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Neuroscience

सेल कल्चर और चिक भ्रूण में एक्सॉन गाइडेंस रिसेप्टर्स की गतिशीलता का आकलन करने के लिए pHluorin का उपयोग

doi: 10.3791/50883 Published: January 12, 2014
* These authors contributed equally

Summary

हम यहां सेल की सतह पर एक्सॉन गाइडेंस रिसेप्टर्स तस्करी के स्थानिओ-लौकिक गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए पीएच-संवेदनशील ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन संस्करण, पीएचलूरिन के उपयोग का वर्णन करते हैं। पीएचलुरिन-टैग किए गए रिसेप्टर को सेल कल्चर और वीवोदोनों में व्यक्त किया जाता है, जो चिक भ्रूण के इलेक्ट्रोपॉशन का उपयोग करके किया जाता है।

Abstract

विकास के दौरान, एक्सोन मार्गदर्शन रिसेप्टर्स आकर्षक और प्रतिकारक दोनों संकेतों के लिए एक्सॉन संवेदनशीलता को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। दरअसल, मार्गदर्शन रिसेप्टर्स की सक्रियता संकेत तंत्र का पहला कदम है जो एक्सोन टिप्स, विकास शंकु, लिगांड का जवाब देने की अनुमति देता है। जैसे, सेल की सतह पर उनकी उपलब्धता का मॉड्यूलेशन उन तंत्रों में से एक है जो विकास शंकु संवेदनशीलता को स्थापित करने में भाग लेते हैं। हम यहां एक विधि का वर्णन करने के लिए ठीक से एक एक्सॉन मार्गदर्शन रिसेप्टर दोनों विट्रो में और विकासशील लड़की रीढ़ की हड्डी में वीवो में की छेटीओ-लौकिक कोशिका सतह गतिशीलता कल्पना । हमने प्लाज्मा झिल्ली को संबोधित एक्सॉन गाइडेंस रिसेप्टर के अंश का विशेष रूप से पता लगाने के लिए हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) संस्करण के पीएच-निर्भर फ्लोरेसेंस संपत्ति का लाभ उठाया। हम पहले इस तरह के पीएच-निर्भर निर्माणों के इन विट्रो सत्यापन का वर्णन करते हैं और हम ब्याज के अक्षतं मार्गदर्शन रिसेप्टर के स्थानिक-लौकिक गतिशीलता का आकलन करने के लिए, चिक स्पाइनल राग में वीवोमें उनके उपयोग का विस्तार करते हैं।

Introduction

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अपने नेविगेशन के दौरान, एक्सॉन कई पर्यावरणीय संकेतों को एकीकृत करते हैं जो उन्हें अपने लक्ष्य की ओर मार्गदर्शन करते हैं। ये संकेत एक्सॉन टर्मिनलों की सतह पर मार्गदर्शन रिसेप्टर्स को सक्रिय करते हैं, विकास शंकु, जो बदले में एक उपयुक्त सिग्नलिंग मार्ग शुरू करते हैं। इस प्रकार, रिसेप्टर्स के कोशिका सतह वितरण का लौकिक और स्थानिक विनियमन विकास शंकु1की संवेदनशीलता को निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस संदर्भ में, कॉमिसुरल एक्सॉन द्वारा मिडलाइन क्रॉसिंग रिसेप्टर सेल सतह के स्तर के नियमन की जांच करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है। विकासशील रीढ़ की हड्डी में, कॉमिसुरल एक्सन शुरू में वेंट्रल फ्लोर प्लेट की ओर आकर्षित होते हैं जहां वे मिडलाइन पार करते हैं। पार करने के बाद, वे फर्श प्लेट को आकर्षित करने के लिए अपनी जवाबदेही खो देते हैं और फर्श प्लेट विकर्षकों के प्रति प्रतिक्रिया प्राप्त करते हैं ताकि वे फर्श की प्लेट से बाहर निकल सकें और तंत्रिका तंत्र2,3के विपरीत पक्ष में अपने अंतिम गंतव्य की ओर नेविगेट कर सकें। विकास शंकु की सतह पर रिसेप्टर उपलब्धता का विनियमन मिडलाइन संकेतों4,5के प्रति जवाबदेही के स्विच अंतर्निहित तंत्रों में से एक है। इस प्रकार, विकास शंकु की प्लाज्मा झिल्ली पर मौजूद रिसेप्टर्स की चयनात्मक निगरानी प्रमुख महत्व की है । हम यहां एक हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) संस्करण के पीएच-निर्भर फ्लोरेसेंस संपत्ति के आधार पर एक विधि का वर्णन करते हैं जो विशेष रूप से एक्सॉन मार्गदर्शन रिसेप्टर्स की कल्पना करता है जो प्लाज्मा झिल्ली को विट्रो में और वीवो में,विकासशील चिक रीढ़ की हड्डी में संबोधित करते हैं।

