוך תמיסת מלח סטרילית.
- להשיג כל איברים או חומרים של עניין אחרים, ולהיפטר מבעלי החיים על פי ההוראות של המכון שלך. בפרט, בלוטות לימפה אזוריות נוטות להיות בעלי גרורות, נוטות להיות מוגדלים אם מחסה אותם, ויכולות להיות שנקטפו. עם זאת, יש להיזהר כמו זה יכול להיות מושפע משינויים בלחץ ההידרוסטטי שנגרמו על ידי ההליך כירורגי.
5. עיבוד וImmunostaining של דגימות רקמת ריאה
- בתוך 24-48 שעה של הנחת רקמה לתוך פורמלין 10% ב-PBS, להטביע את הריאות לפרפין.
- סעיף הריאות ב45 מיקרומטר סעיפי צעד, לוקחים 2-3 4 מיקרומטר חלקי רקמת ריאה סמוכים.
- אם תאי ה-GFP החיובי שימשו (מומלץ), לבצע immunostainingעבור ה-GFP. אם לא, לבצע Hematoxylin סטנדרטי ומכתים eosin (H & E).
הערה: ערכת Dako Envision + בשילוב עם נוגדן ה-GFP מן Invitrogen שמשה בהצלחה על פי הוראות יצרן, אבל זה יכול להיות שונה לכל הליך אימונוהיסטוכימיה.
- ציון גרורות באופן עיוור. אם GFP חיובי, תאים סרטניים יהיו כתם חום בנוסף בעל גרעינים גדולים וייחודיים. כאשר גרורות הבקיע הראשונות, להתייעץ עם פתולוג כדי להבטיח ניקוד נכון, ולהשתמש ברקמת ריאה מוכתמת H & E כדי לאשר נוכחות של תאים סרטניים, ולא חדר לתאים חיסוניים.
6. זיהוי של תאים סרטניים במחזור הדם וממח העצם
- הוסף את כל הדם שנאסף מהנתיחה לאחר המוות לצינור צנטריפוגות 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה 5 דקות ב800 x גרם.
- הסר את הפלזמה ולהוסיף 1 מיליליטר ACK תמוגה חוצץ (154.95 מ"מ אמוניום כלוריד, 9.99 מ"מ אשלגן Bicarboנייט, .0995 mM EDTA,). לאפשר לדם לשבת בטמפרטורת חדר 3-5 דקות.
- צנטריפוגה 5 דקות ב800 x גרם.
- הסר את supernatant ולהוסיף 1 מיליליטר של תקשורת בתרבות תא המכילה אנטיביוטיקה. הוספת תאים לבקבוק T75 המכיל 9 מיליליטר של תקשורת בתרבות התא.
- תרבות תאים על 37 מעלות צלזיוס באווירת humidified המכילה 5% CO 2 למשך 10 ימים, בודק את קיומו של כל CTCs 2-3 ימים.
- למח עצם, להסיר את כל רקמת השריר מירך באמצעות מספריים, סכין גילוח, או אזמל. הסר את קצות העצם, כפי שקרוב לקצוות ככל האפשר.
- באמצעות מחט 23 ¾ G, בעדינות להוציא את מח העצם מעצם הירך לתוך צינור צנטריפוגות 1.5 מיליליטר.
- הוסף ל1 מיליליטר של תקשורת בתרבות תא ובעדינות פיפטה גם לערבב.
- הוספת תאים לבקבוק T75 המכיל 9 מיליליטר של תקשורת בתרבות התא.
7. אפיון מולקולרי של גידולים
- לתגובת שרשרת של פולימראז assay (PCR)ים, דגימות גידול שהיו הצמד קפוא בחנקן נוזלי נכתשות ראשונה על קרח יבש ולאחר מכן הומוגני באמצעות homogenizer רקמות לדקות 3-5 עם 1 מיליליטר TRIzol. TRIzol חילוץ מתבצע לפי הוראות יצרן. לטהר RNA באמצעות ערכת בידוד RNeasy RNA על פי הוראות יצרן. ביצוע סינתזת cDNA וזמן אמת PCR (qRT / PCR) באמצעות ריאגנטים TaqMan על פי הוראות יצרן מומלץ אבל יכול להיות שונה לכל שיטת PCR מועסק כיום.
