Summary
Denna orthotopic modell av human prostatacancer möjliggör kvantifiering av tumörstorlek, cirkulerande tumörceller, och bildandet av distinkta metastaser i lungan. Eftersom cellerna måste fly den primära organ, in i blodbanan, och fäster sig en sekundär plats, denna modell rekapitulerar effektivt scenariot hos människor.
Abstract
Vårt laboratorium har tagit fram en ny orthotopic implantation modell av human prostatacancer (PCA). Som PCa döden är inte på grund av den primära tumören, utan bildandet av distinkta metastaser, är förmågan att effektivt modellera denna progression pre-kliniskt av högt värde. I denna modell är celler direkt implanteras i den ventrala loben av prostata i BALB / c atymiska möss, och tilläts fortskrida under 4-6 veckor. Vid experiment uppsägning, kan flera olika ändpunkter mätas, till exempel storlek och molekylär karakterisering av primärtumör, närvaro och kvantifiering av cirkulerande tumörceller i blod och benmärg, och bildandet av metastaser i lungan. Förutom en mängd olika slutpunkter, ger denna modell en bild av en celler förmåga att invadera och fly den primära organ, in och överleva i cirkulationssystemet, och implantat och växa i en sekundär plats. Denna modell har använts på ett effektivt sätt för att mäta metastasersvar på både förändringar i proteinuttryck samt svar på småmolekylära terapi, i en kort handläggningstid.
Introduction
Prostatacancer (PCA) är den vanligaste diagnosen cancer hos män och den näst vanligaste orsaken till dödsfall i cancer i USA 1. Döden från PCa inte beror på bildandet av den primära tumören, utan bildandet av metastaser. Därför är förebyggande av metastaser hos patienter med hög vikt. Musmodeller av PCa erbjuder en mångfald av alternativ för att avslöja viktig biologisk information om denna sjukdom.
En mängd olika musmodeller av PCa existerar, var och en med inneboende fördelar och begränsningar. Även frekvensen av PCa hos människa är hög, är naturligt förekommande PCa extremt ovanligt i möss 2, trots lika känslighet möss övergripande till cancer 3. En gnagarart undantag är utveckling av PCA i Lobund Wistar-råttor, som kan uppnå hastigheter av PCa av 90% genom 12 månaders ålder via induktion av methylnitrosourea och testosteron 4. Därför inducerade modellsystem, såsom TRAMP(Transgen adenokarcinom i mus prostata) modell användes vanligen. Lufsen-modellen kan inducera transgenuttryck särskilt i prostata, och genomgår den normala utvecklingen av PCa, från hyperplasi till prostata intraepitelial neoplasi (PIN) till lymf-och lungmetastaser 5-6. Dessa modeller ger fördelarna av att kunna mäta hela skalan av tumörprogression, samt innehåller ett intakt immunsystem. Däremot kan de molekylära händelser som ligger till grund PCa utvecklingen skiljer sig åt mellan möss och människor, och korrelationer mellan möss och humana kliniska studier har visat variabilitet. Dessutom är båda dessa modeller är tidskrävande, som ett exempel den TRAMP-modellen kräver ungefär 28 veckor för att utveckla metastaser.
I att studera metastaser, är ofta en svans-ven eller vänster kammare injektion modell som används. Denna modell har nytta av snabb vändning tid, och kan dessutom mäta närvaron av skelett metastasär att använda särskilda cellinjer och villkor. Yang et al. Har rapporterat att subkutan injektion av GFP-positiva PC3-celler kan orsaka stor spridning benmetastaser 7, och svansvenen och intercardiac injektioner har också genererat skelettmetastaser utveckling 8-9. De huvudsakliga begränsningarna hos dessa modeller gäller avsaknaden av en primär tumör är bosatt inom prostatakörteln själv. Vidare, för modeller beroende av injektion av cancerceller in i cirkulationen, kringgår detta hela första halvan av den metastatiska kaskaden. Det utesluter därmed undersökning av första stegen, inklusive invasion genom den primära organ, som är biologiskt viktiga åtgärder för metastaserande förvandling. Många regulatorer av metastaserande förvandling direkt påverka tidiga cellinvasion. Tidiga steg i metastaserande kaskad utgör högprioriterade platser för terapeutisk inriktning, som när cancerceller sprider expanderar klonal variation kraftigt, vilket ökar biologiskal mångfald och minskande effektiv terapeutisk inriktning.
I ett försök att svara på många av de begränsningar av dessa modeller, har vårt laboratorium utvecklat ett orthotopic modell av human PCa där den mänskliga PCa PC3-M cellinje är direkt implanteras i prostatan av Balb / c-atymiska möss. Efter 4-6 veckor, kan tumörstorlek, förekomst av cirkulerande tumörceller (CTCs), och metastasering till lungorna och lymfkörtlar alla kvantifieras. Vi har i praktiken använt denna modell för att utvärdera effekten av 4 ',5,7-trihydroxyisoflavone (genistein) för att hämma human PCa metastaser 10. Dietary intag av genistein har kopplats till minskningar i prostatacancer metastaser och död 11-12, men tidigare ingen studie hade fastställt huruvida administration av genistein kan förändra PCa metastaser hos djur eller män. I denna studie visade vi att behandling med genistein kraftigt minskat antal lungmetastaser. Dessutom bestäms vi genistein alrade aktiveringen och uttrycket av flera viktiga pro-metastatiska proteiner i den primära tumören, inklusive fokal adhesion kinas (FAK), p38 mitogen-aktiverat proteinkinas (p38 MAPK) och värmechockprotein 27 (HSP27).