रोथमैन और उनके सहयोगियों ने एक्सलिटिक प्लूरिन6सहित जीएफपी के पीएच-संवेदनशील वेरिएंट को पॉइंट म्यूटेशन द्वारा इंजीनियर किया । क्रांतिमान pHluorin जब अम्लीय पीएच (<6) के संपर्क में आने पर गैर-प्रवाहित होने की संपत्ति होती है, जबकि तटस्थ पीएच पर फ्लोरोसेंट होता है। यह प्लाज्मा झिल्ली में शामिल फ्लोरोसेंट रिसेप्टर्स से इंट्रासेलुलर अम्लीय डिब्बों(यानी एंडोसोम्स, ट्रैफिकिंग वेसिकल्स) में स्थानीय रूप से गैर-प्रवाहित रिसेप्टर्स को अलग करने की अनुमति देता है और इस प्रकार एक्सट्रासेलुलर न्यूट्रल पीएच7के संपर्क में आ जाता है। हमने इसका लाभ ब्लैक्सिनए1 के प्लाज्मा झिल्ली स्थानीयकरण की निगरानी करने के लिए लिया, एक एक्सॉन मार्गदर्शन रिसेप्टर मिडलाइन विकर्षक सेमाफोरिन 3बी5 (चित्रा 1 ए)के विकास शंकु प्रतिक्रिया में मध्यस्थता करता है। हम यहां एक pHluorin-plexinA1 निर्माण के इन विट्रो लक्षण वर्णन, साथ में इस निर्माण के ओवो इलेक्ट्रोपॉरेशन8-10 के साथ विकासशील लड़की रीढ़ की हड्डी में क्रायोस्खंडों के सूक्ष्म विश्लेषण के बाद जो स्थानिक और लौकिक दोनों संकल्पों के साथ वीवो में अक्षति मार्गदर्शन रिसेप्टर गतिशीलता का पालन करने में सक्षम होता है।

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Protocol

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1. प्लूरिन के साथ PlexinA1 रिसेप्टर टैग करने के लिए क्लोनिंग रणनीति

  1. एक रीढ़ की हड्डी के रूप में एक उपयुक्त अभिव्यक्ति वेक्टर चुनें(उदाहरण के लिए माउस रिसेप्टर प्लेक्सिनए1 एक्सप्रेस वेक्टर, डॉ एंड्रियास पुशल11का एक प्रकार का उपहार)।
    नोट: यह plexinA1 वेक्टर प्लाज्मा झिल्ली में कुशल एचए-या वीएसवी-टैग रिसेप्टर प्रविष्टि प्राप्त करने के लिए इंजीनियर किया गया था।
  2. पीसीआर द्वारा एक टेम्पलेट के रूप में पर्याप्त प्लाज्मिड का उपयोग करके क्रांतिपूर्ण प्लूरिन कोडिंग अनुक्रम कोबढ़ाना (उदाहरण के लिए pHluorin-टैग गाबा ए रिसेप्टर, डॉ जैकब2का एक प्रकार का उपहार)। यदि आवश्यक हो, तो रीढ़ की हड्डी में क्लोनिंग चरण को सुविधाजनक बनाने के लिए प्राइमर के 5 ' अंत में एक प्रतिबंध साइट जोड़ें।
  3. प्रतिबंध साइटों का उपयोग करके सिग्नल पेप्टाइड और रिसेप्टर कोडिंग अनुक्रम के बीच फ्रेम में pHluorin अनुक्रम डालें(जैसे NruI/Kpn2I प्रतिबंध साइटों के रूप में चित्रा 1Bमें वर्णित है) ।
    नोट: क्योंकि रिसेप्टर्स के सही लक्ष्यीकरण को सुनिश्चित करने वाले सिग्नल पेप्टाइड को क्लीव्ड किया गया है, इसलिए इसके बाद pHluorin रखा जाना चाहिए। यह सिग्नल पेप्टाइड की मान्यता का वारंट देता है और ब्याज के रिसेप्टर से पीएचलूरिन के दरार को रोकता है।
  4. पीसीआर द्वारा कोई उत्परिवर्तन शुरू नहीं किया गया था, यह सुनिश्चित करने के लिए प्राप्त निर्माणों का अनुक्रम।

2. COS7 कोशिकाओं में pHluorin-टैग रिसेप्टर इन विट्रो का लक्षण वर्णन

प्लाज्मा झिल्ली तक पहुंचने के लिए संलयन प्रोटीन की क्षमता और पीएच कम होने के रूप में फ्लोरेसेंस की इसके रिवर्सिबल नुकसान को निम्नलिखित प्रक्रिया का उपयोग करके पुष्टि की जा सकती है।