- עבור מבחני כתם מערביים, homogenize רקמות באמצעות homogenizer רקמות לדקות 3-5 עם 1 מיליליטר של חיץ תמוגה: PBS (137 mM NaCl, 10 פוספט מ"מ Na, 2.7 מ"מ KCl), 0.5% X-100, 1 mM EDTA טריטון, pyrophosphate 2.5 מ"מ נתרן, 1 מ"מ β-glycerophosphate, עם תוספת של מעכבי פרוטאז קוקטייל, קוקטיילים פוספט מעכב 2 ו -3, פלואוריד הנתרן 10 מ"מ, וorthovanadate נתרן 1 מ"מ. תערובת lysate התא ממוקמת בצינור צנטריפוגות 1.5 מיליליטר.
- סנטתערובת lysate תא rifuge 10 דקות ב 13,000 X גרם.
- הסר supernatant ומקום בצינור צנטריפוגות חדש 1.5 מיליליטר וcentrifuged שוב 10 דקות ב 13,000 X גרם. אם פסולת תא עדיין קיימת, ניתן לבצע צעד צנטריפוגה נוסף.
- הסר supernatant ולבצע כתם מערבי לפי תנאי מעבדה רגילים.
Representative Results
לצורך ניסוי זה, אנו מציגים קבוצה מייצגת של עכברים שהושגו במהלך הליכים כירורגיים אלה. חמישה עכברים מושתלים עם תאי GFP החיובי PC3-M המכילים וקטור שליטה. גידולים הורשו לגדול במשך שישה שבועות, ולאחר מכן מספר פרמטרים הוערכו. באיורים 1 א ו-1B, אנו מראים את השינוי במשקל גוף וצריכת מזון של עכברים, בהתאמה. יש לטבול קטן במשקל גוף ומזון לצריכה בסמוך למועד הניתוח בשל ההרדמה. במהלך הניסוי, משקל גוף מגביר לאט לאחר ניתוח, ולאחר מכן מתחיל לרדת לקראת סוף הניסוי כניטל גידול יגיע לרמה קריטית. זה מתאימים על ידי צריכת מזון בעכברים אלו.
ב2A דמויות ו2B, גדלי גידול נציג שהושגו מוצגים. גדלי גידול פרט להשתנות, אבל בממוצע אנו משיגים גידולים של כ 1 גרם, עםשונות נורמליות בין 0.5-1.5 גרם, וגודל גידול של 1 סנטימטר 2, עם שונות נורמליות של 0.5-1.5 2 סנטימטר. למרות הגודל של הגידולים משתנה, אלה אינם תואמים את המספר של גרורות כתוצאה, המוצג גם במאמר זה והעבודות שפורסמו בעבר שלנו 10. עם זאת, ממודל זה, ניתן לקבוע את ההשפעה של טיפול תרופתי או שינויים מולקולריים במשקל וגודל גידול. שיקול חשוב במודל זה הוא כאשר נקודת הסיום המתאימה לניסוי הוא. ב2C דמויות ו2D, אנו מראים שינויים במשקל גידול וגודל גידול בשורה אחת מסוימת PC3-M תא היציבות transfected עם GFP ווקטור שליטה ב 4 שבועות ובגיל 6 שבועות. בשבועות האחרונים, במשקל הגידול הממוצע עלה 2.7 לקפל, ולקפל 1.9 גודל גידול. זה מראה את התוספת של 1-2 שבועות נוספים על הניסוי יכולה להשפיע באופן דרמטי את תוצאות. כמספר רב של גורמים יכול לשנות את הצמיחה של הגידולים, כולליםהגיל והגודל של עכברים, מספר הקטעים של התאים, וכו 'אנו ממליצים לא הפסקת ניסויים עד שגידולים גלויים הם נצפו ברוב המכריע של העכברים.