Dessa resultat överensstämde med observationer i kliniken. Med hjälp av blod från mössen, kunde vi noggrant mäta blodkoncentrationen av genistein och observerade dessa att likna nivåerna hos människor med vanliga kosten intag av genistein. Dessutom, en fas II-studie utförd av vår grupp bestämt att vid behandling med genistein, män erfarna minskningar i prostatavävnad mRNA uttryck av gener associerade med cellulär invasion och metastasering, särskilt matrixmetalloproteinas typ 2 (MMP-2) 13.
Vi har också använt denna modell för att utvärdera effekten av förändrad gen-produkt uttryck i den primära tumören på människors PCa metastaser 14. Tumören supprEssor endoglinen är en medlem av TGF-super och undertrycker mänskliga PCa cellulär invasion in vitro genom förändring av Smad signalering 15. Vi utökade dessa studier för att bestämma effekten av endoglin på människors PCa metastaser. Stabil endoglin knockdown, vektorkontroll eller endoglin över uttryck cellinjer implanteras i möss. Endoglin knockdown celler uppvisade det högsta antalet lungmetastaser, liksom CTCs i 38% av mössen. Möss implanterade med kontrollvektor visade ett medium respons, med mindre lungmetastas per mus, och CTCs i endast 18% av mössen. Hög endoglin implanterade möss visade nästan fullständig hämning av lungmetastaser, och fullständig hämning av CTCs.
Dessa är bara två exempel på de många olika tillämpningar av denna teknik har. Från läkemedelsforskning, till modellering förändringar i molekylärbiologi, har den här modellen en hög genomströmning metod för att utvärdera effekterna av olika funktioner på tumörtillväxt och mullvadkärlförändringar, förekomst av CTCs, och bildandet av distinkta metastaser i lungan och lymfkörtlar.
Protocol
För alla som deltar i djurförsök har protokoll godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid Northwestern University. Kirurgiska tekniker och djurvårdsförhållanden observerades av veterinärpersonal och ändras för att minimera djurens stress eller dödlighet. Enskilda institutioner har olika krav och det är viktigt att arbeta med IACUC och djur personal vid utveckling och genomförande av denna operationsmetod.
1. Beredning av celler för injektion
- Detta steg bör utföras så nära som möjligt till att börja operationer. Trypsinize celler som används för försöket, ta bort från plattan, och neutralisera med media. Den PC3-M human PCa cellinje stabilt transfekterade med GFP har framgångsrikt använts för dessa experiment på grund av snabba villkoren i PC3-M-celler tillväxt. GFP tillsattes för ytterligare underlätta detektering av lungmetastas i lungvävnadsprover, och snabb bestämning avcancerceller kontra immuna celler i kulturer erhållna från blod och benmärg för att identifiera cirkulerande tumörceller. Vid modifiering av en specifik gen av intresse, då skapa stabila cellinjer med denna genförändring utföres först, följt av transfektion med GFP. Om GFP kommer att ändra funktionen av denna gen av intresse, kan GFP det utelämnas. Detta kommer att göra detektering av lungmetastas svårare, men fortfarande kan uppnås. Dessutom, om med hjälp av specifik bildteknik med användning av fluorescensmarkörer, såsom luciferas-baserad IVIS, andra fluorescerande proteiner kan användas i stället.
- Centrifugera i 5 minuter vid 225 x g..
- Isolera 2,5 x 10 5 celler och centrifugera under 5 min vid 225 x g..
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i 20 | il av steril saltlösning.
- Sug cellsuspension i en 0,5 ml spruta med en permanent 28 ½ G nål (rekommenderad: Kendall Monojet, eftersom andra märken har orsakat problem), vilket garanterar ingen luft kommer in nålen along med suspensionen.
- Linda sprutan i steril folie och förvara på is tills används.
2. Orthotopic Implantation av Human Prostate Cancer Cells
- Manliga 6-8 veckor gamla BALB / c-atymiska möss användes. Den perfekta musen kroppsvikt för kirurgi är 19-21 g, och möss bör tillåtas att växa till minst 18 g innan operationen. Mindre djur är tekniskt svårare att verka på. Större djur tenderar att uppleva långsammare kinetik av tumörtillväxt och metastasering. Djur bör hållas i djuranläggningen minst en vecka före operation för att minska djurens stress. Beroende på experimentell design, kan läkemedelsbehandling påbörjas en vecka före operation.
