Summary
Descrevemos aqui o uso de uma variante de proteína fluorescente verde sensível ao pH, pHluorin, para estudar a dinâmica espátula-temporal dos receptores de orientação de axônio que traficam na superfície celular. O receptor com marca de phluorina é expresso tanto na cultura celular quanto in vivo,usando eletroporação do embrião de filhote.
Abstract
Durante o desenvolvimento, os receptores de orientação do axônio desempenham um papel crucial na regulação da sensibilidade dos axônios a pistas atraentes e repulsivas. De fato, a ativação dos receptores de orientação é o primeiro passo dos mecanismos de sinalização que permitem pontas de axônio, os cones de crescimento, para responder aos ligantes. Como tal, a modulação de sua disponibilidade na superfície celular é um dos mecanismos que participam na definição da sensibilidade do cone de crescimento. Descrevemos aqui um método para visualizar precisamente a dinâmica da superfície celular espócica de um receptor de orientação de axônio tanto in vitro quanto in vivo na medula espinhal do pintinho em desenvolvimento. Aproveitamos a propriedade de fluorescência dependente do pH de uma variante de proteína fluorescente verde (GFP) para detectar especificamente a fração do receptor de orientação do axônio que é endereçado à membrana plasmática. Primeiro descrevemos a validação in vitro de tais construtos dependentes de pH e detalhamos ainda mais seu uso in vivo, na corda vertebral do pintinho, para avaliar a dinâmica espátula-temporal do receptor de orientação do axônio de interesse.
Introduction
Durante sua navegação, os axônios integram várias pistas ambientais que os guiam em direção ao seu alvo. Essas pistas ativam receptores de orientação na superfície dos terminais de axônio, os cones de crescimento, que por sua vez iniciam uma via de sinalização apropriada. Assim, a regulação temporal e espacial da distribuição da superfície celular dos receptores é fundamental para definir a sensibilidade do cone de crescimento1. Neste contexto, a travessia midline por axônios comissural é um excelente modelo para investigar a regulação dos níveis de superfície das células receptoras. Na medula espinhal em desenvolvimento, os axônios comissural são inicialmente atraídos para a placa do piso ventral onde cruzam a linha média. Após a travessia, eles perdem sua capacidade de resposta aos atrativos da placa de piso e ganham resposta aos repelentes da placa de piso para que possam sair da placa do chão e navegar em direção ao seu destino final no lado contralateral do sistema nervoso2,3. A regulação da disponibilidade do receptor na superfície do cone de crescimento é um dos mecanismos subjacentes à mudança de responsividade para as pistas de linha média4,5. Assim, o monitoramento seletivo dos receptores presentes na membrana plasmática dos cones de crescimento é de grande importância. Descrevemos aqui um método baseado na propriedade de fluorescência dependente do pH de uma variante de proteína fluorescente verde (GFP) para visualizar especificamente os receptores de orientação do axônio que são abordados à membrana plasmática in vitro e in vivo,na medula espinhal do pintinho em desenvolvimento.
Rothman e colegas projetados por mutações pontuais de variantes sensíveis ao PH do GFP, incluindo o pHluorin eclíptico6. A pHLuorina eclíptica tem a propriedade de não ser fluorescente quando exposta ao pH ácido (<6), enquanto é fluorescente em pH neutro. Isso permite distinguir receptores não fluorescentes localizados em compartimentos ácidos intracelulares (ou seja, endosários, vesículas de tráfico) de receptores fluorescentes incorporados à membrana plasmática e, assim, expostos ao pH neutro extracelular7. Aproveitamos isso para monitorar a localização da membrana plasmática do plexinA1, um receptor de orientação de axônio mediando a resposta do cone de crescimento à semaforina repelente midline 3B5 (Figura 1A). Descrevemos aqui a caracterização in vitro de uma construção pHluorin-plexinA1, juntamente com a eletroporação ovo8-10 deste construto na medula espinhal do filhote em desenvolvimento seguido pela análise microscópica de criosections que permitem acompanhar a dinâmica do receptor de orientação de axônio in vivo com resoluções espaciais e temporais.
