Gebruik van pHluorine om de dynamiek van Axon Guidance Receptoren in celcultuur en in het kuikenembryo te beoordelen
Summary
We beschrijven hier het gebruik van een pH-gevoelige groene fluorescerende eiwitvariant, pHluorine, om de spatio-temporele dynamiek van axongeleidingsreceptoren aan het celoppervlak te bestuderen. De pHluorine-gelabelde receptor wordt zowel in celkweek als in vivouitgedrukt met behulp van elektroporatie van het kuikenembryo.
Abstract
Tijdens de ontwikkeling spelen axongeleidingsreceptoren een cruciale rol bij het reguleren van axongevoeligheid voor zowel aantrekkelijke als afstotende signalen. Inderdaad, activering van de geleidingsreceptoren is de eerste stap van de signaleringsmechanismen waardoor axonpunten, de groeikegels, kunnen reageren op de liganden. Als zodanig is de modulatie van hun beschikbaarheid aan het celoppervlak een van de mechanismen die deelnemen aan het instellen van de gevoeligheid van de groeikegel. We beschrijven hier een methode om de spatio-temporale celoppervlakdynamiek van een axongeleidingsreceptor zowel in vitro als in vivo in het zich ontwikkelende kuikenmerg precies te visualiseren. We hebben gebruik gemaakt van de pH-afhankelijke fluorescentie-eigenschap van een groene fluorescerende eiwit (GFP) variant om specifiek de fractie van de axongeleidingsreceptor te detecteren die is gericht op het plasmamembraan. We beschrijven eerst de in vitro validatie van dergelijke pH-afhankelijke constructies en we beschrijven verder het gebruik ervan in vivo, in het kuiken ruggenmergakkoord, om de spatio-temporele dynamiek van de axongeleidingsreceptor van belang te beoordelen.
Introduction
Tijdens hun navigatie integreren axonen meerdere omgevingssignalen die hen naar hun doel leiden. Deze signalen activeren geleidingsreceptoren aan het oppervlak van axonterminals, de groeikegels, die op hun beurt een geschikte signaleringsroute initiëren. De temporele en ruimtelijke regulatie van de celoppervlakverdeling van de receptoren is dus van cruciaal belang om de gevoeligheid van de groeikegel in te stellen1. In deze context is midline crossing door commissural axons een uitstekend model om de regulering van receptorceloppervlakniveaus te onderzoeken. In het zich ontwikkelende ruggenmerg worden commissural axonen in eerste instantie aangetrokken naar de ventrale vloerplaat waar ze de middellijn oversteken. Na het oversteken verliezen ze hun reactievermogen op de vloerplaattrekkers en krijgen ze reactie op vloerplaatafstotende middelen, zodat ze de vloerplaat kunnen verlaten en naar hun eindbestemming kunnen navigeren in de contralaterale kant van het zenuwstelsel2,3. Regulering van de beschikbaarheid van receptoren aan het groeikegeloppervlak is een van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de omschakeling van responsiviteit naar middellijnsignalen4,5. Selectieve monitoring van de receptoren die aanwezig zijn op het plasmamembraan van groeikegels is dus van het grootste belang. We beschrijven hier een methode gebaseerd op de pH-afhankelijke fluorescentie-eigenschap van een groene fluorescerende eiwit (GFP) variant om specifiek de axongeleidingsreceptoren te visualiseren die in vitro en in vivozijn gericht op het plasmamembraan , in het zich ontwikkelende kuikenmerg.