- Spruta innan operation smärts enligt djurets anläggningens instruktioner. 0,1 mg / kg kroppsvikt subkutant Buprenex med användning av en 30 ½ G nål fäst till en 1 ml spruta föreslås.
- Placera djur i isofluran kammaren och vänta tills djuren är helt ennesthetized. Ingen tå reflex av muskeltonus bör vara närvarande vid denna punkt. Denna metod rekommenderas, men, om tillgänglig, kan andra metoder för anestesi användas enligt Animal Facility instruktioner.
- Flytta djur ur den isofluran kammaren i en steril procedur huva. Placera djuret i noskonen apparaten, och på nytt se till att djuret är under full bedövning innan du fortsätter.
- Desinficera nedre delen av buken med en Betadine scrub med sterila bomullstussar, torka med alkohol torka, och slut sprej med Betadine lösning. Låt torka.
- Med hjälp av antingen en steril skalpell eller vässade sterila kirurgiska saxar, en låg mittlinjen buksnitt på ca 3-4 mm görs. Lyft försiktigt blåsa med hjälp av pincett och identifiera den ventrala loben av prostata. Dessa två lober är placerade direkt under urinblåsan. Vissa möss kommer att ha ett litet fettlager täcker prostatan som kan föras försiktigt åt sidan med hjälp av en steril bomullspinne. Minimize all förflyttning av organ och muskulatur om möjligt.
- Injicera 20 ul volym cell lösningen i prostatakörteln, vilket minimerar läckage och se en liten bubbla observeras.
- Byt ut blåsan och stänga muskellagret med hjälp av 4,0 absorber vicryl monofilamentsuturer på ett enkelt avbruten mönster.
- Stäng hudskiktet med sterila 9 mm klammer.
- Ta bort djuret från isoflurananestesi och övervaka tills vaken och röra sig normalt. Placera på värmedyna under återhämtningsperioden.
- Om flera operationer utförs, mellan operationer, rena alla verktyg med 70% etanol, och sterilisera med hjälp av en glaspärla autoklav. Låt verktyg svalna helt innan nästa djur. Återanvänd inte suturer, bomullstussar eller sterila kompresser.
3. Övervakning Djur
- Administrera smärts utifrån djurens anläggningens instruktioner. 4 h efter kirurgi administrering av en dos av subkutant Meloxikam vid 1 mg / kg kroppsvikt usjunger en 30 ½ G nål fäst till en 1 ml spruta föreslås, följt av ytterligare en dos varje 12-24 timmar för nästa 48 timmar.
- Stapel kan avlägsnas från djur 7 till 10 dagar efter operation när såret har läkt.
- Övervaka djurens vikt, livsmedelskonsumtion, och palpera möss för tumörer två gånger i veckan fram till uppsägning av experiment. Öka frekvens upp till varannan dag när tumörerna blir synliga för att leta efter djur under betydande tumörbörda eller tvång. Tidig död från denna modell beror på den stora primära tumörbörda, som primära tumörer kan blockera urinflöde, så alla djur med en förlust på mer än 15% kroppsvikt eller en primärtumör når en diameter på 1,5 cm bör obduceras omedelbart förhindra blåsobstruktion och djurs död.
- Övervaka för behov av ytterligare anrikning av djurmiljön. Stressen av kirurgi ökar djur stridigheter. Tillsatsen av två plaststugor per bur i stället för en och ytterligare beteendeal anrikning kan minska dessa händelser. Diskutera med veterinärpersonal alternativ vid anläggningen djuren hålls på. I brist på ögonfransarna på denna stam av möss, är hyddor och anrikning av papper rekommenderas inte eftersom de kan irritera ögonen.
4. Obduktions Förfaranden
- Efter 4-6 veckor, tumörer är helt uppenbara och djuren börjar gå ner i vikt på grund av ökad tumörbörda. Tumörer kan typiskt palperas och / eller är synliga för blotta ögat. Obduktion ska utföras vid denna punkt. Utför en intraperitoneal injektion av Nembutal vid 260 mg / kg kroppsvikt med hjälp av en 30 ½ nål fäst vid en 1 ml spruta, och låta djuren att bli helt medvetslös, utan tå reflex eller muskeltonus närvarande.
- När djuret bedövas med användning av sterila kirurgiska sax eller en skalpell, skär horisontellt över torson hos djuret direkt under bröstkorgen och sedan vertikalt till armhålan längs sidan av djuret, Exponera hjärtat. Utför en terminal hjärtpunktion med användning av en 30 ½ G nål fäst till en 1 ml spruta spolas med 4% natriumcitrat i DPBS för att förhindra koagulering, erhålla så mycket blod som möjligt från djuret.
- Ta lungorna från djuret genom att skära av luftstrupen med kirurgisk sax eller en skalpell och omedelbart placera i en vävnadsodling kassett och i 10% formalin.
- Ta bort den primära prostatatumör från djuret genom individuellt kapar några blodkärl kopplade till tumören och se några ytterligare organ såsom sädesledaren eller sädesblåsor bifogas.