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Protocol
1. Estratégia de clonagem para marcar receptor plexina1 com pHluorin
- Escolha um vetor de expressão apropriado como espinha dorsal (por exemplo, o receptor do camundongo plexinA1 expressando vetor, um presente gentil do Dr. Andreas Puschel11).
Nota: Este vetor plexinA1 foi projetado para alcançar uma inserção eficiente do receptor com marca HA ou VSV na membrana plasmática. - Amplie por PCR a sequência de codificação de pHluorin eclíptica usando o plasmídeo adequado como modelo (por exemplo, receptor GABA A marcado por pHluorin, um presente gentil do Dr. Jacob2). Se necessário, adicione um site de restrição ao final de 5' do primer, a fim de facilitar a etapa de clonagem na espinha dorsal.
- Insira a sequência de pHluorin no quadro entre o peptídeo de sinal e a sequência de codificação do receptor usando locais de restrição (por exemplo, locais de restrição NruI/Kpn2I conforme descrito na Figura 1B).
Nota: Como o peptídeo de sinal que garante a mira correta dos receptores é cortado, a pHluorin deve ser colocada depois dele. Isso garante o reconhecimento do peptídeo de sinal e impede o decote da pHLuorin do receptor de interesse. - Sequencia os construtos obtidos para garantir que nenhuma mutação foi introduzida pelo PCR.
2. Caracterização do receptor com pHLuorin in vitro em células COS7
A capacidade da proteína de fusão de atingir a membrana plasmática e sua perda reversível de fluorescência à medida que o pH é reduzido pode ser confirmada usando o procedimento a seguir.
- Dia 1º. Placa 1,5 x 105 células COS7 em um prato de 35 mm em 2 ml de completo Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM - 10% Soro Bovino Fetal - 1 mM piruvato de sódio - 25 U/ml penicilina/stretomicina - 2,5 μg/ml Anfotericina B - pH 7.4).
- Dia 2. Células transfectas:
Nota: As células devem ser 70-80% confluentes.- Prepare 200 μl NaCl 150 mM e adicione 3 μg de DNA, ou seja, o receptor de codificação vetorial com pHluorin. Suavemente vórtice e gire brevemente.
Nota: Um mapa do vetor pHluorin-plexinA1 usado nesses experimentos é mostrado na Figura 1B. - Adicione 10 μl de reagente de transfecção (ou a quantidade apropriada do reagente utilizado). Vórtice imediatamente.
- Incubar 10 min na RT.
- Adicione 200 μl da mistura de reagente/DNA de transfecção às células.
- Mova a placa suavemente para obter a repartição da mistura e coloque as células de volta à incubadora de 37 °C.
- Prepare 200 μl NaCl 150 mM e adicione 3 μg de DNA, ou seja, o receptor de codificação vetorial com pHluorin. Suavemente vórtice e gire brevemente.
- Dia 3. Remova o meio de transfecção e substitua-o por 2 ml de DMEM completo fresco.
- Dia 4. Realizar imagens de células vivas de células transfetugas COS7 pHluorin-plexinA1:
- Prepare duas alíquotas de média completa DMEM e ajuste o pH para 3,5 e 9,5, respectivamente.
Nota: Para uma placa de 35 mm, 1,5 ml de cada solução é necessária para realizar o experimento. - Remova o meio celular e substitua-o por 1 ml de PH médio completo DMEM 7.4.
- Prepare uma seringa de 5 ml com um tipo apropriado de tubulação, a fim de injetar vários componentes diretamente no meio de cultura celular sem abrir a câmara de microscópio.
- Use um módulo que permita a manutenção de uma atmosfera de trabalho úmida de 37 °C e 5% de CO2.
Nota: Uma abordagem alternativa ao uso de uma câmara de CO2 é usar meio tamponado hepes (geralmente na faixa de 10-25 mM de acordo com o tipo de célula). - Coloque as células na câmara e ajuste a tubulação e a seringa.
Nota: O microscópio deve ser equilibrado antes de começar a evitar a deriva mecânica durante a gravação. - Abra o software de imagem e selecione o programa de aquisição multidimensional.
- Encontre células COS7 transfectadas com o objetivo de 40X e marque posição no software para cada uma delas.
- Configure a pilha Z para ter uma aquisição de profundidade de 15 μm (o foco pode mudar ao adicionar mídia na placa).