  1. दिन 1. प्लेट 1.5 x 105 COS7 कोशिकाओं को एक ग्लास-बॉटम 35 मिमी डिश में 2 मिलीलीटर पूर्ण डल्बेको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम - 10% भ्रूण गोजातीय सीरम - 1 mm सोडियम पाइरुवेट - 25 यू/एमएल पेनिसिलिन/स्ट्रेटॉमसिन - 2.5 1/मिलीलीटर एम्फोटेरिकिन - पीएच 7.4)।
  2. दिन 2. कोशिकाओं को पार करें:
    नोट: कोशिकाओं को 70-80% ढुलमुल होना चाहिए।
    1. 200 माइक्रोन एनएसीएल 150 mM तैयार करें और 3 माइक्रोन डीएनए जोड़ें यानी वेक्टर एन्कोडिंग प्लूरिन-टैग किए गए रिसेप्टर। धीरे भंवर और संक्षेप में नीचे स्पिन।
      नोट: इन प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले pHluorin-plexinA1 वेक्टर का एक नक्शा चित्रा 1Bमें दिखाया गया है ।
    2. ट्रांसफैक्शन रीएजेंट (या उपयोग किए गए रीएजेंट की उचित मात्रा) के 10 माइक्रोन जोड़ें। भंवर तुरंत।
    3. आरटी में 10 मिनट इनक्यूबेट ।
    4. कोशिकाओं में ट्रांसफैक्शन रीएजेंट/डीएनए मिक्स का २०० माइक्रोन जोड़ें ।
    5. मिश्रण के पुनर्भागीस को प्राप्त करने के लिए प्लेट को धीरे-धीरे स्थानांतरित करें और कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में वापस रखें।
  3. 3 दिन । ट्रांसफेक्शन माध्यम निकालें और इसे 2 मिलीलीटर ताजा पूर्ण डीएमईएम से बदलें।
  4. 4 दिन । COS7 pHluorin-plexinA1 ट्रांस संक्रमित कोशिकाओं की लाइव सेल इमेजिंग करें:
    1. डीएमईएम पूर्ण माध्यम के दो एलिकोट्स तैयार करें और पीएच को क्रमशः 3.5 और 9.5 तक समायोजित करें।
      नोट: प्रयोग करने के लिए एक 35 मिमी प्लेट के लिए, प्रत्येक समाधान के 1.5 मिलीलीटर की आवश्यकता होती है।
    2. सेल माध्यम निकालें और इसे डीएमईएम पूर्ण मध्यम पीएच 7.4 के 1 मिलीलीटर से बदलें।
    3. माइक्रोस्कोप कक्ष को खोले बिना विभिन्न घटकों को सीधे सेल संस्कृति माध्यम में इंजेक्ट करने के लिए एक उपयुक्त प्रकार की ट्यूबिंग के साथ 5 मिलीलीटर सिरिंज तैयार करें।
    4. एक मॉड्यूल का उपयोग करें जो 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 आर्द्र काम करने वाले वातावरण के रखरखाव की अनुमति देता है।
      नोट: सीओ2 कक्ष के उपयोग के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण एचईपी-बफर माध्यम (आमतौर पर सेल प्रकार के अनुसार 10-25 mM की सीमा में) का उपयोग करना है।
    5. कक्ष में कोशिकाओं को रखें और ट्यूबिंग और सिरिंज को समायोजित करें।
      नोट: रिकॉर्डिंग के दौरान यांत्रिक बहाव से बचने के लिए शुरू करने से पहले माइक्रोस्कोप को बराबर किया जाना चाहिए।
    6. इमेजिंग सॉफ्टवेयर खोलें और बहुआयामी अधिग्रहण कार्यक्रम का चयन करें।
    7. उनमें से प्रत्येक के लिए सॉफ्टवेयर में 40X उद्देश्य और मार्क स्थिति के साथ संक्रमित COS7 कोशिकाओं का पता लगाएं।
    8. कॉन्फ़िगर जेड स्टैक 15 माइक्रोन गहराई अधिग्रहण करने के लिए (प्लेट में मीडिया जोड़ते समय ध्यान बदल सकता है)।
    9. जीएफपी फ़िल्टर और चरण के लिए एक्सपोजर सेट करें।
    10. कॉन्फ़िगर अधिग्रहण समय।
      नोट: ब्याज के 5 क्षेत्रों के साथ पूरे प्रयोग के लिए, 10 मिनट के लिए हर 20 सेकंड अधिग्रहण पर्याप्त होना चाहिए ।
    11. अधिग्रहण शुरू करें और डीएमईएम पीएच 7.4 माध्यम में 5 नियंत्रण छवियां लें।
    12. अधिग्रहण को रोकें, संस्कृति माध्यम में 5.5 के पीएच प्राप्त करने के लिए पीएच 3.5 पूर्ण डीएमईएम के 1.25 मिलीलीटर इंजेक्ट करें, सॉफ्टवेयर में घटना को चिह्नित करें और 5 और समय बिंदुओं के लिए अधिग्रहण फिर से शुरू करें।
      नोट: ग्रीन फ्लोरेसेंस उत्तरोत्तर गायब हो जाना चाहिए।
    13. अधिग्रहण को रोकें, संस्कृति माध्यम में पीएच 7.4 प्राप्त करने के लिए पीएच 9.5 पूर्ण डीएमईएम के 1.2 मिलीलीटर इंजेक्ट करें, सॉफ्टवेयर में घटना को चिह्नित करें और 5 और समय बिंदुओं के लिए अधिग्रहण फिर से शुरू करें।
      नोट: प्लाज्मा झिल्ली पर ग्रीन फ्लोरेसेंस फिर से प्रकट होना चाहिए।
    14. छवियों का विश्लेषण करें।
      चित्रा 2 pHluorin-plexinA1 निर्माण के साथ इस तरह के एक प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त प्रतिनिधि छवियों से पता चलता है ।