בציורי A3-C3, מספר גרורות הוא לכמת שלוש דרכים שונות. באיור 3 א, המספר הכולל של תאי PCA אדם GFP החיובי מיוצגים. באיור 3, מספר לוקוסי תא, או במקומות בהם פיקדונות גרורתי נמצאים, מוצג. לבסוף, באיור 3C, מספר גרורות שונות, כפי שהוגדר על ידי קבוצה מחויבת באופן ברור של תאים המציגה 5 תאים או יותר PCA אדם GFP החיובי, מוצג הסמל. תמונות מייצגות של תנאים שונים אלה מוצגות איורים 4A-4D. באיור 4 א, תא יחיד בגודל 40x מסומן בחץ. שים לב לכתמים החומים וגרעינים שונים גדולים. סעיף ריאה סמוך המוכתם באמצעות צביעה H & Eמוצג באיור 4 ב ', המאשר כי בלי ה-GFP, זיהוי של תאים סרטניים הוא עדיין בר השגה בקלות. צילום הזה נלקח ב40x גודל והתא מסומן בחץ. באיור 4C, כמה לוקוסים משתנים מספר תאים בגודל 10x מוצגים וכל מקום הדגיש עם חץ. . לבסוף, באיור 4D, הפקדת גרורתי של תאים 10 מוצגת. כיצד שיטות אלה משפיעות על הנתונים המוצגים על ידי הבדלים בעכבר 1 ועכבר 3. עכבר של 1 מספר נמוך יותר של תאים הכולל בסרטן הריאות, עם ממוצע של 21.5 תאים לכל סעיף ריאות, בהשוואה לעכבר 3 שבו יש בממוצע 700 תאים לכל סעיף ריאות. עם זאת, יש עכבר 3 פחות לוקוסים, או במקומות בהם תאים נמצאים מ 1 מאוס. יש עכבר 3 יחסית מעט אתרים של גרורות, אבל מספר תאים לכל אזור הוא גבוה מאוד ב82 תאים לכל לוקוסים בשל מספר גרורות מספר תא גדולות מאוד. בניגוד לכך, יש עכבר 1 לוקוסים יותר ייחודיים, אבל באופן משמעותי ותאי קיתון למיקום בבית רק ממוצע של שני תאים לכל מיקום. פרמטרים שונים אלה יכולים לשפוך אור על קינטיקה של תאי סחר לריאות ואת היכולת שלהם מתחילות לגדול ולהתרבות.
בנוסף, באיור 3D, אנו מראים שינויים בתאים גרורתי הכולל לריאות בעכברים שלאחר מוות בארבעה לעומת שישה שבועות. כפי שתואר ב2C דמויות ו2D, שינויים משמעותיים הם נצפו במשקל וגודל גידול בשבועות האחרונים של ניסוי. זה סכם באיור 3D. עכברים שלאחר מוות בארבעה שבועות לא הראו התפתחות גרורתי, ואילו עכברים בגיל 6 שבועות הראו תאים גרורתי בכל העכברים שנבדקו. זה ממחיש עוד יותר את חשיבות הבטחת necropsies עכברים מבוצעים בנקודת סיום בשלב מאוחר כדי להבטיח היווצרות של גרורות התרחשה.
מדידה נוספת במודל זה היא שינויים מולקולריים המתרחשים בתוך גידול ראשוני. איורים 5A-5C אנחנו מראים שלושה ניסויי qRT / PCR דוגמא מדידת שלושה גנים של עניין בהתקדמות גרורתי, פרוטאינאז מטריצה מסוג 2 (MMP-2), סוג פרוטאינאז המטריצה 9 (MMP-9), וחלבונים הלם חום 27 (HSP27) בהתאמה. כל גן של עניין נמדד באמצעות qRT / PCR ניתן לאתרם באמצעות טכניקה זו. בנוסף, ניתן לכמת רמות החלבון באמצעות נהלי כתם מערביים.
איור 1. משקל גוף נצפה וצריכת מזון בבעלי חיים. משקל א.ב.) גוף בגרמים, או צריכת מזון ממוצעת לעכבר ליום בגרמים, נרשם לאורך כל הניסוי ומוצג ב) ו-B) בהתאמה.