- Configure a exposição para o filtro GFP e a Fase.
- Configure o tempo de aquisição.
Nota: Para todo o experimento com 5 campos de interesse, a aquisição a cada 20 segundos por 10 min deve ser suficiente. - Inicie a aquisição e tire 5 imagens de controle no meio DMEM pH 7.4.
- Pausar a aquisição, injetar 1,25 ml de pH 3.5 DMEM completo para alcançar um pH de 5,5 no meio de cultura, marcar evento no software e retomar a aquisição para mais 5 pontos de tempo.
Nota: A fluorescência verde deve desaparecer progressivamente. - Pausar a aquisição, injetar 1,2 ml de pH 9.5 DMEM completo para alcançar um pH 7.4 no meio de cultura, marcar evento no software e retomar a aquisição para mais 5 pontos de tempo.
Nota: A fluorescência verde deve reaparecer na membrana plasmática. - Analise imagens.
A Figura 2 mostra imagens representativas obtidas com tal protocolo com a construção pHluorin-plexinA1.
- Prepare duas alíquotas de média completa DMEM e ajuste o pH para 3,5 e 9,5, respectivamente.
3. Em ovo Eletroporação de pHluorin-plexinA1 Construto
- Manuseio de ovos antes da eletroporação:
- Armazene ovos fertilizados em uma geladeira a 14 °C até uma semana antes da incubação.
- Incubar ovos a 38,5 °C (101.3 °F) em uma incubadora com umidade saturada por 50-52 horas até que os embriões cheguem ao estágio HH1412.
Nota: Os ovos devem ser colocados horizontalmente durante a incubação para que o embrião esteja devidamente posicionado para eletroporação, flutuando na parte superior da gema. O estágio HH14 é adequado para obter expressão dos plasmídeos em neurônios diferenciados na medula espinhal e no gânglio raiz dorsal com uma taxa de sobrevivência adequada.
- Embriões eletroporados8-10:
- Prepare a eletroporação:
- Prepare plasmídeos de DNA livres de endotoxinas com uma concentração superior a 2 μg/μl, para poder diluí-lo como a concentração desejada.
- Puxe capilares de vidro suficientes para injetar as diferentes soluções de DNA.
- Prepare PBS estéril (-Ca2+; -Mg2+) - 100 U/ml penicilina/estreptomicina e equilibre a 38,5 °C.
- Esterilize o capô, tesoura curva e fórceps finos.
- Controle o espaçamento do eletrodo.
Nota: Um espaço de 4 mm entre os eletrodos é geralmente utilizado.
- Janela do ovo13 (Figura 3A):
- Use uma tesoura curva para perfurar a casca no lado contundente do ovo.
- Remova 2 ml de albumen usando uma agulha de 0,9 mm x 25 mm e uma seringa de 5 ml. Oriente a agulha verticalmente, a fim de evitar danificar o saco de gema.
- Cubra a parte superior do ovo com fita adesiva para manter a integridade da casca.
- Usando uma tesoura curva, fure a casca no meio da fita para equalizar a pressão ao remover 2 ml de albumen do ovo. Em seguida, corte uma janela grande o suficiente para visualizar o embrião e ser capaz de trabalhar nele.
- Adicione ~2 ml estéril quente PBS (-Ca2+; -Mg2+) - 100 U/ml penicilina/estreptomicina para evitar a desidratação do embrião e torná-lo mais acessível ao manipulador.
- Injete DNA e eletroporar o embrião
- Diluir plasmídeo em PBS (-Ca2+; -Mg2+) a uma concentração entre 0,5-2 μg/μl e adicionar corante verde rápido para atingir uma concentração final de 0,025%. Carregue a mistura de DNA em um capilar. Recomenda-se o uso de um injetor.
Nota: Verifique se a resistência capilar não é muito grande (o que significa que pode haver dificuldades ao injetar embriões) nem muito pequena (o que significa que o capilar pode ser muito grande e pode danificar o embrião). Além disso, a concentração de ácidos nucleicos superiores a 2 μg/μl pode causar efeitos inespecíficos e precisa ser controlada. - Puna o saco de gema e o tubo neural no lado caudal com o capilar carregado. Digite o tubo neural com um ângulo raso e encha o lúmen da cauda até a cabeça com a mistura de DNA(Figura 3B).