3. pHluorin-plexinA1 निर्माण के ओवो इलेक्ट्रोपॉरेशन में

  1. इलेक्ट्रोपाउशन से पहले अंडों की हैंडलिंग:
    1. इनक्यूबेशन से एक सप्ताह पहले तक 14 डिग्री सेल्सियस पर एक फ्रिज में निषेचित अंडे स्टोर करें।
    2. 50-52 घंटे के लिए संतृप्त आर्द्रता के साथ एक इनक्यूबेटर में 38.5 डिग्री सेल्सियस (101.3 डिग्री एफ) पर अंडे इनक्यूबेट जब तक भ्रूण चरण HH1412तक पहुंचने ।
      नोट: अंडे को इनक्यूबेशन के दौरान क्षैतिज रूप से रखा जाना चाहिए ताकि भ्रूण को जर्दी के शीर्ष पर तैरते हुए इलेक्ट्रोपाउशन के लिए ठीक से तैनात किया जा सके। HH14 चरण रीढ़ की हड्डी में और एक उपयुक्त जीवित रहने की दर के साथ पृष्ठीय जड़ गैंगलियन में विभेदित न्यूरॉन्स में प्लाज्मिड की अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए उपयुक्त है।
  2. इलेक्ट्रोपोरेट भ्रूण8-10:
    1. इलेक्ट्रोपाउशन तैयार करें:
      1. 2 μg/μl से बेहतर एकाग्रता के साथ एंडोटॉक्सिन मुक्त डीएनए प्लाज्मिड तैयार करें, ताकि इसे वांछित एकाग्रता के रूप में पतला किया जा सके।
      2. विभिन्न डीएनए समाधान इंजेक्ट करने के लिए पर्याप्त ग्लास केशिकाएं खींचें।
      3. बाँझ पीबीएस (-सीए2+;-एमजी2+)- 100 यू/एमएल पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन और 38.5 डिग्री सेल्सियस पर संतुलन तैयार करें।
      4. हुड, घुमावदार कैंची और ठीक संदंश को स्टरलाइज करें।
      5. इलेक्ट्रोड स्पेसिंग को नियंत्रित करें।
        नोट: इलेक्ट्रोड के बीच एक 4 मिमी अंतरिक्ष आम तौर पर प्रयोग किया जाता है।
    2. खिड़की अंडा13 (चित्रा 3A):
      1. अंडे के कुंद पक्ष पर खोल छेदने के लिए घुमावदार कैंची का उपयोग करें।
      2. 0.9 मिमी x 25 मिमी सुई और 5 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करके 2 मिलीलीटर एल्बेंडाइंद निकालें। जर्दी थैली को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए सुई को खड़ी ओरिएंट करें।
      3. खोल की अखंडता को बनाए रखने के लिए टेप के साथ अंडे के शीर्ष को कवर करें।
      4. घुमावदार कैंची का उपयोग करके, अंडे से 2 मिलीलीटर एल्बेंडाजोल निकालने पर दबाव को बराबर करने के लिए टेप के बीच में खोल को छेदें। फिर, भ्रूण की कल्पना करने और उस पर काम करने में सक्षम होने के लिए काफी बड़ी खिड़की काटें।
      5. भ्रूण के निर्जलीकरण से बचने और इसे जोड़तोड़ के लिए अधिक सुलभ बनाने के लिए ~2 मिलीलीटर बाँझ गर्म पीबीएस (-सीए2+;-एमजी 2+)- 100 यू/एमएल पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन जोड़ें।
    3. डीएनए इंजेक्ट करें और भ्रूण को इलेक्ट्रोपरेट करें
      1. पीबीएस में पतला प्लाज्मिड (-सीए2+;-एमजी2 +)0.5-2 μg/μl के बीच एकाग्रता के लिए और एक अंतिम ०.०२५% एकाग्रता तक पहुंचने के लिए तेजी से हरे रंग की डाई जोड़ें । डीएनए मिश्रण को एक केशिका में लोड करें। इंजेक्टर के उपयोग की सिफारिश की जाती है।
        नोट: जांच करें कि केशिका प्रतिरोध न तो बहुत बड़ा है (जिसका अर्थ है कि भ्रूण इंजेक्शन लगाते समय कठिनाइयां हो सकती हैं) और न ही बहुत छोटे (जिसका अर्थ है कि केशिका बहुत बड़ी हो सकती है और भ्रूण को नुकसान पहुंचा सकती है)। इसके अलावा, 2 माइक्रोग्राम/माइक्रोन से अधिक न्यूक्लिक एसिड की एकाग्रता अविशिष्ट प्रभाव पैदा कर सकती है और इसे नियंत्रित करने की आवश्यकता है।
      2. लोडेड केशिका के साथ कौडल साइड में जर्दी-थैली और न्यूरल ट्यूब को पंचर करें। तंत्रिका ट्यूब को उथले कोण के साथ दर्ज करें और डीएनए मिश्रण(चित्रा 3B)के साथ पूंछ से सिर तक ल्यूमेन को भरें।
        नोट: तेजी से हरे इंजेक्शन की सटीकता को नियंत्रित करने की अनुमति देता है।
      3. 500 एमसेके सेकंड के अंतराल(चित्रा 3C)के साथ 50 मेससेक के लिए 31 वी पर 3 दालों को लागू करने के स्तर पर तंत्रिका ट्यूब के दोनों ओर 4 मिमी प्लेटिनम इलेक्ट्रोड को जल्दी से रखें।
        नोट: विकासशील भ्रूण को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए इलेक्ट्रोड को दिल पर या बड़े अतिरिक्त भ्रूणीय जहाजों पर रखने से बचें। इलेक्ट्रोड पर बुलबुले बनते हैं।
      4. सुई के साथ, खोल में स्तर को कम करने के लिए 2 मिलीलीटर एल्बेंडाकार निकालें।
      5. खिड़की और कुंद पक्ष टेप के साथ hermetically सील।
      6. अंडे को इनक्यूबेटर में 38.5 डिग्री सेल्सियस पर वापस रखें जब तक कि वे वांछित चरण तक न पहुंच जाएं।