Rothman en collega’s ontworpen door puntmutaties pH-gevoelige varianten van GFP met inbegrip van de ecliptica pHluorine6. Ecliptica pHluorine heeft de eigenschap nietfluorescent te zijn bij blootstelling aan zure pH (<6), terwijl het fluorescerend is bij een neutrale pH. Hierdoor kunnen niet-fluorescerende receptoren die gelokaliseerd zijn in intracellulaire zure compartimenten(d.w.z. endosomen, blaasjes) worden onderscheiden van fluorescerende receptoren die in het plasmamembraan zijn opgenomen en dus worden blootgesteld aan de extracellulaire neutrale pH7. We hebben hiervan gebruik gemaakt om de plasmamembraanlokalisatie van plexineA1 te controleren, een axongeleidingsreceptor die de reactie van de groeikegel op de middellijnafstotende semaphorine 3B5 (figuur 1A)bemiddelt. We beschrijven hier de in vitro karakterisering van een pHluorine-plexineA1 constructie, samen met in ovo elektroporatie8-10 van deze constructie in het zich ontwikkelende kuiken ruggenmerg gevolgd door de microscopische analyse van cryosecties die het mogelijk maken om de axongeleidingsreceptordynamiek in vivo te volgen met zowel ruimtelijke als temporele resoluties.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol biedt een stapsgewijze procedure om de dynamiek van een axongeleidingsreceptor te volgen, zowel in celkweek als in de ontwikkelingscontext van het ruggenmerg van het kuikenembryo.
Om een de novo pHluorine gelabeld eiwit te ontwerpen, moeten twee punten worden overwogen met betrekking tot de kloonstrategie. Ten eerste moet de pHluorine-tag worden blootgesteld aan het lumen van de zure endosomen en bijgevolg aan het extracellulaire compartiment om de plasmamembraanreceptorp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken Homaira Nawabi, Frederic Moret en Isabelle Sanyas voor hun hulp. Dit werk wordt ondersteund door CNRS, Association Francaise contre les Myopathies (AFM), ANR YADDLE, Labex DevWeCan, Labex Cortex, ERC YODA to V.C.; C.D-B en A.J worden ondersteund door respectievelijk een La Ligue contre le cancer en Labex DevWeCan fellowships.
Materials
| COS7 cells | ATCC | CRL-1651 | |
| DMEM GlutaMAX | GIBCO | 61965-026 | |
| Sodium pyruvate | GIBCO | 11360-039 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO | 10270-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Exgen500 reagent | Euromedex Fermentas | ET0250 | |
| PBS -Ca2+ -Mg2+ | GIBCO | 14190-094 | |
| Fast green dye | Sigma | F7252 | |
| 32% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy | 15714-S | Dilute extemporaneously in PBS to achieve a 4% solution |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7041 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Cryomount | Histolab | 00890 | |
| Hoechst 34580 | Invitrogen | H21486 | |
| Mowiol 4-88 | Fluka | 81381 | |
| Consumables | |||
| Bottom-glass 35 mm dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| 5 ml Syringe | Terumo | SS-05S | |
| Needles 0.9 mm x 25 mm | Terumo | NN-2025R | |
| Capillaries | CML | PP230PO | capillaries are stretched manually in the flame |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | 4951PLUS | |
| Material | |||
| Curved scissors | FST | 129-10 | |
| Microscalpel | FST | 10316-14 | |
| Forceps | FST | Dumont #5 REF#11254 | |
| Equipment/software | |||
| Time lapse microscope | Zeiss | Observer 1 | |
| Temp module S | PECON for Zeiss | ||
| CO2 module S | PECON for Zeiss | ||
| Metamorph software | Metamorph | ||
| Eggs incubator | Sanyo | MIR154 | |
| Electroporator apparatus | Nepa Gene CO., LTD | CUY21 | |
| Electrodes | Nepa Gene CO., LTD | CUY611P7-4 | 4 mm platinum electrodes |
| Fluorescence stereomicroscope | LEICA | MZ10F | |
| Cryostat | MICROM | HM550 | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000, X81 | |
| Fluoview software | Olympus | ||
| CLC Main Workbench software | CLC Bio | ||
References
- Winckler, B., Mellman, I. Trafficking guidance receptors. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, (2010).
- Jacob, T. C., et al. . J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).
- Nawabi, H., Castellani, V. Axonal commissures in the central nervous system: how to cross the midline. Cell Mol. Life Sci. 68, 2539-2553 (2011).