Nota: O verde rápido permite controlar a precisão da injeção. - Coloque rapidamente os eletrodos de platina de 4 mm em ambos os lados do tubo neural no nível que deseja eletroporar e aplique 3 pulsos a 31 V para 50 msec com intervalos de 500 msec(Figura 3C).
Nota: Evite colocar os eletrodos no coração ou em vasos grandes e extraembrionários para evitar danificar o embrião em desenvolvimento. Bolhas devem se formar nos eletrodos. - Com a agulha, remova 2 ml de albumen para diminuir o nível na casca.
- Sele a janela e o lado contundente hermeticamente com fita.
- Coloque os ovos de volta a 38,5 °C na incubadora até chegarem ao estágio desejado.
- Diluir plasmídeo em PBS (-Ca2+; -Mg2+) a uma concentração entre 0,5-2 μg/μl e adicionar corante verde rápido para atingir uma concentração final de 0,025%. Carregue a mistura de DNA em um capilar. Recomenda-se o uso de um injetor.
- Prepare a eletroporação:
4. Embriões Incorporando e Cryosectioning
- 48 horas após a eletroporação, colhe cuidadosamente embriões eletroporados (estágio HH24). Corte a fita e metade da membrana corioallantóide. Para evitar que os embriões afundem na gema, posicione um coador sob o embrião e corte a segunda metade da membrana corioallantóide.
- Transfira o embrião para um prato de dissecção cheio de PBS gelado.
- Verifique a eficiência da eletroporação procurando fluorescência no tubo neural com um microscópio estéreo de fluorescência.
Nota : A coeletrificação de uma codificação plasmida de controle do RFP pode ajudar a visualizar a área eletroporada. - Dissecar embriões usando uma microscalpela a fim de selecionar a área eletroporada da medula espinhal.
- Transfira embriões dissecados para uma placa de 24 poços e fixe em pH 7,4 4% Paraformaldeído (PFA) - Salina tampão fosfato (PBS), O/N a 4 °C.
Nota: A etapa de fixação é crucial para permitir a estabilização da pHLuorina em sua conformação "viva" e, assim, ser capaz de usar pHluorin em tecido fixo/permeabilized. Embora a fixação desacelere drasticamente a mudança dependente do pH da fluorescência, deve-se levar em conta que mudanças conformais/de protonação ainda podem ocorrer após a fixação. Assim, o seguinte protocolo (incorporação, criosecções e observação) deve ser realizado no prazo de 3 dias após a etapa de fixação, com todos os buffers em pH 7. Se a fixação não for necessária, recomenda-se a realização de observação em seções de tecido vivo. - Remova 4% de PFA e lave embriões em pH 7,4 PBS.
- Incubar embriões em PBS-15% de sacarose e manter a 4 °C até que os embriões afundem.
- Incubar embriões fixos em pH 7,4 7,5% de gelatina- 15% de sacarose por 45 min a 37 °C para que os embriões estejam completamente incorporados.
- Coloque moldes de incorporação no gelo e adicione 400 μl de pH 7,4 7,5% de gelatina- 15% de sacarose para alcançar uma base sólida de 2 mm.
- Aspire o embrião embutido com uma ponta de corte e coloque o embrião na base de gelatina sólida.
- Cubra com pH 7,4 7,5% de gelatina- 15% de sacarose e posicione o embrião com fórceps antes que a gelatina se solidifique.
- Uma vez que a gelatina esteja sólida, prepare um banho isopropanol de -40 °C (use gelo seco ou nitrogênio líquido) e congele o bloco de gelatina por 5 minutos.
- Mantenha os blocos congelados a -80 °C.
- Coloque o bloco congelado a -20 °C por 1 hora.
- Remova o molde e fixe o bloco em um mandril com um meio de polietileno glicol.
- Uma vez que o bloco esteja bem fixo, coloque o mandril no sistema criostat.
Nota: Use lâminas revestidas para evitar a perda de tecido durante a coloração. - Realize criosections seriais (20 μm criosections são geralmente realizadas).
