सेल कल्चर और चिक भ्रूण में एक्सॉन गाइडेंस रिसेप्टर्स की गतिशीलता का आकलन करने के लिए pHluorin का उपयोग
Summary
हम यहां सेल की सतह पर एक्सॉन गाइडेंस रिसेप्टर्स तस्करी के स्थानिओ-लौकिक गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए पीएच-संवेदनशील ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन संस्करण, पीएचलूरिन के उपयोग का वर्णन करते हैं। पीएचलुरिन-टैग किए गए रिसेप्टर को सेल कल्चर और वीवोदोनों में व्यक्त किया जाता है, जो चिक भ्रूण के इलेक्ट्रोपॉशन का उपयोग करके किया जाता है।
Abstract
विकास के दौरान, एक्सोन मार्गदर्शन रिसेप्टर्स आकर्षक और प्रतिकारक दोनों संकेतों के लिए एक्सॉन संवेदनशीलता को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। दरअसल, मार्गदर्शन रिसेप्टर्स की सक्रियता संकेत तंत्र का पहला कदम है जो एक्सोन टिप्स, विकास शंकु, लिगांड का जवाब देने की अनुमति देता है। जैसे, सेल की सतह पर उनकी उपलब्धता का मॉड्यूलेशन उन तंत्रों में से एक है जो विकास शंकु संवेदनशीलता को स्थापित करने में भाग लेते हैं। हम यहां एक विधि का वर्णन करने के लिए ठीक से एक एक्सॉन मार्गदर्शन रिसेप्टर दोनों विट्रो में और विकासशील लड़की रीढ़ की हड्डी में वीवो में की छेटीओ-लौकिक कोशिका सतह गतिशीलता कल्पना । हमने प्लाज्मा झिल्ली को संबोधित एक्सॉन गाइडेंस रिसेप्टर के अंश का विशेष रूप से पता लगाने के लिए हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) संस्करण के पीएच-निर्भर फ्लोरेसेंस संपत्ति का लाभ उठाया। हम पहले इस तरह के पीएच-निर्भर निर्माणों के इन विट्रो सत्यापन का वर्णन करते हैं और हम ब्याज के अक्षतं मार्गदर्शन रिसेप्टर के स्थानिक-लौकिक गतिशीलता का आकलन करने के लिए, चिक स्पाइनल राग में वीवोमें उनके उपयोग का विस्तार करते हैं।
Introduction
अपने नेविगेशन के दौरान, एक्सॉन कई पर्यावरणीय संकेतों को एकीकृत करते हैं जो उन्हें अपने लक्ष्य की ओर मार्गदर्शन करते हैं। ये संकेत एक्सॉन टर्मिनलों की सतह पर मार्गदर्शन रिसेप्टर्स को सक्रिय करते हैं, विकास शंकु, जो बदले में एक उपयुक्त सिग्नलिंग मार्ग शुरू करते हैं। इस प्रकार, रिसेप्टर्स के कोशिका सतह वितरण का लौकिक और स्थानिक विनियमन विकास शंकु1की संवेदनशीलता को निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस संदर्भ में, कॉमिसुरल एक्सॉन द्वारा मिडलाइन क्रॉसिंग रिसेप्टर सेल सतह के स्तर के नियमन की जांच करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है। विकासशील रीढ़ की हड्डी में, कॉमिसुरल एक्सन शुरू में वेंट्रल फ्लोर प्लेट की ओर आकर्षित होते हैं जहां वे मिडलाइन पार करते हैं। पार करने के बाद, वे फर्श प्लेट को आकर्षित करने के लिए अपनी जवाबदेही खो देते हैं और फर्श प्लेट विकर्षकों के प्रति प्रतिक्रिया प्राप्त करते हैं ताकि वे फर्श की प्लेट से बाहर निकल सकें और तंत्रिका तंत्र2,3के विपरीत पक्ष में अपने अंतिम गंतव्य की ओर नेविगेट कर सकें। विकास शंकु की सतह पर रिसेप्टर उपलब्धता का विनियमन मिडलाइन संकेतों4,5के प्रति जवाबदेही के स्विच अंतर्निहित तंत्रों में से एक है। इस प्रकार, विकास शंकु की प्लाज्मा झिल्ली पर मौजूद रिसेप्टर्स की चयनात्मक निगरानी प्रमुख महत्व की है । हम यहां एक हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) संस्करण के पीएच-निर्भर फ्लोरेसेंस संपत्ति के आधार पर एक विधि का वर्णन करते हैं जो विशेष रूप से एक्सॉन मार्गदर्शन रिसेप्टर्स की कल्पना करता है जो प्लाज्मा झिल्ली को विट्रो में और वीवो में,विकासशील चिक रीढ़ की हड्डी में संबोधित करते हैं।