"Src =" fig2highres.jpg / files/ftp_upload/50873/50873fig2.jpg "/>
איור 2. גודל גידול ומשקל גידול בבודד וקבוצות של עכברים. א.ב. משקל גידול) בגרם וגודל גידול בסנטימטרים בריבוע של חמישה עכברי שליטת נציג וממוצע של חמישה עכברים בסוף שישה שבועות מוצגים ב) ו-B) בהתאמה. CD) השוואה של משקל גידול בגרמים ו גודל גידול בסנטימטרים בריבוע בין קבוצות של עכברים שלאחר מוות בארבעה ושישה שבועות. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.
איור 3. התפשטות גרורה בבודד וקבוצות של עכברים. ) Sprea גרורתי הממוצע ACד לכל סעיף ריאות במשך חמישה עכברים בודדים וממוצע חמישה העכברים בסוף שישה שבועות מיוצגים ככולל גם מספר התאים (א), מיקומם של תאים גרורתי (B), או גרורות שונות כפי שהוגדר על ידי 5 + תאים ב אשכול מוגדר בבירור. ד) (ג) השוואה של המספר הממוצע של תאים גרורתי לכל סעיף ריאות לכל עכבר בין עכברים שלאחר מוות בארבעה ושישה שבועות. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.
איור 4. נציג תמונות של גרורות בריאות. ריאות סמוכות) תא בודד GFP חיובי ריאות ב40X המטרה מסומן בחץ. ב ')קטע מ), מראה את אותו התא מתחת H & E מכתים. C) סעיף ריאה אחת ב10X אובייקטיבי עם שבעה לוקוסים בודדים המכילים מספר משתנה של תאים. ד) גרורות מובחנות אחד ב10X אובייקטיבי המכיל 10 תאי סרטן מוגדרים כקבוצה אחת.
איור 5. ניתוח PCR של שלושה גנים גרורתי של עניין. qRT / PCR בוצע על דגימות גידולים בודדות שנאספו מעכברים בגיל שישה שבועות. רמות תעתיק mRNA יחסית של MMP-2 (א), MMP-9 (ב), וHSP27 (C) נמדדות, מנורמלים לGAPDH. לחצו כאן כדי להציג דמות גדולה.
Discussion
במאמר זה אנו מספקים מודל עכברי רומן של גרורות PCA אנושיות. במודל זה, PC3-M שורות תאי PCA האדם מושתל orthotopically ישירות לתוך הערמונית של BALB / ג athymic עכברים וגידולים מותר לפתח עבור 4-6 שבועות. בסעיף תוצאות הנציג, אנחנו מראים דוגמאות של נתונים שיכולים להיות שנאספו, כוללים משקל עכבר וצריכת מזון, גודל גידול ומשקל, מאפיינים מולקולריים של הגידול, והיווצרות של גרורות שונות לריאות. בנוסף, מגוון רחב של יציאות נוספות ניתן ללמוד בהתאם לתחומי מחקר מסוימים. דוגמא אחת היא נוכחותם של CTCs לדם ומח עצם. כCTCs הוא אירוע נדיר יחסית (שאנו רואים CTCs בכ 5-20% מבעלי השליטה), לא הופתעו שאף אחד מחמשת העכברים בניסויים אלה פותח CTCs. המעבדה שלנו גם השתמשה במודל זה כדי לקבוע שינויים בהידבקות הסלולר על ידי מדידת מורפולוגיה של תאים גרעיניים בערמונית רקמה 10. יש לנו גם השתמשתי במודל זה כדי להעריך את מצב התפשטות גידול ואפופטוזיס עיקרי באמצעות Ki67 ומכתים Tunel של הגידול בערמונית 14.