- Keleman, K., Ribeiro, C., Dickson, B. J. Comm function in commissural axon guidance: cell-autonomous sorting of Robo in vivo. Nat. Neurosci. 8, 156-163 (2005).
- Nawabi, H., et al. A midline switch of receptor processing regulates commissural axon guidance in vertebrates. Genes Dev. 24, 396-410 (2010).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Miesenbock, G. Synapto-pHluorins: genetically encoded reporters of synaptic transmission. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 213-217 (2012).
- Avraham, O., Zisman, S., Hadas, Y., Vald, L., Klar, A. Deciphering axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the chick neural tube utilizing in ovo electroporation. J. Vis. Exp. (39), 1792-17 (2010).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos. J. Vis. Exp. (9), (2007).
- Wilson, N. H., Stoeckli, E. T. In ovo electroporation of miRNA-based plasmids in the developing neural tube and assessment of phenotypes by DiI injection in open-book preparations. J. Vis. Exp. (68), (2012).
- Rohm, B., Ottemeyer, A., Lohrum, M., Puschel, A. W. Plexin/neuropilin complexes mediate repulsion by the axonal guidance signal semaphorin 3A. Mech. Dev. 93, 95-104 (2000).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. J. Vis. Exp. (8), (2007).
- Alberts, P., et al. Cdc42 and actin control polarized expression of TI-VAMP vesicles to neuronal growth cones and their fusion with the plasma membrane. Mol. Biol. Cell. 17, 1194-1203 (2006).
- Perret, E., Lakkaraju, A., Deborde, S., Schreiner, R., Rodriguez-Boulan, E. Evolving endosomes: how many varieties and why. Curr. Opin. Cell Biol. 17, 423-434 (2005).
- Li, Y., et al. Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons. J. Vis. Exp. (69), (2012).
- Tojima, T., Itofusa, R., Kamiguchi, H. Asymmetric clathrin-mediated endocytosis drives repulsive growth cone guidance. Neuron. 66, 370-377 (2010).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J. Vis. Exp. (54), 3024-30 (2011).
- Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Dev. Biol. 7 (107), (2007).
- Holzhausen, L. C., Lewis, A. A., Cheong, K. K., Brockerhoff, S. E. Differential role for synaptojanin 1 in rod and cone photoreceptors. J. Comp. Neurol. 517, 633-644 (2009).
- Shang, Y., Claridge-Chang, A., Sjulson, L., Pypaert, M., Miesenbock, G. Excitatory local circuits and their implications for olfactory processing in the fly antennal lobe. Cell. 128, 601-612 (2007).
- Dittman, J. S., Kaplan, J. M. Factors regulating the abundance and localization of synaptobrevin in the plasma membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11399-11404 (2006).
- Bozza, T., McGann, J. P., Mombaerts, P., Wachowiak, M. In vivo imaging of neuronal activity by targeted expression of a genetically encoded probe in the mouse. Neuron. 42, 9-21 (2004).
- Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. Real-time measurements of vesicle-SNARE recycling in synapses of the central nervous system. Nat. Cell. Biol. 2, 197-204 (2000).
- Stark, D. A., Kasemeier-Kulesa, J. C., Kulesa, P. M. Photoactivation cell labeling for cell tracing in avian development. CSH Protoc.. 2008, (2008).
- Hildick, K. L., Gonzalez-Gonzalez, I. M., Jaskolski, F., Henley, J. M. Lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching. J. Vis. Exp. (60), (2012).
- Hanson, G. T., et al. Green fluorescent protein variants as ratiometric dual emission pH sensors. 1. Structural characterization and preliminary application. Biochemistry. 41, 15477-15488 (2002).
- Rose, T., Schoenenberger, P., Jezek, K., Oertner, T. G. Developmental refinement of vesicle cycling at schaffer collateral synapses. Neuron. 77, 1109-1121 (2013).
- Li, Y., Tsien, R. W. pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity. Nat. Neurosci. 15, 1047-1053 (2012).
- de Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons. J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).