- Notera vikten och storleken av tumören. Mäta vikten av tumören i gram på en laboratorieskala. Med hjälp av skjutmått, mäta längden på den längsta diametern av tumören i centimeter, och den motsvarande vinkelräta axeln. Multiplicera dessa värden för att erhålla tumörstorlek. Beroende på avsedd användning, genast knäppa frysa i flytande kväve, och / eller plats itill en vävnad kassett i 10% formalin.
- Exponera höft-och knäledsartros med kirurgisk sax eller en skalpell, och koppla loss benlederna, är noga med att hålla lårbenet intakt. Ta lårben från djuret och placera i steril koksaltlösning.
- Skaffa något annat organ eller material av intresse, och göra sig av djur enligt din institutets anvisningar. I synnerhet regionala lymfkörtlar tenderar att ha metastaser, tenderar att förstoras om härbärgera dem, och kan skördas. Dock bör försiktighet iakttas eftersom detta kan påverkas av förändringar i hydrostatiskt tryck som orsakas av det kirurgiska ingreppet.
5. Bearbetning och immunfärgning av lungvävnadsprover
- Inom 24-48 timmar att placera vävnad i 10% formalin i PBS, bädda lungorna in i paraffin.
- Avsnitt lungorna vid 45 ìm steg sektioner, med 2-3 angränsande 4 ìm lungvävnadssnitt.
- Om GFP-positiva celler användes (rekommenderas), utför immunfärgningför GFP. Om inte, utför standard hematoxylin och eosin (H & E) färgning.
OBS: Dako Envision + Kit kombinerat med GFP-antikropp från Invitrogen har använts med framgång i enlighet med tillverkarens instruktioner, men detta kan ändras till valfri immunohistokemi förfarandet.
- Betyg metastaser i blindad. Om GFP-positiva, kommer tumörceller färgas brun förutom att ha stora och distinkta kärnor. När första poäng metastaser, konsultera en patolog för att säkerställa korrekt bristningar och använda H & E färgade lungvävnad för att bekräfta närvaron av tumörceller, och inte infiltrerande immunceller.
6. Identifiering av cirkulerande tumörceller från blod och benmärg
- Lägg allt blod som samlats från obduktion till ett 1,5 ml centrifugrör. Centrifugera 5 min vid 800 x g..
- Ta plasma och tillsätt 1 ml ACK lyseringsbuffert (154.95 mM ammoniumklorid, 9,99 mM kalium Bicarbonate, 0,0995 mM EDTA). Tillåt blodet att stå vid rumstemperatur 3-5 minuter.
- Centrifugera 5 min vid 800 x g..
- Avlägsna supernatanten och tillsätt 1 ml av cellkulturmedia som innehåller antibiotika. Lägg celler till en T75 kolv innehållande 9 ml cellodlingsmedia.
- Kultur-celler vid 37 ° C i en fuktad atmosfär innehållande 5% CO2 under 10 dagar, kontroll med avseende på närvaron av CTCs var 2-3 dagar.
- För benmärg, ta bort all muskelvävnad från lårben med hjälp av en sax, ett rakblad eller skalpell. Avlägsna de ändar av ben, så nära ändarna som möjligt.
- Med hjälp av en 23 ¾ G nål försiktigt mata ut benmärg från lårbenet till ett 1,5 ml centrifugrör.
- Lägg till 1 ml av cellodlingsmedia och försiktigt pipet väl för att blanda.
- Lägg celler till en T75 kolv innehållande 9 ml cellodlingsmedia.
7. Molekylär karakterisering av tumörer
- För polymeraskedjereaktionen (PCR)-analyss, är tumörprover som snabbfrystes i flytande kväve först pulveriseras på torr is och homogeniserades därefter med användning av en vävnadshomogenisator under 3-5 min med 1 ml TRIzol. TRIzol extraktionen utförs enligt tillverkarens instruktioner. Rena RNA med användning av RNeasy RNA-isoleringskit enligt tillverkarens instruktioner. Utföra cDNA syntes och kvantitativ realtids-PCR (QRT / PCR) med hjälp TaqMan reagens enligt tillverkarens anvisningar rekommenderas men kan modifieras för varje PCR-metod som för närvarande används.
- För Western blot-analyser, homogenisera vävnaden med användning av en vävnadshomogenisator i 3-5 min med 1 ml lyseringsbuffert: PBS (137 mM NaCl, 10 mM Na-fosfat, 2,7 mM KCl), 0,5% Triton X-100, 1 mM EDTA, 2,5 mM natriumpyrofosfat, 1 mM β-glycerofosfat, med tillsats av proteasinhibitorcocktail, fosfat hämmar cocktails 2 och 3, 10 mM natriumfluorid och 1 mM natriumortovanadat. Cellysatet blandningen placeras i ett 1,5 ml centrifugrör.
- Centrifuge cellysat blandningen under 10 min vid 13000 x g..
