세포 배양과 병아리 배아에서 축슨 유도 수용체의 역학을 평가하기 위해 pHluorin의 사용
Summary
우리는 여기에서 pH 에 민감한 녹색 형광 단백질 변이체, pHluorin의 사용을 설명, 축 슨 유도 수용체의 스파티오-측두동역학을 연구 하는 세포 표면에 인신 매매. pHluorin 태그 수용체는 병아리 배아의 전기 기공을 사용하여 세포 배양 및 생체 내에서모두 표현된다.
Abstract
개발 하는 동안, 축 하 안내 수용 체 매력적이 고 반발 단서 모두에 축 슨 감도 조절에 중요 한 역할을. 실제로, 유도 수용체의 활성화는 축축기 팁, 성장 콘, 리간드에 반응하는 신호 메커니즘의 첫 번째 단계이다. 따라서 셀 표면에서의 가용성을 조절하는 것은 성장 원뿔 감도 설정에 참여하는 메커니즘 중 하나입니다. 우리는 여기에서 개발 중인 병아리 척수에서 체외 및 생체 내 모두에서 축소 유도 수용체의 현세세포 표면 역학을 정확하게 시각화하는 방법을 설명합니다. 우리는 플라즈마 막에 해결되는 축축물 유도 수용체의 분획을 구체적으로 검출하기 위해 녹색 형광 단백질 (GFP) 변이체의 pH 의존형 형광 특성을 이용했습니다. 우리는 먼저 이러한 pH 의존 구조의 체외 검증을 설명하고 우리는 더 관심축산축산구체의 스페티오 -측두동역학을 평가하기 위해, 병아리 척추 화음에서 생체 내에서의사용을 자세히 설명합니다.
Introduction
탐색 하는 동안 축 하 그들의 대상을 향해 그들을 안내 하는 여러 환경 단서를 통합. 이러한 단서는 축축단 단자 표면의 안내 수용체를 활성화, 성장 콘, 차례로 적절한 신호 경로를 시작합니다. 따라서, 수용체의 세포 표면 분포의 시간적 및 공간 조절은 성장 원뿔1의감도를 설정하는 데 중요하다. 이러한 맥락에서, 상생축축에 의한 중간선 횡단은 수용체 세포 표면 수준의 조절을 조사하는 우수한 모델이다. 개발 척수에서, commissural 축축은 처음에 그들이 중간라인을 건너 복부 바닥 플레이트쪽으로 끌리고 있습니다. 횡단 후, 그들은 바닥 플레이트 매력에 대한 응답성을 잃고 바닥 판 기피제에 대한 반응을 얻어 서 바닥 판을 빠져 나와 신경계2,3의단점 면에서 최종 목적지로 이동할 수 있습니다. 성장 콘 표면에서 수용체 가용성의 조절은 미드 라인 큐4,5에응답의 전환의 기초 메커니즘 중 하나입니다. 따라서, 성장 콘의 혈장 막에 존재하는 수용체의 선택적 모니터링은 매우 중요하다. 당사는 개발 중인 병아리 척수에서 시험관 내 및 생체 내 혈장 막에 해결되는 축축 유도 수용체를 구체적으로 시각화하기 위해 녹색 형광 단백질(GFP) 변이체의 pH 의존형 형광 성질을기반으로 하는 방법을 설명한다.
로스만 과 동료는 일식 pHluorin6을포함하여 GFP의 포인트 돌연변이 pH 민감 변이체에 의해 설계되었다. 이클립성 pHluorin은 산성 pH (<6)에 노출될 때 불형성인 성질을 가지며, 중성 pH에서 형광이 되는 동안. 이를 통해 세포내 산성구획(즉, 내성, 인신매매 소포)에서 국소화된 비형성 수용체를 혈장 막에 통합하여 세포외 중립 pH7에노출된 형광 수용체로부터 구별할 수 있다. 이를 통해 미들라인 충충제 세마포린 3B5(도 1A)에 대한 성장 콘 반응을 중재하는 축삭 유도 수용체인 plexinA1의 플라즈마 막 국소화를 모니터링하였다. 우리는 여기에 pHluorin-plexinA1 구조의 체외 특성화를 설명, 개발 병아리 척수에서이 구조의 오보 전기화8-10에 다음 공간 및 측두해상도 모두 생체 내에서 축삭 유도 수용체 역학을 따를 수 있도록 극저온 섹션의 현미경 분석.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 세포 배양과 병아리 배아 척수의 발달 맥락에서 축축한 유도 수용체의 역학을 따르는 단계별 절차를 제공합니다.
드 노보 pHluorin 태그 단백질을 설계하려면 복제 전략에 관한 두 점을 고려해야합니다. 먼저, pHluorin 태그는 산성 내종의 루멘에 노출되어야하며, 결과적으로 혈장 막 수용체 풀을 시각화하기 위해 세포외 구획에 노출되어야 한다. 따라서, 수?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
호미라 나와비, 프레드릭 모트, 이자벨 산야스의 도움에 감사드립니다. 이 작품은 CNRS에 의해 지원됩니다, 협회 프랑카이스 contre 레 Myopathies (AFM), ANR YADDLE, 라벡데베칸, 라벡스 피질, V.C.; C.D-B와 A.J는 라 리그 콘트레 르 암과 라벡스 DevWeCan 펠로우십에 의해 각각 지원됩니다.