- Deixe as criosecções secarem por 15 minutos no RT.
Nota: as crioseções devem ser protegidas contra exposição desnecessária à luz, a fim de evitar o branqueamento da fluorescência GFP.
5. Análise microscópica das criogenias
- Reidratar crioseções em pH 7.4 PBS em RT por 10 min.
Nota: Se necessário, os núcleos podem ser manchados com Hoechst. - Use uma solução Hoechst de 0,5 μg/ml em PBS e incubar criosections por 15 minutos.
- Enxágüe os slides 3x com pH 7,4 PBS por 5 min.
- Prossiga para a montagem de slides. Uma solução de montagem de álcool polivinyl pH 7.4 (ou mais básica) que endurece O/N pode ser usada: posicione cuidadosamente o deslizamento para evitar a formação de bolhas de ar entre o slide e o deslizamento de tampas.
- Deixe o meio de montagem endurecer O/N a 4 °C no escuro.
- Use um microscópio confocal invertido para visualizar com precisão a proteína de fusão pHluorin-plexinA1: realize z-stack no orifício ideal e resolução óptica e use uma lente de 20X (NA 0,75) ou 40X (NA 1.3).
Nota: a pHluorina é detectável com os mesmos parâmetros utilizados para detectar GFP (ou seja, pico de emissões a 509 nm). As configurações do filtro de excitação e detecção do comprimento de onda são definidas de forma ideal pelo software de imagem. Hoechst é detectado entre 425-460 nm (excitação é de 405 nm), GFP ou pHluorin é detectado entre 485-545 nm (excitação é de 473 nm) e RFP é detectado entre 575-675 nm (excitação é de 559 nm).
Imagens representativas da expressão pHluorin-plexinA1 e eGFP na medula espinhal do embrião do filhote são mostradas na Figura 4.
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Representative Results
Figura 1. A. Esquema das propriedades de fluorescência pHluorin-plexinA1 em um contexto celular. A phluorina é não fluorescente em compartimentos intracelulares onde o pH é ácido (<6) como em vesicules de tráfico ou em endosários e é fluorescente quando exposto ao meio extracelular onde o pH é neutro. Isso permite visualizar apenas a piscina de superfície celular do receptor pHluorin-plexinA1. B. Mapa do local de clonagem pBK-CMV-pHluorin-plexinA1. O receptor do camundongo plexinA1 expressando vetor foi usado como espinha dorsal. Este vetor foi projetado para alcançar uma eficiente inserção de receptores vsv marcados na membrana plasmática. Para isso, o sinal de peptídeo semaphorin 3a e o local do decote foram fundidos rio acima do receptor com etiqueta VSV ablado de seu próprio peptídeo de sinal e local de decote. Por PCR, a sequência de pHluorin foi inserida no quadro entre sequências de codificação VSV-tag e PlxnA1 usando sites de restrição NruI/Kpn2I. Sites de restrição única são indicados para projetar estratégia de clonagem de outros receptores. O esquema é adaptado a partir de software bioinforático.
Figura 2. Caracterização da pHluorin-plexinA1 constrói propriedades fluorescentes dependentes de pH em células COS7. A. As células COS7 transfeinam com a construção pHluorin-plexinA1 onde observadas com um microscópio confocal permitindo a visualização da fluorescência pHluorin-plexinA1 na membrana plasmática. Barra de escala: 20 μM. B. Células COS7 transfeinadas com o construto pHluorin-plexinA1 onde observadas através de imagem viva em um meio de cultura pH 7.4, após acidificação do meio de cultura até pH 5.5 e após restauração do pH 7.4 no meio da cultura. Os contornos celulares são indicados com uma linha tracejada na aquisição de fluorescência GFP. Barra de escala: 10 μM. Clique aqui para ver imagem maior.
Figura 3. No procedimento de eletroporação de ovo. A. 1. Remoção de albumen do maior lado da concha. 2. Janelas da casca de ovo para acessar o embrião. B. DNA/Fast Green mistura injeção no tubo neural. C. Colocar eletrodos em ambos os lados do tubo neural, evitando o coração e grandes vasos, e eletroporação do embrião do filhote.