בנוסף למגוון הרחב של יציאות נתונים שניתן להשיג, מודל זה יכול לשמש כדי לקבוע את ההשפעות של השינויים בביטוי חלבונים, כמו גם תרופות מולקולה קטנות. בהשוואה לדגמים רבים ספונטניים ומושרים של גרורות PCA אנושיות, יש זמן תגובה גבוהה יותר של רק 4-6 שבועות. יש מודלים אחרים עם זמן אספקה גבוה, כמו וריד זנב או דגמי הזרקת intercardiac, מגבלות של שום גידול ראשוני, ולכן לא משחזר את המפל גרורתי במרפאת באופן מלא. במודל שלנו, תאים סרטניים חייבים לברוח האתר הראשי של מקור, הזן ולשרוד את מערכת הדם, ולהשתיל לאתר המשני. זה מספק צעדים נוספים שבו התערבות או שינוי טיפולי בביטוי חלבון יכולה לספק אפקט. Additionally, הנוכחות של הגידול הראשוני צריכה לאפשר ליישום קל של מודל זה לטכנולוגיות הדמיה חדשות כגון מבוסס לוציפראז IVIS 16-17.
למרות המגוון הרחב של יתרונות של מודל זה, יש גם כמה מגבלות שיש לשקול. מספר גדל והולך של מחקרים מראה את החשיבות של המערכת החיסונית בmicroenvironment הגידול וההתפתחות של גרורות 18. במודל זה, בשל השימוש במכרסמי athymic, היכולת להעריך את ההשפעות של המערכת החיסונית היא לא אפשרית. מגבלה שנייה היא חוסר היענות אנדרוגן בתאי PC3-M. לאחר האבחון ראשוני של PCA, חולים לעתים קרובות לעבור טיפול אנדרוגן כטיפול קו ראשון. עם זאת, חולי סופו של הדבר הפכו לאנדרוגן עמיד וגידולים יתחילו לצמוח שוב. ככל שתאי PC3-M חסרי קולטן האנדרוגן, מודל זה מודד רק את ההשפעות של טיפול תרופתי או אפנון חלבון על ג עמיד פוסט אנדרוגןancer. למרות זאת היא הגבלה, PCA אנדרוגן מגיב היא כיום גם לניהול ויש לו מגוון רחב של אפשרויות טיפול יעילות, והסרטן ובכך אנדרוגן עמיד הפך בולט יותר למד. מודל זה גם באופן ספציפי משתמש בזן טהור של עכברים, אשר ממזער עכבר כדי השתנות עכבר. עם זאת, מתח זה עשוי להיות רגיש במיוחד לחלבונים מסוימים או מולקולות קטנות, ובכך יש להקפיד כאשר חיוץ נתונים אלה למרפאת.
למרות שמודל זה מספק מדידה אפקטיבית של יעילות תרופה בזמן אספקה מהירה של 4-6 שבועות, זה לא יכול לקחת בחשבון השפעות תרופת מינון לטווח ארוך. לאחר חשיפה ממושכת לטיפולים הקיימים כיום רבים, חולים עלולים לחזור עם סרטן עמיד לתרופות רבות שנים שלאחר טיפול. אספקה המהירה של טכניקה זו אינה מאפשרת לדוגמנות יעילה של יכולתו של גידול להיות עמיד לטיפול. עם זאת, עם מודולציה של האקס זהperiment, יכולים להיות מושתלים תאי סרטן עמיד לטיפול אנושי ערמונית, ואת האפקטיביות של טיפול מדור שני במניעת צמיחת גידול PCA וגרורות יכולות להיות מודל. בנוסף, אם קבוצה הייתה מנסה ללמוד את השינויים המולקולריים בגידול ראשוני לאורך זמן, מודל לטווח ארוך יותר, כגון דגם הנווד צפוי להיות יעיל יותר למחקרים אלו.
מגבלה נוספת של מודל זה היא ההפצה של גרורות ברורות רק לבלוטות לימפה וריאות של בעלי החיים. שני אתרים אלה הם אתרים תכופים ורלוונטיים קליני של גרורות, כפי שהוכח על ידי מחקרי נתיחה חמים אדם 19. עם זאת, גרורה בעצמות קליניות מהוות מאפיין בולט של PCA האנושית, ולכן מודלים משחזרים את זה הם בעלי העניין. למרבה הצער, אלה קשים לשחזר במודל של עכברים, עם מעט מאוד מודלים מראים גרורות בעצמות ללא וריד זנב, הזרקת intercardial, או השתלה ישירה בלעצם 20. לכן, אם מיקוד לעצם הוא בעל חשיבות ניסיונית מפתח, מודל אחר עשוי להיות יעיל יותר. עם זאת, מודל זה אינו מספק מידה מסוימת של תנועה לעצם בצורה של מח עצם מחזורי תאים סרטניים.