- Avlägsna supernatanten och placera i ett nytt 1,5 ml centrifugrör och centrifugeras på nytt i 10 min vid 13000 x g.. Om cellfragment är fortfarande närvarande, kan utföras ytterligare ett centrifugeringssteg.
- Avlägsna supernatanten och utföra en Western blot enligt normala laboratorieförhållanden.
Representative Results
För detta experiment visar vi en representativ grupp av möss som erhölls vid dessa kirurgiska procedurer. Fem möss implanterades med GFP-positiva PC3-M-celler innehållande en kontrollvektor. Tumörer fick växa under sex veckor, och därefter utvärderades flera parametrar. I figurerna 1A och 1B visar vi förändringen i kroppsvikt och konsumtionen av möss mat, respektive. Det finns en liten dopp i kroppsvikt och foderkonsumtion omkring dagen för kirurgi på grund av anestesi. Under försöket, ökar kroppsvikten långsamt efter operationen, och sedan börjar sjunka mot slutet av experimentet som tumörbörda når en kritisk nivå. Detta matchas av livsmedelskonsumtionen i dessa möss.
I figurerna 2A och 2B, är representativa tumörstorlekar erhållna bilden. Enskilda tumörstorlekar varierar, men i genomsnitt uppnår vi tumörer av cirka 1 gram, mednormal varians mellan 0,5-1,5 g, och en tumörstorlek på 1 cm 2, med en normal variation på 0,5-1,5 cm 2. Även om storleken på tumörerna varierar, behöver dessa inte korrelerar med antalet resulte metastaser, som visas både i detta papper och våra tidigare publicerade verk 10. Men från denna modell kan en bestämning av effekten av läkemedelsbehandling eller molekylära förändringar på tumörvikt och storlek. En viktig faktor i denna modell är då lämplig slutpunkt för experimentet är. I fig. 2C och 2D visar vi förändringar i tumörvikt och tumörstorleken i en viss PC3-M cellinje stabilt transfekterade med GFP och en kontrollvektor vid 4 veckor och 6 veckor. Under de senaste två veckorna, ökade den genomsnittliga tumörvikten 2,7 gånger, och tumörstorleken 1,9 gånger. Detta visar att tillägg av 1-2 extra veckor på experimentet kan dramatiskt påverka resultaten. Som en mängd faktorer kan förändra tillväxt av tumörer, inklusiveålder och storlek på möss, antalet passager av cellerna, etc. vi inte rekommendera avslutande experiment tills synliga tumörer observeras i de flesta mössen.
I figurerna 3A-3C, är antalet metastaser kvantifierades tre olika sätt. I figur 3A är det totala antalet GFP-positiva humana PCa celler representerade. I figur 3B, antalet cell loci, eller platser där metastaser insättningar före, visas. Slutligen i fig. 3C, antalet distinkta metastaser, som definieras av ett klart bunden grupp av celler som visar 5 eller flera GFP-positiva humana PCa celler, visas. Representativa bilder av dessa olika betingelser visas i figurerna 4A-4D. I figur 4A, är en individuell cell vid 40x magnitud markerad med en pil. Notera den bruna fläckar och stora tydliga kärnor. En intilliggande lungsektionen färgas med H & E färgningvisas i figur 4B, vilket bekräftar att utan GFP, är detektering av cancerceller fortfarande lätt att uppnå. Denna bild är tagen vid 40x magnitud och cellen är markerad med en pil. I figur 4C är flera loci av varierande cellnummer på 10x storlek visas och varje locus markeras med en pil. . Slutligen i fig. 4D är en metastatisk deposition på 10 celler visas. Hur dessa metoder påverka data visas genom skillnader i mus 1 och mus 3. Mus 1 har ett lägre antal totala celler i lungan, med ett genomsnitt på 21,5 celler per lunga sektion, jämfört med mus 3, som har ett genomsnitt av 700 celler per lunga sektion. Dock har Mouse 3 färre loci, eller platser där celler är närvarande än Mouse 1. Mus 3 har relativt få platser i metastasering, men antalet celler per område är mycket hög på 82 celler per loci på grund av flera mycket stora cell nummer metastaser. Däremot mus 1 har mer unika loci, men betydligt fewer celler per plats på bara ett genomsnitt av två celler per plats. Dessa olika parametrar kan belysa kinetiken av celler handel till lungan och deras förmåga att börja växa och föröka sig.
Dessutom, i figur 3D visar vi förändringar i total metastaserande celler per lungan hos möss obduceras vid fyra kontra sex veckor. Såsom beskrivs i figurerna 2C och 2D, är signifikanta förändringar observerades i tumörvikt och-storlek i de slutliga två veckorna av ett experiment. Detta rekapituleras i fig. 3D. Möss obduceras på fyra veckor visade ingen metastaserande utveckling, medan möss vid 6 veckor visade metastaserande celler i alla möss utvärderade. Detta visar ytterligare vikten av att säkerställa möss obduktion utförs på ett sent stadium endpoint för att säkerställa bildandet av metastaser har inträffat.