4. भ्रूण एम्बेडिंग और क्रायोसेक्शनिंग

  1. इलेक्ट्रोपाउशन के बाद 48 घंटे, ध्यान से इलेक्ट्रोपेटेड भ्रूण (HH24 चरण) फसल। टेप और कोरियोएलैंटोइड झिल्ली का आधा काट लें। भ्रूण को जर्दी में डूबने से रोकने के लिए, भ्रूण के नीचे एक कोलंडर की स्थिति और कोरियोएलैंटोइड झिल्ली के दूसरे आधे हिस्से को काट लें।
  2. भ्रूण को बर्फ की ठंड पीबीएस से भरे विच्छेदन पकवान में स्थानांतरित करें।
  3. फ्लोरेसेंस स्टीरियो माइक्रोस्कोप के साथ तंत्रिका ट्यूब में फ्लोरेसेंस की तलाश करके इलेक्ट्रोपाउशन दक्षता की जांच करें।
    नोट: आरएफपी को एन्कोडिंग करने वाले नियंत्रण प्लाज्मिड एन्कोडिंग का सह विद्युतीकरण इलेक्ट्रोपोरेटेड क्षेत्र की कल्पना करने में मदद कर सकता है।
  4. रीढ़ की हड्डी के इलेक्ट्रोपोरेटेड क्षेत्र का चयन करने के लिए माइक्रोस्केलेपल का उपयोग करके भ्रूण को विच्छेदन करें।
  5. एक 24 अच्छी तरह से प्लेट में विच्छेदित भ्रूण स्थानांतरित करें और पीएच 7.4 4 4% पैराफॉर्मल्डिहाइड (पीएफए) में ठीक करें - फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस), ओ/एन 4 डिग्री सेल्सियस पर।
    नोट: निर्धारण कदम अपने "लाइव" संरचना में pHluorin के स्थिरीकरण की अनुमति देने के लिए महत्वपूर्ण है और इस प्रकार के लिए तय/permeabilized ऊतक में pHluorin का उपयोग करने में सक्षम हो । हालांकि निर्धारण फ्लोरेसेंस के काफी पीएच-निर्भर परिवर्तन को धीमा कर देता है, किसी को ध्यान में रखना चाहिए कि निर्धारण के बाद भी अनुरूप/प्रोटोनेशन परिवर्तन हो सकते हैं । इस प्रकार, निम्नलिखित प्रोटोकॉल (एम्बेडिंग, क्रायोसेक्शन और अवलोकन) को निर्धारण चरण के 3 दिनों के भीतर किया जाना चाहिए, जिसमें पीएच 7 पर सभी बफ़र्स हैं। यदि निर्धारण की आवश्यकता नहीं है, तो लाइव ऊतक वर्गों पर अवलोकन करने की सिफारिश की जाती है।
  6. पीएच 7.4 पीबीएस में 4% पीएफए निकालें और भ्रूण धोएं।
  7. पीबीएस में इनक्यूबेट भ्रूण- 15% सुक्रोज और 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें जब तक भ्रूण सिंक न हो जाए।
  8. पीएच 7.4 7.5% जिलेटिन में स्थिर भ्रूण- 37 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए 15% सुक्रोज तो भ्रूण पूरी तरह से एम्बेडेड हैं।
  9. बर्फ पर एम्बेडिंग मोल्ड रखें और ठोस 2 मिमी आधार प्राप्त करने के लिए पीएच 7.4 7.5% जिलेटिन- 15% सुक्रोज के 400 माइक्रोन जोड़ें।
  10. एम्बेडेड भ्रूण को कटे हुए टिप के साथ एस्पिरेट करें और भ्रूण को ठोस जिलेटिन बेस पर रखें।
  11. पीएच 7.4 7.5% जिलेटिन के साथ कवर- 15% सुक्रोज और जिलेटिन जमने से पहले संदंश के साथ भ्रूण की स्थिति।
  12. एक बार जिलेटिन ठोस होने के बाद,-40 डिग्री सेल्सियस आइसोप्रोपेनॉल बाथ (सूखी बर्फ या तरल नाइट्रोजन का उपयोग करें) तैयार करें और जिलेटिन ब्लॉक को 5 मिनट के लिए फ्रीज करें।
  13. जमे हुए ब्लॉकों को -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  14. 1 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए ब्लॉक रखें।
  15. मोल्ड निकालें और पॉलीथीन ग्लाइकोल माध्यम के साथ एक चक पर ब्लॉक को ठीक करें।
  16. एक बार ब्लॉक कसकर तय हो जाने के बाद चक को क्रायोस्टेट सिस्टम में रखें।
    नोट: धुंधला होने के दौरान टिश्यू लॉस से बचने के लिए कोटेड स्लाइड्स का इस्तेमाल करें।
  17. धारावाहिक क्रायोसेक्शन करें (20 माइक्रोन क्रायोसेक्शन आमतौर पर किए जाते हैं)।
  18. रोयोसेक्शन को आरटी में 15 मिनट तक सूखने दें।
    नोट: जीएफपी फ्लोरेसेंस की ब्लीचिंग से बचने के लिए क्रायोसेक्शन को अनावश्यक प्रकाश जोखिम से बचाया जाना चाहिए।

5. क्रायोसेक्शन का सूक्ष्म विश्लेषण

  1. 10 मिनट के लिए आरटी में पीएच 7.4 पीबीएस में रिहाइड्रेट क्रायोस्ेक्शन।
    नोट: यदि आवश्यक हो, तो नाभिक को होचस्ट से दाग दिया जा सकता है।
  2. पीबीएस में 0.5 माइक्रोन/एमएल होचस्ट सॉल्यूशन का इस्तेमाल करें और 15 मिनट तक क्रायोसेक्शन इनक्यूबेट करें।
  3. 5 मिनट के लिए पीएच 7.4 पीबीएस के साथ स्लाइड 3x कुल्ला।
  4. बढ़ते स्लाइड करने के लिए आगे बढ़ें । एक पीएच 7.4 (या अधिक बुनियादी) पॉलीविनाइल अल्कोहल बढ़ते समाधान जो ओ/एन को कठोर करता है, उसका उपयोग किया जा सकता है: स्लाइड और कवरस्लिप के बीच हवा के बुलबुले के गठन से बचने के लिए कवरस्लिप को सावधानीपूर्वक स्थिति दें।
  5. बढ़ते मध्यम को अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर कठोर O/N दें।
  6. pHluorin-plexinA1 संलयन प्रोटीन की सटीक कल्पना करने के लिए एक उल्टे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करें: इष्टतम पिनहोल और ऑप्टिकल रिज़ॉल्यूशन पर जेड-स्टैक करें और 20X (NA 0.75) या 40X (NA 1.3) लेंस का उपयोग करें।
    नोट: PHluorin GFP(यानी 509 एनएम पर उत्सर्जन चोटी) का पता लगाने के लिए उपयोग किए जाने वाले समान मापदंडों के साथ पता लगाया जा सकता है। तरंगदैर्ध्य उमंग और डिटेक्शन फ़िल्टर सेटिंग्स को इमेजिंग सॉफ्टवेयर द्वारा बेहतर ढंग से परिभाषित किया गया है। Hoechst 425-460 एनएम के बीच पता चला है (उत्तेजन 405 एनएम पर है), जीएफपी या pHluorin 485-545 एनएम के बीच पता चला है (उत्तेजन 473 एनएम पर है) और आरएफपी 575-675 एनएम के बीच पाया जाता है (विसर्जन 559 एनएम पर है)।