Figura 4. Análise microscópica de crioseções de tubo neural de filhotes após eletroporação pHluorin-plexinA1. Uma comparação entre o padrão de expressão eGFP (painéis superiores) e pHluorin-plexinA1 (painéis inferiores) na medula espinhal do pintinho eletroporado é mostrada. Painéis ampliados mostram a fluorescência membanous de pHluorin-plexinA1 (a') em comparação com a localização subcelular difusa do eGFP (a). Em relação ao plexinA1, o painel ampliado mostra que este receptor é especificamente enriquecido na membrana plasmática após a travessia da placa do chão (b') o que não é o caso para eGFP que é igualmente expresso antes e depois da travessia da placa (b). Barras de escala: 100 μM. FP: Placa de piso; Pré: Pré-travessia; Post: Postcrossing. Clique aqui para ver imagem maior.
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Discussion
Este protocolo fornece um procedimento passo-a-passo para acompanhar a dinâmica de um receptor de orientação de axônio tanto na cultura celular quanto no contexto de desenvolvimento da medula espinhal do embrião de filhotes.
Para projetar uma proteína marcada por novo pHluorin, dois pontos precisam ser considerados em relação à estratégia de clonagem. Primeiro, a etiqueta de pHluorin deve ser exposta ao lúmen dos endosários ácidos e, consequentemente, ao compartimento extracelular, a fim de visualizar a piscina receptora da membrana plasmática. Assim, o posicionamento correto da sequência de pHluorin em relação à sequência do receptor depende diretamente do tipo de receptor estudado (ou seja, se o terminal N ou a parte terminal C do receptor está exposto ao compartimento extracelular). Em segundo lugar, como explicado no protocolo, a posição da sequência de pHluorin em relação ao peptídeo de sinal deve ser considerada para evitar o subsequente decote entre a pHLuorin e o receptor de interesse.
Uma limitação da técnica está ligada ao tráfico dos receptores após sua ativação na membrana plasmática. Comumente, os receptores são internalizados e progridem através da via endócítica composta de compartimentos funcionais e fisicamente distintos15. Devido às bombas de prótons movidas a ATP, os endósmos mantêm um pH ácido em torno de 6 em endósmosos iniciais, cerca de 5 em endósmosos tardios, menores que 5 em lisosomos, mas apenas cerca de 6,4 em endósmosos de reciclagem ou 7,0 em caveossósmos permitindo fluorescência nesses dois compartimentos endossômicos. Este problema pode ser resolvido in vitro usando a microscopia de reflexão interna total (TIRF)16. Uma segunda limitação inerente a esta técnica é que, devido ao seu tamanho relativamente grande, a tag pHluorin poderia interromper a atividade do receptor, dependendo do local de inserção da tag.
Apesar de suas vantagens, a pHLuorin não tem sido amplamente utilizada para estudar a dinâmica e regulação das proteínas de membrana durante a navegação do axônio. Trabalhos seminais têm usado pHluorin para estudar a dinâmica espátula-temporal da exoctose durante o cone de crescimento girando in vitro17. No presente protocolo, ilustramos como a pHLuorin poderia ser usada para investigar a distribuição de receptores na membrana plasmática dos axônios in vivo. Uma vez que os phluorins são geneticamente codificados, eles são particularmente apropriados para a análise in vivo. Embora descrevamos seu uso em filhotes após a eletroporação ovo, essa abordagem pode ser usada em outras espécies. De fato a eletroporação funciona de forma eficiente em vários modelos animais18,19. Além disso, os phluorins têm sido usados com sucesso em C. elegans, Drosophila, ou animais transgênicosde camundongos 20-23.
Uma vez que a mudança dependente do pH ocorre na faixa de milissegundos, os pHluorins são particularmente adaptados para imagens vivas6,24. A fusão de PHLuorin tem sido, por exemplo, usada para monitorar a dinâmica in vivo da excitose sináxica em neurônios sensoriais olfativos de camundongos transgênicos23. A imagem ao vivo in vivo das fusões de pHluorin mantém uma promessa considerável à medida que microscópios confocal adaptados à imagem ao vivo (imagem rápida e baixa fototoxicidade) se tornam mais eficientes e acessíveis25. A imagem ao vivo in vivo também poderia ser combinada com a recuperação da fluorescência após o fotobleaching (FRAP) para que a exocitose ou difusão pudesse ser avaliada mais diretamente26.