Materials
| COS7 cells | ATCC | CRL-1651 | |
| DMEM GlutaMAX | GIBCO | 61965-026 | |
| Sodium pyruvate | GIBCO | 11360-039 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO | 10270-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Exgen500 reagent | Euromedex Fermentas | ET0250 | |
| PBS -Ca2+ -Mg2+ | GIBCO | 14190-094 | |
| Fast green dye | Sigma | F7252 | |
| 32% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy | 15714-S | Dilute extemporaneously in PBS to achieve a 4% solution |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7041 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Cryomount | Histolab | 00890 | |
| Hoechst 34580 | Invitrogen | H21486 | |
| Mowiol 4-88 | Fluka | 81381 | |
| Consumables | |||
| Bottom-glass 35 mm dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| 5 ml Syringe | Terumo | SS-05S | |
| Needles 0.9 mm x 25 mm | Terumo | NN-2025R | |
| Capillaries | CML | PP230PO | capillaries are stretched manually in the flame |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | 4951PLUS | |
| Material | |||
| Curved scissors | FST | 129-10 | |
| Microscalpel | FST | 10316-14 | |
| Forceps | FST | Dumont #5 REF#11254 | |
| Equipment/software | |||
| Time lapse microscope | Zeiss | Observer 1 | |
| Temp module S | PECON for Zeiss | ||
| CO2 module S | PECON for Zeiss | ||
| Metamorph software | Metamorph | ||
| Eggs incubator | Sanyo | MIR154 | |
| Electroporator apparatus | Nepa Gene CO., LTD | CUY21 | |
| Electrodes | Nepa Gene CO., LTD | CUY611P7-4 | 4 mm platinum electrodes |
| Fluorescence stereomicroscope | LEICA | MZ10F | |
| Cryostat | MICROM | HM550 | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000, X81 | |
| Fluoview software | Olympus | ||
| CLC Main Workbench software | CLC Bio | ||
References
- Winckler, B., Mellman, I. Trafficking guidance receptors. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, (2010).
- Jacob, T. C., et al. . J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).
- Nawabi, H., Castellani, V. Axonal commissures in the central nervous system: how to cross the midline. Cell Mol. Life Sci. 68, 2539-2553 (2011).
- Keleman, K., Ribeiro, C., Dickson, B. J. Comm function in commissural axon guidance: cell-autonomous sorting of Robo in vivo. Nat. Neurosci. 8, 156-163 (2005).
- Nawabi, H., et al. A midline switch of receptor processing regulates commissural axon guidance in vertebrates. Genes Dev. 24, 396-410 (2010).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Miesenbock, G. Synapto-pHluorins: genetically encoded reporters of synaptic transmission. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 213-217 (2012).
- Avraham, O., Zisman, S., Hadas, Y., Vald, L., Klar, A. Deciphering axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the chick neural tube utilizing in ovo electroporation. J. Vis. Exp. (39), 1792-17 (2010).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos. J. Vis. Exp. (9), (2007).
- Wilson, N. H., Stoeckli, E. T. In ovo electroporation of miRNA-based plasmids in the developing neural tube and assessment of phenotypes by DiI injection in open-book preparations. J. Vis. Exp. (68), (2012).
- Rohm, B., Ottemeyer, A., Lohrum, M., Puschel, A. W. Plexin/neuropilin complexes mediate repulsion by the axonal guidance signal semaphorin 3A. Mech. Dev. 93, 95-104 (2000).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. J. Vis. Exp. (8), (2007).
- Alberts, P., et al. Cdc42 and actin control polarized expression of TI-VAMP vesicles to neuronal growth cones and their fusion with the plasma membrane. Mol. Biol. Cell. 17, 1194-1203 (2006).
- Perret, E., Lakkaraju, A., Deborde, S., Schreiner, R., Rodriguez-Boulan, E. Evolving endosomes: how many varieties and why. Curr. Opin. Cell Biol. 17, 423-434 (2005).
- Li, Y., et al. Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons. J. Vis. Exp. (69), (2012).
- Tojima, T., Itofusa, R., Kamiguchi, H. Asymmetric clathrin-mediated endocytosis drives repulsive growth cone guidance. Neuron. 66, 370-377 (2010).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J. Vis. Exp. (54), 3024-30 (2011).
- Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Dev. Biol. 7 (107), (2007).
- Holzhausen, L. C., Lewis, A. A., Cheong, K. K., Brockerhoff, S. E. Differential role for synaptojanin 1 in rod and cone photoreceptors. J. Comp. Neurol. 517, 633-644 (2009).
- Shang, Y., Claridge-Chang, A., Sjulson, L., Pypaert, M., Miesenbock, G. Excitatory local circuits and their implications for olfactory processing in the fly antennal lobe. Cell. 128, 601-612 (2007).
- Dittman, J. S., Kaplan, J. M. Factors regulating the abundance and localization of synaptobrevin in the plasma membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11399-11404 (2006).
- Bozza, T., McGann, J. P., Mombaerts, P., Wachowiak, M. In vivo imaging of neuronal activity by targeted expression of a genetically encoded probe in the mouse. Neuron. 42, 9-21 (2004).
- Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. Real-time measurements of vesicle-SNARE recycling in synapses of the central nervous system. Nat. Cell. Biol. 2, 197-204 (2000).
- Stark, D. A., Kasemeier-Kulesa, J. C., Kulesa, P. M. Photoactivation cell labeling for cell tracing in avian development. CSH Protoc.. 2008, (2008).
- Hildick, K. L., Gonzalez-Gonzalez, I. M., Jaskolski, F., Henley, J. M. Lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching. J. Vis. Exp. (60), (2012).
- Hanson, G. T., et al. Green fluorescent protein variants as ratiometric dual emission pH sensors. 1. Structural characterization and preliminary application. Biochemistry. 41, 15477-15488 (2002).
- Rose, T., Schoenenberger, P., Jezek, K., Oertner, T. G. Developmental refinement of vesicle cycling at schaffer collateral synapses. Neuron. 77, 1109-1121 (2013).
- Li, Y., Tsien, R. W. pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity. Nat. Neurosci. 15, 1047-1053 (2012).
- de Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons. J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).