चिक भ्रूण रीढ़ की हड्डी में pHluorin-plexinA1 और eGFP अभिव्यक्ति के प्रतिनिधि छवियों चित्र 4में दिखाया गया है ।

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Representative Results

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Figure 1
चित्रा 1. A. सेलुलर संदर्भ में pHluorin-plexinA1 फ्लोरेसेंस गुणों की योजना। PHluorin इंट्रासेलुलर डिब्बों में गैर-प्रवाहकीय है जहां पीएच अम्लीय (<6) है जैसे कि तस्करी वेसिकुलीज में या एंडोसोम्स में और एक्सासेलर माध्यम के संपर्क में आने पर फ्लोरोसेंट होता है जहां पीएच तटस्थ होता है। यह केवल pHluorin-plexinA1 रिसेप्टर के सेल सतह पूल की कल्पना की अनुमति देता है। B. पीबीके-सीएमवी-पीएचलूरिन-प्लेक्सिनए1 क्लोनिंग साइट का नक्शा। माउस रिसेप्टर प्लेक्सिनए1 एक्सप्रेसिंग वेक्टर को रीढ़ की हड्डी के रूप में इस्तेमाल किया गया था। इस वेक्टर को प्लाज्मा झिल्ली पर कुशल वीएसवी-टैग रिसेप्टर प्रविष्टि प्राप्त करने के लिए इंजीनियर किया गया था। ऐसा करने के लिए, सेमाफोरिन 3ए पेप्टाइड सिग्नल और क्लीवेज साइट को वीएसवी-टैग किए गए रिसेप्टर के अपस्ट्रीम को अपने सिग्नल पेप्टाइड और क्लीवेज साइट से अलग किया गया था। पीसीआर द्वारा, एनआरयूआई/Kpn2I प्रतिबंध साइटों का उपयोग करके वीएसवी-टैग और PlxnA1 कोडिंग दृश्यों के बीच फ्रेम में pHluorin अनुक्रम डाला गया था । अन्य रिसेप्टर्स की क्लोनिंग रणनीति तैयार करने के लिए एकल प्रतिबंध साइटों को इंगित किया जाता है। यह योजना बायोइंफॉर्मेटिक सॉफ्टवेयर से अनुकूलित है।

Figure 2
चित्रा 2। PHluorin-plexinA1 का लक्षण वर्णन COS7 कोशिकाओं में पीएच-निर्भर फ्लोरोसेंट गुणों का निर्माण करता है। A. COS7 कोशिकाओं pHluorin-plexinA1 निर्माण के साथ संक्रमित जहां प्लाज्मा झिल्ली पर pHluorin-plexinA1 फ्लोरेसेंस के दृश्य की अनुमति एक confocal माइक्रोस्कोप के साथ मनाया । स्केल बार: 20 μM. बी COS7 कोशिकाओं pHluorin-plexinA1 निर्माण के साथ संक्रमित जहां एक पीएच ७.४ संस्कृति माध्यम में लाइव इमेजिंग के माध्यम से मनाया, पीएच ५.५ तक संस्कृति माध्यम के एसिडिफिकेशन के बाद और संस्कृति माध्यम में पीएच ७.४ की बहाली के बाद । सेल रूपरेखा GFP फ्लोरेसेंस अधिग्रहण पर एक धराशायी लाइन के साथ संकेत दिया जाता है । स्केल बार: 10 μM. बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3। ओवो इलेक्ट्रोपॉरेशन प्रक्रिया में। A. 1. खोल के सबसे बड़े पक्ष से एल्बमन हटाने। 2. भ्रूण तक पहुंचने के लिए अंडे के खोल को खिड़की। B. न्यूरल ट्यूब में डीएनए/फास्ट ग्रीन मिक्स इंजेक्शन। सी. तंत्रिका ट्यूब के दोनों ओर इलेक्ट्रोड रखना, दिल और बड़े जहाजों से बचना, और लड़की भ्रूण का विद्युतीकरण।

Figure 4
चित्र 4. pHluorin-plexinA1 इलेक्ट्रोपॉर्मेशन के बाद चिक न्यूरल ट्यूब क्रायोसेक्शन का सूक्ष्म विश्लेषण। इलेक्ट्रोपोरेटेड चिक स्पाइनल कॉर्ड में ईजीएफपी (ऊपरी पैनल) और पीएचलुरिन-प्लेक्सिनए1 (लोअर पैनल्स) अभिव्यक्ति पैटर्न के बीच तुलना दिखाई गई है। बढ़े हुए पैनल eGFP (ए) के फैलाना उपकोशिकीय स्थानीयकरण की तुलना में pHluorin-plexinA1 (a') के झिल्लीदार फ्लोरेसेंस दिखाते हैं। plexinA1 के बारे में, बढ़े हुए पैनल से पता चलता है कि यह रिसेप्टर विशेष रूप से फ्लोर प्लेट क्रॉसिंग (बी') पर प्लाज्मा झिल्ली पर समृद्ध है जो ईजीएफपी के लिए मामला नहीं है जो फर्श प्लेट क्रॉसिंग (बी) से पहले और बाद में समान रूप से व्यक्त किया जाता है। स्केल बार: 100 μM. FP: फ्लोर प्लेट; पूर्व: प्रीक्रॉसिंग; पोस्ट: पोस्टक्रॉसिंग। बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