O uso de outras variantes sensíveis ao pH e suas combinações pode ampliar ainda mais o leque de aplicações. A distribuição dinâmica do receptor em diferentes organelas poderia ser monitorada utilizando pHluorina ratiométrica que altera fluorescência de acordo com o pH do compartimento6,27. Da mesma forma, a adição de uma proteína fluorescente insensível ao pH a uma proteína de membrana fundida a uma pHLuorina eclíptica poderia fornecer insights importantes sobre seu tráfico28. Além disso, a recente clonagem do pHtomato29 permitirá o monitoramento de dois receptores simultaneamente. Isso poderia fornecer insights importantes sobre a formação de complexos receptores. Uma vez que a pHLuorin também pode ser usada para marcar pistas de orientação30, imagem dupla do ligante, e seu receptor também é viável.
Neste protocolo, a taxa de expressão da proteína de fusão é um ponto crítico e depende particularmente da força do promotor, da estabilidade da proteína de fusão e da quantidade de plasmídeos usados para transfetar as células. De fato, quando superexpressas, proteínas de fusão podem se acumular em vesículas intracelulares e um fundo fluorescente pode aparecer. Assim, várias otimizações podem ser necessárias para obter uma visualização precisa da proteína fundida de pHluorin na superfície celular. Além disso, o uso de proteína de fusão de phluorina em tecido fixo requer cuidados particulares durante e após a fixação. De fato, a estabilização das conformações das proteínas de fusão de phluorina só pode ser temporária. Assim, o pH deve ser mantido acima de 7 para evitar a perda do sinal de pHluorin. Além disso, as observações devem ser realizadas logo após a fixação. O tempo ideal pode precisar ser definido pelos usuários de acordo com sua proteína de fusão de pHluorin particular.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Homaira Nawabi, Frederic Moret e Isabelle Sanyas pela ajuda. Este trabalho é apoiado pela CNRS, Association Francaise contre les Myopathies (AFM), ANR YADDLE, Labex DevWeCan, Labex Cortex, ERC YODA to V.C.; C.D-B e A.J são apoiados por uma bolsa la Ligue contre le cancer e Labex DevWeCan, respectivamente.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| COS7 cells | ATCC | CRL-1651 | |
| DMEM GlutaMAX | GIBCO | 61965-026 | |
| Sodium pyruvate | GIBCO | 11360-039 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO | 10270-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Exgen500 reagent | Euromedex Fermentas | ET0250 | |
| PBS -Ca2+ -Mg2+ | GIBCO | 14190-094 | |
| Fast green dye | Sigma | F7252 | |
| 32% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy | 15714-S | Dilute extemporaneously in PBS to achieve a 4% solution |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7041 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Cryomount | Histolab | 00890 | |
| Hoechst 34580 | Invitrogen | H21486 | |
| Mowiol 4-88 | Fluka | 81381 | |
| Consumables | |||
| Bottom-glass 35 mm dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| 5 ml Syringe | Terumo | SS-05S | |
| Needles 0.9 mm x 25 mm | Terumo | NN-2025R | |
| Capillaries | CML | PP230PO | capillaries are stretched manually in the flame |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | 4951PLUS | |
| Material | |||
| Curved scissors | FST | 129-10 | |
| Microscalpel | FST | 10316-14 | |
| Forceps | FST | Dumont #5 REF#11254 | |
| Equipment/software | |||
| Time lapse microscope | Zeiss | Observer 1 | |
| Temp module S | PECON for Zeiss | ||
| CO2 module S | PECON for Zeiss | ||
| Metamorph software | Metamorph | ||
| Eggs incubator | Sanyo | MIR154 | |
| Electroporator apparatus | Nepa Gene CO., LTD | CUY21 | |
| Electrodes | Nepa Gene CO., LTD | CUY611P7-4 | 4 mm platinum electrodes |
| Fluorescence stereomicroscope | LEICA | MZ10F | |
| Cryostat | MICROM | HM550 | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000, X81 | |
| Fluoview software | Olympus | ||
| CLC Main Workbench software | CLC Bio |
References
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