रोथमैन और उनके सहयोगियों ने एक्सलिटिक प्लूरिन6सहित जीएफपी के पीएच-संवेदनशील वेरिएंट को पॉइंट म्यूटेशन द्वारा इंजीनियर किया । क्रांतिमान pHluorin जब अम्लीय पीएच (<6) के संपर्क में आने पर गैर-प्रवाहित होने की संपत्ति होती है, जबकि तटस्थ पीएच पर फ्लोरोसेंट होता है। यह प्लाज्मा झिल्ली में शामिल फ्लोरोसेंट रिसेप्टर्स से इंट्रासेलुलर अम्लीय डिब्बों(यानी एंडोसोम्स, ट्रैफिकिंग वेसिकल्स) में स्थानीय रूप से गैर-प्रवाहित रिसेप्टर्स को अलग करने की अनुमति देता है और इस प्रकार एक्सट्रासेलुलर न्यूट्रल पीएच7के संपर्क में आ जाता है। हमने इसका लाभ ब्लैक्सिनए1 के प्लाज्मा झिल्ली स्थानीयकरण की निगरानी करने के लिए लिया, एक एक्सॉन मार्गदर्शन रिसेप्टर मिडलाइन विकर्षक सेमाफोरिन 3बी5 (चित्रा 1 ए)के विकास शंकु प्रतिक्रिया में मध्यस्थता करता है। हम यहां एक pHluorin-plexinA1 निर्माण के इन विट्रो लक्षण वर्णन, साथ में इस निर्माण के ओवो इलेक्ट्रोपॉरेशन8-10 के साथ विकासशील लड़की रीढ़ की हड्डी में क्रायोस्खंडों के सूक्ष्म विश्लेषण के बाद जो स्थानिक और लौकिक दोनों संकल्पों के साथ वीवो में अक्षति मार्गदर्शन रिसेप्टर गतिशीलता का पालन करने में सक्षम होता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रोटोकॉल सेल संस्कृति और चिक भ्रूण रीढ़ की हड्डी के विकासात्मक संदर्भ में एक अक्षतं मार्गदर्शन रिसेप्टर की गतिशीलता का पालन करने के लिए एक कदम-दर-कदम प्रक्रिया प्रदान करता है।
एक डी नो…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम होमायरा नवाबी, फ्रेडेरिक मोरेट और इसाबेल संन्यास को उनकी मदद के लिए धन्यवाद देते हैं । इस काम को सीएनआरएस, एसोसिएशन फ्रैंकाइज कॉन्ट्रोवर्सी लेस मायोपैथी (एएफएम), एएनआर याडल, लेटेक्स देववेकर, लेटेक्स कॉर्टेक्स, ईआरसी योडा से वी.C तक समर्थित है। सी.डी.बी और ए.जे. क्रमशः ला लिग कॉन्ट्रोवर्सी ले कैंसर और लेटेक्स देववेकन फैलोशिप द्वारा समर्थित हैं।
Materials
| COS7 cells | ATCC | CRL-1651 | |
| DMEM GlutaMAX | GIBCO | 61965-026 | |
| Sodium pyruvate | GIBCO | 11360-039 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO | 10270-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Exgen500 reagent | Euromedex Fermentas | ET0250 | |
| PBS -Ca2+ -Mg2+ | GIBCO | 14190-094 | |
| Fast green dye | Sigma | F7252 | |
| 32% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy | 15714-S | Dilute extemporaneously in PBS to achieve a 4% solution |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7041 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Cryomount | Histolab | 00890 | |
| Hoechst 34580 | Invitrogen | H21486 | |
| Mowiol 4-88 | Fluka | 81381 | |
| Consumables | |||
| Bottom-glass 35 mm dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| 5 ml Syringe | Terumo | SS-05S | |
| Needles 0.9 mm x 25 mm | Terumo | NN-2025R | |
| Capillaries | CML | PP230PO | capillaries are stretched manually in the flame |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | 4951PLUS | |
| Material | |||
| Curved scissors | FST | 129-10 | |
| Microscalpel | FST | 10316-14 | |
| Forceps | FST | Dumont #5 REF#11254 | |
| Equipment/software | |||
| Time lapse microscope | Zeiss | Observer 1 | |
| Temp module S | PECON for Zeiss | ||
| CO2 module S | PECON for Zeiss | ||
| Metamorph software | Metamorph | ||
| Eggs incubator | Sanyo | MIR154 | |
| Electroporator apparatus | Nepa Gene CO., LTD | CUY21 | |
| Electrodes | Nepa Gene CO., LTD | CUY611P7-4 | 4 mm platinum electrodes |
| Fluorescence stereomicroscope | LEICA | MZ10F | |
| Cryostat | MICROM | HM550 | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000, X81 | |
| Fluoview software | Olympus | ||
| CLC Main Workbench software | CLC Bio | ||
References
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