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यह प्रोटोकॉल सेल संस्कृति और चिक भ्रूण रीढ़ की हड्डी के विकासात्मक संदर्भ में एक अक्षतं मार्गदर्शन रिसेप्टर की गतिशीलता का पालन करने के लिए एक कदम-दर-कदम प्रक्रिया प्रदान करता है।

एक डी नोवो pHluorin टैग प्रोटीन डिजाइन करने के लिए, क्लोनिंग रणनीति के बारे में दो बिंदुओं पर विचार करने की आवश्यकता है । सबसे पहले, प्लाज्मा झिल्ली रिसेप्टर पूल की कल्पना करने के लिए, पीएच्लीक एंडोसोम्स के ल्यूमेन के संपर्क में पीएचुअल एंडोसोम्स के लुमेन के संपर्क में होना चाहिए, और इसके परिणामस्वरूप, एक्सपेरिलर डिब्बे में। इस प्रकार, रिसेप्टर अनुक्रम के बारे में pHluorin अनुक्रम की सही स्थिति सीधे रिसेप्टर के प्रकार पर निर्भर है(यानी चाहे एन-टर्मिनल या रिसेप्टर के सी-टर्मिनल भाग बाह्य डिब्बे के संपर्क में है)। दूसरा, जैसा कि प्रोटोकॉल में बताया गया है, सिग्नल पेप्टाइड के सापेक्ष प्लूरिन अनुक्रम की स्थिति को पीएचलूरिन और ब्याज के रिसेप्टर के बीच बाद में दरार से बचने के लिए माना जाना चाहिए।

तकनीक की एक सीमा प्लाज्मा झिल्ली पर उनके सक्रियण के बाद रिसेप्टर्स की तस्करी से जुड़ी हुई है । आमतौर पर, रिसेप्टर्स आंतरिक होते हैं और कार्यात्मक और शारीरिक रूप से अलग-अलग डिब्बों से बने एंडोसाइटिक मार्ग के माध्यम से प्रगतिकरतेहैं। एटीपी-चालित प्रोटोन पंपों के कारण, एंडोसोम्स शुरुआती एंडोसोम्स में 6 के आसपास अम्लीय पीएच बनाए रखते हैं, लगभग 5 देर से एंडोसोम्स में, लाइसोसोम्स में 5 से कम, लेकिन इन दो एंडोसोम्स में एंडोसोम्स या 7.0 रीसाइक्लिंग में केवल 6.4 के आसपास। इस मुद्दे को कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस (टीआईआरएफ) माइक्रोस्कोपी16का उपयोग करके विट्रो में हल किया जा सकता है। इस तकनीक के लिए निहित एक दूसरी सीमा यह है कि, इसके अपेक्षाकृत बड़े आकार के कारण, पीएचलूरिन टैग टैग प्रविष्टि साइट के आधार पर रिसेप्टर गतिविधि को बाधित कर सकता है।

इसके फायदों के बावजूद, एक्सॉन नेविगेशन के दौरान झिल्ली प्रोटीन की गतिशीलता और विनियमन का अध्ययन करने के लिए pHluorin का व्यापक रूप से उपयोग नहीं किया गया है। सेमिनल वर्क्स ने विट्रो17में टर्निंग के दौरान एक्सोसाइटोसिस की स्पेटियो-टेम्पोरल गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए pHluorin का उपयोग किया है। वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम स्पष्ट करते हैं कि वीवो मेंएक्सोन की प्लाज्मा झिल्ली पर रिसेप्टर्स के वितरण की जांच करने के लिए कैसे pHluorin का उपयोग किया जा सकता है। चूंकि पीएचलूरिन आनुवंशिक रूप से इनकोड किए जाते हैं, इसलिए वे वीवो विश्लेषण में विशेष रूप से उपयुक्त होते हैं। यद्यपि हम ओवो इलेक्ट्रोपाउरेशन के बाद लड़की में इसके उपयोग का वर्णन करते हैं, इस दृष्टिकोण का उपयोग अन्य प्रजातियों में किया जा सकता है। वास्तव में इलेक्ट्रोपॉलेशन विभिन्न पशु मॉडलों में कुशलता से काम करता है18,19. इसके अलावा,20-23 सी एलिगेंस, ड्रोसोफिलाया माउस ट्रांसजेनिक जानवरों में पीएचएलयूआरिन का सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है।

चूंकि पीएच-निर्भर परिवर्तन मिलीसेकंड रेंज में होता है, इसलिए पीएचलूरिन विशेष रूप से लाइव इमेजिंग6,24के लिए अनुकूलित होते हैं। उदाहरण के लिए, PHluorin संलयन का उपयोग ट्रांसजेनिक चूहों23से घ्राण संवेदी न्यूरॉन्स में सिनैप्टोब्रेविन एक्सोसाइटोसिस की वीवो गतिशीलता में निगरानी करने के लिए किया गया है। वीवो लाइव इमेजिंग में प्लूरिन फ्यूजन के काफी वादे हैं क्योंकि लाइव इमेजिंग (फास्ट इमेजिंग और कम फोटोकॉक्सीसिटी) के अनुकूल कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप अधिक कुशल और सुलभ25हो जाते हैं। वीवो में लाइव इमेजिंग को फोटोब्लैचिंग (एफआरएपी) के बाद फ्लोरेसेंस रिकवरी के साथ भी जोड़ा जा सकता है ताकि एक्सोसाइटोसिस या प्रसार का आकलन अधिक सीधे26किया जा सके।