En extra mätning i denna modell är molekylära förändringar som sker inne i primärtumören. I fig 5A-5C visar vi tre exempel QRT / PCR-experiment som mäter tre gener av intresse för metastasutvecklingen, matrixmetalloproteinas typ 2 (MMP-2), matrixmetalloproteinas typ 9 (MMP-9), och värmechockprotein 27 (HSP27) respektive. Varje gen av intresse mäts via QRT / PCR kan detekteras med användning av denna teknik. Dessutom kan proteinnivåer kvantifieras med hjälp av Western blot-förfaranden.
Figur 1. Observerade kroppsvikt och födointag hos djur. AB) Kroppsvikt i gram, eller genomsnittlig livsmedelskonsumtion per mus per dag i gram, registreras under hela experimentet och visas i A) och B) respektive.
fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50873/50873fig2.jpg "/>
Figur 2. Tumörstorlek och tumörvikt i enskilda och grupper av möss. AB) Tumör vikt i gram och tumörstorlek i centimeter i kvadrat av fem representativa kontrollmöss och medelvärdet av de fem möss i slutet av sex veckor visas i A) och B) resp. CD) En jämförelse av tumörvikt i gram och tumörstorlek i centimeter i kvadrat mellan grupper av möss obducerades på fyra och sex veckor. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3. Metastasering i enskilda och grupper av möss. AC) Den genomsnittliga metastaser spread per lung avsnitt för fem individuella möss och medelvärdet av de fem möss i slutet av sex veckor företräddes antingen totala antalet celler (A), platser för metastaserande celler (B), eller distinkta metastaser enligt definitionen i 5 + celler i en klart definierad kluster (C). D) En jämförelse av det genomsnittliga antalet metastaserande celler per lungsektionen per mus mellan möss obducerades på fyra och sex veckor. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 4. Representativa bilder av lungmetastaser. A) En individuell GFP positiva lungcell vid 40X mål markeras med en pil. B) En angränsande lungaavsnitt från A), som visar samma cell under H & E färgning. C) En lungsektionen vid 10X objektiv med sju individuella loci innehåller varierande antal celler. D) En tydlig metastaser vid 10X objektiv innehåller 10 cancerceller klart definierade som en grupp.
Figur 5. PCR-analys av tre metastatiska gener av intresse. QRT / PCR utfördes på individuella tumörprover uppsamlade från möss vid sex veckor. Relativa mRNA-transkriptnivåer av MMP-2 (A), MMP-9 (B), och HSP27 (C) mäts, normaliserad till GAPDH. Klicka här för att visa en större bild .
Discussion
I denna skrift ger vi en ny musmodell av mänskliga PCa metastaser. I denna modell är den mänskliga PCa cellinjer PC3-M ortotopiskt implanteras direkt i prostata hos BALB / c-atymiska möss och tumörer fick utvecklas under 4-6 veckor. I resultaten avsnittet representativt visar vi exempel på data som kan samlas in, inklusive mus-vikt och livsmedelskonsumtion, tumörstorlek och vikt, molekylära egenskaper hos tumören, och bildning av distinkta metastas till lungan. Dessutom kan studeras ett stort antal extra utgångar beroende på särskilda forskningsintressen. Ett exempel är förekomsten av CTCs till blodet och benmärgen. Som CTCs är en relativt sällsynt händelse (vi observerar CTCs i cirka 5-20% av kontrolldjur), vi var inte förvånad över att ingen av de fem möss i dessa experiment utvecklade CTCs. Vårt laboratorium har också använt denna modell för att fastställa förändringar i cellulär adhesion genom att mäta kärn cellmorfologin iprostatavävnaden 10. Vi har också använt denna modell för att utvärdera primära tumör proliferation och apoptos status med hjälp av Ki67 och Tunel färgning av prostatatumör 14.
Förutom den mängd olika datautgångar som kan uppnås, kan denna modell användas för att bestämma effekterna av både förändringar i proteinuttryck samt småmolekylära läkemedel. Jämfört med många spontana och inducerade modeller av mänskligt PCa metastaser, det finns en högre handläggningstid på bara 4-6 veckor. Andra modeller med en hög handläggningstid, exempelvis svansvenen eller intercardiac injektion modeller, har begränsningar av någon primärtumör, alltså inte helt rekapitulera kliniken metastaserande kaskad. I vår modell, måste tumörceller undkomma den primära platsen för ursprung, in och överleva i cirkulationssystemet, och implantat till en sekundär plats. Detta ger ytterligare steg där en terapeutisk intervention eller förändringar i proteinuttryck kan leverera en effekt. Addinellt bör närvaron av den primära tumören möjliggöra enkel tillämpning av denna modell till nya avbildningstekniker, såsom luciferas-baserad IVIS 16-17.
