Verwendung von pHluorin zur Bewertung der Dynamik von Axon-Leitrezeptoren in der Zellkultur und im Küken-Embryo
Summary
Wir beschreiben hier die Verwendung einer pH-empfindlichen grünen fluoreszierenden Proteinvariante, pHLuorin, um die räumlich-zeitliche Dynamik des Axon-Beratungsrezeptorenhandels an der Zelloberfläche zu untersuchen. Der pHluorin-markierte Rezeptor wird sowohl in der Zellkultur als auch in vivomit Elektroporation des Kükenembryons exprimiert.
Abstract
Während der Entwicklung spielen Axon-Beratungsrezeptoren eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Empfindlichkeit der Axone sowohl gegenüber attraktiven als auch abstoßenden Hinweisen. Tatsächlich ist die Aktivierung der Leitrezeptoren der erste Schritt der Signalmechanismen, die es Axonspitzen, den Wachstumskegeln, ermöglichen, auf die Liganden zu reagieren. Daher ist die Modulation ihrer Verfügbarkeit an der Zelloberfläche einer der Mechanismen, die an der Einstellung der Wachstumskegelempfindlichkeit beteiligt sind. Wir beschreiben hier eine Methode zur präzisen Visualisierung der räumlich-zeitlichen Zelloberflächendynamik eines Axon-Führungsrezeptors sowohl in vitro als auch in vivo im sich entwickelnden Kükenrückenmark. Wir nutzten die pH-abhängige Fluoreszenzeigenschaft einer Grünen Fluoreszenzproteinvariante (GFP), um gezielt den Anteil des Axon-Führungsrezeptors zu detektieren, der an die Plasmamembran adressiert ist. Wir beschreiben zunächst die In-vitro-Validierung solcher pH-abhängigen Konstrukte und beschreiben deren Verwendung in vivo,im Küken-Rückenakkord, um die räumlich-zeitliche Dynamik des Axon-Leitrezeptors von Interesse zu bewerten.
Introduction
Während ihrer Navigation integrieren Axone mehrere Umwelthinweise, die sie zu ihrem Ziel führen. Diese Hinweise aktivieren Leitrezeptoren an der Oberfläche von Axonklemmen, den Wachstumskegeln, die wiederum einen geeigneten Signalweg initiieren. Daher ist die zeitliche und räumliche Regulation der Zelloberflächenverteilung der Rezeptoren entscheidend, um die Empfindlichkeit des Wachstumskegels1einzustellen. In diesem Zusammenhang ist die Mittellinienüberquerung durch kommissarische Axone ein ausgezeichnetes Modell, um die Regulierung der Oberflächenebenen von Rezeptorzellen zu untersuchen. Im sich entwickelnden Rückenmark werden kommissarische Axone zunächst zur ventralen Bodenplatte hin angezogen, wo sie die Mittellinie überqueren. Nach der Überquerung verlieren sie ihre Reaktionsfähigkeit auf die Bodenplatten-Anziehungsmittel und gewinnen an Reaktion auf Bodenplattenabweisende, so dass sie die Bodenplatte verlassen und in Richtung ihres Endziels in der kontralateralen Seite des Nervensystems navigieren können2,3. Die Regulierung der Rezeptorverfügbarkeit an der Wachstumskegeloberfläche ist einer der Mechanismen, die dem Wechsel der Reaktionsfähigkeit auf Mittellinienhinweise 4,5zugrunde liegen. Daher ist die selektive Überwachung der Rezeptoren, die an der Plasmamembran von Wachstumskegeln vorhanden sind, von größter Bedeutung. Wir beschreiben hier eine Methode, die auf der pH-abhängigen Fluoreszenzeigenschaft einer grünen Fluoreszenzproteinvariante (GFP) basiert, um speziell die Axon-Führungsrezeptoren zu visualisieren, die an die Plasmamembran in vitro und in vivoim sich entwickelnden Kükenrückenmark adressiert sind.