अन्य पीएच-संवेदनशील वेरिएंट और उनके संयोजनों का उपयोग अनुप्रयोगों की सीमा को और बढ़ा सकता है। विभिन्न ऑर्गेनेल्स में रिसेप्टर के गतिशील वितरण की निगरानी अनुपातमेट्रिक प्लूरिन का उपयोग करके की जा सकती है जो डिब्बे6,27के पीएच के अनुसार फ्लोरेसेंस बदलता है। इसी प्रकार, एक क्रांतिमानी फालुरिन में घुलने-मिलने वाले झिल्ली प्रोटीन में पीएच-असंवेदनशील फ्लोरोसेंट प्रोटीन के अलावा इसकी तस्करी28में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है । इसके अलावा हाल ही में29 को होने वाली क्लोनिंग से एक साथ दो रिसेप्टर्स की निगरानी हो सकेगी। यह रिसेप्टर परिसरों के गठन में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। चूंकि pHluorin का उपयोग मार्गदर्शन संकेतों30,लिगांड की दोहरी इमेजिंग को टैग करने के लिए भी किया जा सकता है, और इसका रिसेप्टर भी व्यवहार्य है।

इस प्रोटोकॉल में फ्यूजन प्रोटीन की अभिव्यक्ति दर एक महत्वपूर्ण बिंदु है और विशेष रूप से प्रमोटर की ताकत, फ्यूजन प्रोटीन की स्थिरता और कोशिकाओं को पार करने के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले प्लाज्मिड की मात्रा पर निर्भर करता है। दरअसल, जब अतिउपृषित, संलयन प्रोटीन इंट्रासेलुलर वेसिकल्स में जमा हो सकता है और फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि दिखाई दे सकती है। इस प्रकार, सेल की सतह पर प्लूरिन फ्यूज्ड प्रोटीन के सटीक दृश्य को प्राप्त करने के लिए कई अनुकूलन आवश्यक हो सकते हैं। इसके अलावा, फिक्स्ड टिश्यू में प्लूरिन-फ्यूजन प्रोटीन के इस्तेमाल के दौरान और निर्धारण के बाद विशेष देखभाल की आवश्यकता होती है। दरअसल, pHluorin संलयन प्रोटीन की संरचना का स्थिरीकरण केवल अस्थायी हो सकता है। इस प्रकार, पीएच को पीएच को 7 से ऊपर रखा जाना चाहिए ताकि पीएचलूरिन सिग्नल के नुकसान को रोका जा सके। इसके अलावा, निर्धारण के तुरंत बाद टिप्पणियों को किया जाना चाहिए । इष्टतम समय को उपयोगकर्ताओं द्वारा उनके विशेष pHluorin संलयन प्रोटीन के अनुसार परिभाषित करने की आवश्यकता हो सकती है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम होमायरा नवाबी, फ्रेडेरिक मोरेट और इसाबेल संन्यास को उनकी मदद के लिए धन्यवाद देते हैं । इस काम को सीएनआरएस, एसोसिएशन फ्रैंकाइज कॉन्ट्रोवर्सी लेस मायोपैथी (एएफएम), एएनआर याडल, लेटेक्स देववेकर, लेटेक्स कॉर्टेक्स, ईआरसी योडा से वी.C तक समर्थित है। सी.डी.बी और ए.जे. क्रमशः ला लिग कॉन्ट्रोवर्सी ले कैंसर और लेटेक्स देववेकन फैलोशिप द्वारा समर्थित हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
COS7 cells ATCC CRL-1651
DMEM GlutaMAX GIBCO 61965-026
Sodium pyruvate GIBCO 11360-039
Amphotericin B Sigma A2942
Fetal bovine serum GIBCO 10270-106
Penicillin/Streptomycin GIBCO 15140-122
Exgen500 reagent Euromedex Fermentas ET0250
PBS -Ca2+ -Mg2+ GIBCO 14190-094
Fast green dye Sigma F7252
32% Paraformaldehyde aqueous solution Electron Microscopy 15714-S Dilute extemporaneously in PBS to achieve a 4% solution
Gelatin from cold water fish skin Sigma G7041
Sucrose Sigma S0389
Cryomount Histolab 00890
Hoechst 34580 Invitrogen H21486
Mowiol 4-88 Fluka 81381
Consumables
Bottom-glass 35 mm dish MatTek P35G-1.5-14-C
5 ml Syringe Terumo SS-05S
Needles 0.9 mm x 25 mm Terumo NN-2025R
Capillaries CML PP230PO capillaries are stretched manually in the flame
Superfrost Plus Slides Thermo Scientific 4951PLUS
Material
Curved scissors FST 129-10
Microscalpel FST 10316-14
Forceps FST Dumont #5 REF#11254
Equipment/software
Time lapse microscope Zeiss Observer 1
Temp module S PECON for Zeiss
CO2 module S PECON for Zeiss
Metamorph software Metamorph
Eggs incubator Sanyo MIR154
Electroporator apparatus Nepa Gene CO., LTD CUY21
Electrodes Nepa Gene CO., LTD CUY611P7-4 4 mm platinum electrodes
Fluorescence stereomicroscope LEICA MZ10F
Cryostat MICROM HM550
Confocal microscope Olympus FV1000, X81
Fluoview software Olympus
CLC Main Workbench software CLC Bio

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References

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सेल कल्चर और चिक भ्रूण में एक्सॉन गाइडेंस रिसेप्टर्स की गतिशीलता का आकलन करने के लिए pHluorin का उपयोग
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Delloye-Bourgeois, C., Jacquier, A., Falk, J., Castellani, V. Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo. J. Vis. Exp. (83), e50883, doi:10.3791/50883 (2014).More

Delloye-Bourgeois, C., Jacquier, A., Falk, J., Castellani, V. Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo. J. Vis. Exp. (83), e50883, doi:10.3791/50883 (2014).

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