Trots de många olika fördelar med denna modell, det finns också flera begränsningar att beakta. Allt fler studier visar betydelsen av immunsystemet i tumormicroenvironmenten och utveckling av metastaser 18. I denna modell på grund av användningen av en atymisk gnagare, inte är möjligt att förmågan att bedöma effekterna av immunförsvaret. En andra begränsning är att det saknas androgen responsiveness i PC3-M-celler. Vid första diagnos av PCa, patienter ofta genomgår androgenbehandling som en första linjens behandling. Dock kommer patienterna så småningom bli androgen-resistent och tumörer kommer att börja växa igen. Som PC3-M-celler saknar androgenreceptorn, den här modellen mäter enbart effekten av läkemedelsbehandling eller proteinmodulering på postandrogenresistent cancer. Även om detta är en begränsning, är androgen-lyhörd PCa närvarande väl hanterbar och har en mängd olika effektiva behandlingsalternativ, och därmed androgen-resistent cancer har blivit mer framträdande studeras. Denna modell också specifikt använder en inavlad stam av möss, vilket minimerar mus till mus-variabilitet. Dock kan denna stam vara särskilt lyhörda för särskilda proteiner eller små molekyler, så försiktighet bör iakttas vid extrapolering av dessa data till kliniken.
Även om denna modell ger en effektiv mätning av läkemedlets effektivitet på ett snabbt produktionstid av 4-6 veckor, kan detta inte hänsyn till långsiktiga läkemedelsdoseringseffekter. Efter långvarig exponering för många för närvarande tillgängliga behandlingar, kan patienterna återvända med läkemedelsresistenta cancer många år efter behandlingen. Den snabba vändningen av denna teknik tillåter inte effektiv modellering av möjligheten för en tumör att bli resistenta mot behandling. Men med modulering av denna exexperimentera, kan behandlingsresistenta humana prostatacancerceller implanteras, och effektiviteten i en andra generationens terapeutiskt att förebygga PCa tumörtillväxt och metastasering kan modelleras. Dessutom, om en grupp som försökte att studera de molekylära förändringar i en primärtumör över tid, en mer långsiktig modell såsom TRAMP modellen kommer sannolikt att bli mer effektiva för dessa studier.
En annan begränsning i denna modell är att sprida distinkta metastaser endast till lymfkörtlar och lungor hos djuren. Båda dessa platser är täta och kliniskt relevanta anläggningar metastaser, vilket framgår av humana varma obduktionsstudier 19. Dock utgör kliniskt benmetastaser ett framträdande inslag i mänsklig PCa, och därmed modellerna rekapitulera detta är av intresse. Tyvärr, dessa är svåra att sammanfatta i en musmodell, med mycket få modeller som visar skelettmetastaser utan svansvenen, intercardial injektion eller direkt implantation itill benet 20. Alltså, om inriktning på benet är av central experimentell betydelse, kan en annan modell vara effektivare. Men denna modell ger ett visst mått av trafik till benet i form av benmärg cirkulerande tumörceller.
Trots dessa begränsningar är denna teknik en kraftfull modell av human PCa. Förmågan att mäta effekter på både den primära tumören samt metastaserad bildningen på kort handläggningstid ger en mängd olika tillämpningar. I denna modell, måste celler undkomma den primära organ, in och överleva i blodet, och implantat i en sekundär plats, rekapitulera den process hos människor. Den extra mätning av molekylära egenskaper hos den primära tumören, förändringar i cell morfologi, och närvaron av cirkulerande tumörceller ger en bred fläkt av information från en modell. Detta förfarande kan användas både i samband med läkemedelsforskning samt att studera förändringar i tumörbiologi.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats med bidrag från National Institutes of Health (NIH) till RCB, CA122985 och prostata SPORE CA90386, och till JMP, NIH T32 AG000260 "Drug Discovery Utbildning i åldersrelaterade sjukdomar", och av Walter S. Och Lucienne Driskill Graduate Program i Life Sciences vid Northwestern University. Vi vill också tacka Mouse Fenotypning och histologi laboratorium och patologi Core Facility vid Northwestern University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 1 ml Syringe, Tuberculin, Slip-Tip | Becton Dickinson | 309659 | |
| 23 G 3/4 Precison Glide Needle | Becton Dickinson | 305143 | |
| 30 G 1/2 Precision Glide Needle | Becton Dickinson | 305106 | |
| Alcohol Wipes | Triad | 10-3001 | |
| Autoclip Applier, 9mm, Stainless Steel | Becton Dickinson | 427630 | |
| Clips, 9mm | VWR | 15431-673 | |
| Convertors Polyline Towel (Sterile) | Cardinal Health | 3520 | |