Rothman und Kollegen entwickelt durch Punktmutationen pH-sensitive Varianten von GFP einschließlich der Ekliptik pHluorin6. Ekliptisches pHluorin hat die Eigenschaft, nicht fluoreszierend zu sein, wenn es einem sauren pH-Wert (<6) ausgesetzt ist, während es bei neutralem pH-Wert fluoreszierend ist. Dies ermöglicht die Unterscheidung von nichtfluoreszierenden Rezeptoren, die in intrazellulären sauren Kompartimenten lokalisiert sind(d.h. Endosomen, Handelsvesikeln) von fluoreszierenden Rezeptoren, die in die Plasmamembran integriert und somit dem extrazellulären neutralen pH7ausgesetzt sind. Wir nutzten dies, um die Plasmamembranlokalisierung von plexinA1 zu überwachen, einem Axon-Führungsrezeptor, der die Wachstumskegelreaktion auf das Mittellinien-repellens Semaphorin 3B5 vermittelt (Abbildung 1A). Wir beschreiben hier die In-vitro-Charakterisierung eines pHluorin-plexinA1-Konstrukts, zusammen mit der ovo Elektroporation8-10 dieses Konstrukts im sich entwickelnden Kükenrückenmark, gefolgt von der mikroskopischen Analyse von Kryosektionen, die es ermöglichen, die Axon-Führungsrezeptordynamik in vivo mit räumlichen und zeitlichen Auflösungen zu verfolgen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll bietet ein schrittweises Verfahren, um die Dynamik eines Axon-Führungsrezeptors sowohl in der Zellkultur als auch im Entwicklungskontext des Kükenembryonals Rückenmarks zu verfolgen.
Um ein de novo pHluorin-markiertes Protein zu entwerfen, müssen zwei Punkte in Bezug auf die Klonstrategie berücksichtigt werden. Zunächst sollte das pHluorin-Tag dem Lumen der sauren Endosomen und damit dem extrazellulären Fach ausgesetzt werden, um den Plasmamembranrezeptorpool z…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Homaira Nawabi, Frederic Moret und Isabelle Sanyas für ihre Hilfe. Diese Arbeit wird unterstützt von CNRS, Association Francaise contre les Myopathies (AFM), ANR YADDLE, Labex DevWeCan, Labex Cortex, ERC YODA bis V.C.; C.D-B und A.J werden von einem La Ligue contre le cancer bzw. Labex DevWeCan Stipendien unterstützt.
Materials
| COS7 cells | ATCC | CRL-1651 | |
| DMEM GlutaMAX | GIBCO | 61965-026 | |
| Sodium pyruvate | GIBCO | 11360-039 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO | 10270-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Exgen500 reagent | Euromedex Fermentas | ET0250 | |
| PBS -Ca2+ -Mg2+ | GIBCO | 14190-094 | |
| Fast green dye | Sigma | F7252 | |
| 32% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy | 15714-S | Dilute extemporaneously in PBS to achieve a 4% solution |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7041 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Cryomount | Histolab | 00890 | |
| Hoechst 34580 | Invitrogen | H21486 | |
| Mowiol 4-88 | Fluka | 81381 | |
| Consumables | |||
| Bottom-glass 35 mm dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| 5 ml Syringe | Terumo | SS-05S | |
| Needles 0.9 mm x 25 mm | Terumo | NN-2025R | |
| Capillaries | CML | PP230PO | capillaries are stretched manually in the flame |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | 4951PLUS | |
| Material | |||
| Curved scissors | FST | 129-10 | |
| Microscalpel | FST | 10316-14 | |
| Forceps | FST | Dumont #5 REF#11254 | |
| Equipment/software | |||
| Time lapse microscope | Zeiss | Observer 1 | |
| Temp module S | PECON for Zeiss | ||
| CO2 module S | PECON for Zeiss | ||
| Metamorph software | Metamorph | ||
| Eggs incubator | Sanyo | MIR154 | |
| Electroporator apparatus | Nepa Gene CO., LTD | CUY21 | |
| Electrodes | Nepa Gene CO., LTD | CUY611P7-4 | 4 mm platinum electrodes |
| Fluorescence stereomicroscope | LEICA | MZ10F | |
| Cryostat | MICROM | HM550 | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000, X81 | |
| Fluoview software | Olympus | ||
| CLC Main Workbench software | CLC Bio | ||
References
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