למרות מגבלות אלה, טכניקה זו היא מודל רב עוצמה של PCA האנושית. היכולת למדוד תופעות בשני הגידול הראשוני, כמו גם היווצרות גרורתי בזמן אספקה קצר מספקת מגוון רחב של יישומים. במודל זה, תאים חייבים לברוח האיבר העיקרי, הזן ולשרוד בדם, ושתלו באתר המשני, משחזרים את התהליך בבני אדם. מדידה נוספת של מאפיינים מולקולריים של הגידול הראשוני, שינויים במורפולוגיה של תאים, ונוכחותם של תאים סרטניים במחזור מספקת נשימה רחבה של מידע ממודל אחד. הליך זה יכול לשמש גם בהקשר של גילוי תרופות, כמו גם ללמוד שינויים בביולוגיה של גידול.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות (NIH) לRCB, CA122985 וערמונית הנבג CA90386, וJMP, NIH T32 AG000260 "דיסקברי ההדרכה תרופות בהפרעות הקשורות בגיל", ועל ידי ס 'וולטר ווסיין Driskill תכנית לתארים מתקדמים במדעי חיים באוניברסיטת נורת'ווסטרן. כמו כן, אנו רוצים להודות לPhenotyping עכבר המעבדה היסטולוגיה ופתולוגיה מתקן Core באוניברסיטת נורת'ווסטרן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 1 ml Syringe, Tuberculin, Slip-Tip | Becton Dickinson | 309659 | |
| 23 G 3/4 Precison Glide Needle | Becton Dickinson | 305143 | |
| 30 G 1/2 Precision Glide Needle | Becton Dickinson | 305106 | |
| Alcohol Wipes | Triad | 10-3001 | |
| Autoclip Applier, 9mm, Stainless Steel | Becton Dickinson | 427630 | |
| Clips, 9mm | VWR | 15431-673 | |
| Convertors Polyline Towel (Sterile) | Cardinal Health | 3520 | |
| Cotton-Tipped Applicators, 6 inch, Sterile, Wooden Shaft | Fisher | 23-400-125 | |
| Curad Sterile Cotton Balls | VWR | 500043-544 | |
| Derf Needle Holder, Integra Miltex, 121 mm (4 3/4") | VWR | 95039-192 | |
| Duraprene SMT Sterile Neoprene Powder-Free Surgical Gloves | Cardinal Health | 2D72PN70 | |
| Germinator 500 | Cell Point Scientific | SN 7030 | |
| Kendall Monojet Needles, 1/2 cc syringe with permanent 28 G 1/2 needle | Tyco | 1180528012 | |
| Medium Heating Pad | VWR | 100229-094 | |
| Merit Iris Scissors, Sklar, 11.4 cm (4 1/2") | VWR | 94000-000 | |
| Metric/English Vernier Caliper | VWR | 19155-057 | |
| PDS*11 Violet Monofilament Sutcher 4-0, 27" | Ethicon | Z304H | |
| VetEquip Inhalation Anesthesia System | Contact Your Animal Facility for Availability | ||
| VWR Premium Tissue Cassettes | VWR | 18000-010 | |
| VWR Specimen Forceps, Serrated, Straight, 114 mm (4 1/2") | VWR | 82027-440 | |
| Reagents | |||
| Betadine Surgical Scrub | Fisher Healthcare | 19-027132 | |
| Buprenex | Controlled Substance - Obtain from Animal Facility | ||
| Dako DAB + Chromagen | Dako | K3468 | |
| Dako Envision + System HRP-Labeled Polymer, Anti-Rabbit | Dako | K4003 | |
| Dako Envision Kit Protein Block | Dako | X0909 | |
| Formalin | VWR | 95042-908 | |
| GFP Antibody | Invitrogen | A11122 | |
| Hematoxylin | Mayer | MH580-2.5L | |
| Meloxican | Obtain from Animal Facility | ||
| Nembutal | Controlled Substance - Obtain from Animal Facility | ||
| Rneasy RNA Isolation Kit | Qiagen | 74104 | |
| Sterile Saline | Obtain from Animal Facility | ||
| Taqman Reverse Transcription Reagents | Life Technologies | N8080234 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4304437 | |
| Trizol | Invitrogen | 10296 | |
References
- Jemal, A., et al.