| Cotton-Tipped Applicators, 6 inch, Sterile, Wooden Shaft | Fisher | 23-400-125 | |
| Curad Sterile Cotton Balls | VWR | 500043-544 | |
| Derf Needle Holder, Integra Miltex, 121 mm (4 3/4") | VWR | 95039-192 | |
| Duraprene SMT Sterile Neoprene Powder-Free Surgical Gloves | Cardinal Health | 2D72PN70 | |
| Germinator 500 | Cell Point Scientific | SN 7030 | |
| Kendall Monojet Needles, 1/2 cc syringe with permanent 28 G 1/2 needle | Tyco | 1180528012 | |
| Medium Heating Pad | VWR | 100229-094 | |
| Merit Iris Scissors, Sklar, 11.4 cm (4 1/2") | VWR | 94000-000 | |
| Metric/English Vernier Caliper | VWR | 19155-057 | |
| PDS*11 Violet Monofilament Sutcher 4-0, 27" | Ethicon | Z304H | |
| VetEquip Inhalation Anesthesia System | Contact Your Animal Facility for Availability | ||
| VWR Premium Tissue Cassettes | VWR | 18000-010 | |
| VWR Specimen Forceps, Serrated, Straight, 114 mm (4 1/2") | VWR | 82027-440 | |
| Reagents | |||
| Betadine Surgical Scrub | Fisher Healthcare | 19-027132 | |
| Buprenex | Controlled Substance - Obtain from Animal Facility | ||
| Dako DAB + Chromagen | Dako | K3468 | |
| Dako Envision + System HRP-Labeled Polymer, Anti-Rabbit | Dako | K4003 | |
| Dako Envision Kit Protein Block | Dako | X0909 | |
| Formalin | VWR | 95042-908 | |
| GFP Antibody | Invitrogen | A11122 | |
| Hematoxylin | Mayer | MH580-2.5L | |
| Meloxican | Obtain from Animal Facility | ||
| Nembutal | Controlled Substance - Obtain from Animal Facility | ||
| Rneasy RNA Isolation Kit | Qiagen | 74104 | |
| Sterile Saline | Obtain from Animal Facility | ||
| Taqman Reverse Transcription Reagents | Life Technologies | N8080234 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4304437 | |
| Trizol | Invitrogen | 10296 | |
References
- Jemal, A., et al.
- Shappell, S. B., et al. Prostate pathology of genetically engineered mice: definitions and classification. The consensus report from the Bar Harbor meeting of the Mouse Models of Human Cancer Consortium Prostate Pathology Committee. Cancer Res. 64, 2270-2305 (2004).
- Rangarajan, A., Weinberg, R. A. Opinion: Comparative biology of mouse versus human cells: modelling human cancer in mice. Nat. Rev. Cancer. 3, 952-959 (2003).
- Pollard, M. Lobund-Wistar rat model of prostate cancer in man. Prostate. 37, 1-4 (1998).
- Gingrich, J. R., et al. Androgen-independent prostate cancer progression in the TRAMP model. Cancer Res. 57, 4687-4691 (1997).
- Gingrich, J. R., et al. Metastatic prostate cancer in a transgenic mouse. Cancer Res. 56, 4096-4102 (1996).
- Yang, M., et al. A fluorescent orthotopic bone metastasis model of human prostate cancer. Cancer Res. 59, 781-786 (1999).
- Wu, T. T., et al. Establishing human prostate cancer cell xenografts in bone: induction of osteoblastic reaction by prostate-specific antigen-producing tumors in athymic and SCID/bg mice using LNCaP and lineage-derived metastatic sublines. Int. J. Cancer. 77, 887-894 (1998).
- Dolman, C. S., et al. Suppression of human prostate carcinoma metastases in severe combined immunodeficient mice by interleukin 2 immunocytokine therapy. Clin. Cancer Res. 4, 2551-2557 (1998).
- Lakshman, M., et al. Dietary genistein inhibits metastasis of human prostate cancer in mice. Cancer Res. 68, 2024-2032 (2008).
- Messina, M. J., Persky, V., Setchell, K. D., Barnes, S. Soy intake and cancer risk: a review of the in vitro and in vivo data. Nutr. Cancer. 21, 113-131 (1080).
- Adlercreutz, H., Markkanen, H., Watanabe, S. Plasma concentrations of phyto-oestrogens in Japanese men. Lancet. 342, 1209-1210 (1993).
- Xu, L., et al. MEK4 function, genistein treatment, and invasion of human prostate cancer cells. J. Natl. Cancer Inst. 101, 1141-1155 (2009).
- Lakshman, M., et al. Endoglin suppresses human prostate cancer metastasis. Clin. Exp. Metastasis. 28, 39-53 (2011).
- Craft, C. S., Romero, D., Vary, C. P., Bergan, R. C. Endoglin inhibits prostate cancer motility via activation of the ALK2-Smad1 pathway. Oncogene. 26, 7240-7250 (2007).
- Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J. Vis. Exp. , e1210 (2009).
- Cordero, A. B., Kwon, Y., Hua, X., Godwin, A. K. In vivo imaging and therapeutic treatments in an orthotopic mouse model of ovarian cancer. J. Vis. Exp. , e2125 (2010).
- Buijs, J. T., vander Pluijm, G. Osteotropic cancers: from primary tumor to bone. Cancer Lett. 273, 177-193 (2009).
- Rubin, M. A., et al. Rapid ("warm") autopsy study for procurement of metastatic prostate cancer. Clin. Cancer Res. 6, 1038-1045 (2000).
- Singh, A. S., Figg, W. D. In vivo models of prostate cancer metastasis to bone. J. Urol. 174, 820-826 (2005).