- Shappell, S. B., et al. Prostate pathology of genetically engineered mice: definitions and classification. The consensus report from the Bar Harbor meeting of the Mouse Models of Human Cancer Consortium Prostate Pathology Committee. Cancer Res. 64, 2270-2305 (2004).
- Rangarajan, A., Weinberg, R. A. Opinion: Comparative biology of mouse versus human cells: modelling human cancer in mice. Nat. Rev. Cancer. 3, 952-959 (2003).
- Pollard, M. Lobund-Wistar rat model of prostate cancer in man. Prostate. 37, 1-4 (1998).
- Gingrich, J. R., et al. Androgen-independent prostate cancer progression in the TRAMP model. Cancer Res. 57, 4687-4691 (1997).
- Gingrich, J. R., et al. Metastatic prostate cancer in a transgenic mouse. Cancer Res. 56, 4096-4102 (1996).
- Yang, M., et al. A fluorescent orthotopic bone metastasis model of human prostate cancer. Cancer Res. 59, 781-786 (1999).
- Wu, T. T., et al. Establishing human prostate cancer cell xenografts in bone: induction of osteoblastic reaction by prostate-specific antigen-producing tumors in athymic and SCID/bg mice using LNCaP and lineage-derived metastatic sublines. Int. J. Cancer. 77, 887-894 (1998).
- Dolman, C. S., et al. Suppression of human prostate carcinoma metastases in severe combined immunodeficient mice by interleukin 2 immunocytokine therapy. Clin. Cancer Res. 4, 2551-2557 (1998).
- Lakshman, M., et al. Dietary genistein inhibits metastasis of human prostate cancer in mice. Cancer Res. 68, 2024-2032 (2008).
- Messina, M. J., Persky, V., Setchell, K. D., Barnes, S. Soy intake and cancer risk: a review of the in vitro and in vivo data. Nutr. Cancer. 21, 113-131 (1080).
- Adlercreutz, H., Markkanen, H., Watanabe, S. Plasma concentrations of phyto-oestrogens in Japanese men. Lancet. 342, 1209-1210 (1993).
- Xu, L., et al. MEK4 function, genistein treatment, and invasion of human prostate cancer cells. J. Natl. Cancer Inst. 101, 1141-1155 (2009).
- Lakshman, M., et al. Endoglin suppresses human prostate cancer metastasis. Clin. Exp. Metastasis. 28, 39-53 (2011).
- Craft, C. S., Romero, D., Vary, C. P., Bergan, R. C. Endoglin inhibits prostate cancer motility via activation of the ALK2-Smad1 pathway. Oncogene. 26, 7240-7250 (2007).
- Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J. Vis. Exp. , e1210 (2009).
- Cordero, A. B., Kwon, Y., Hua, X., Godwin, A. K. In vivo imaging and therapeutic treatments in an orthotopic mouse model of ovarian cancer. J. Vis. Exp. , e2125 (2010).
- Buijs, J. T., vander Pluijm, G. Osteotropic cancers: from primary tumor to bone. Cancer Lett. 273, 177-193 (2009).
- Rubin, M. A., et al. Rapid ("warm") autopsy study for procurement of metastatic prostate cancer. Clin. Cancer Res. 6, 1038-1045 (2000).
- Singh, A. S., Figg, W. D. In vivo models of prostate cancer metastasis to bone. J. Urol. 174, 820-826 (2005).
