Bruk av pHluorin for å vurdere dynamikken i Axon-veiledningsreseptorer i cellekultur og i chick-embryoet
Summary
Vi beskriver her bruken av en pH-sensitiv grønn fluorescerende proteinvariant, pHluorin, for å studere den romlige-temporale dynamikken i axonveiledningsreseptorer som smugler på celleoverflaten. Den pHluorin-taggede reseptoren uttrykkes både i cellekultur og in vivo, ved hjelp av elektroporasjon av kyllingembryoet.
Abstract
Under utviklingen spiller axonveiledningsreseptorer en avgjørende rolle i å regulere axonenes følsomhet for både attraktive og frastøtende signaler. Faktisk er aktivering av veiledningsreseptorene det første trinnet i signalmekanismene som tillater axonspisser, vekstkjeglene, å svare på ligandene. Som sådan er moduleringen av deres tilgjengelighet på celleoverflaten en av mekanismene som deltar i å sette vekstkjeglefølsomheten. Vi beskriver her en metode for å visualisere den romlige-temporale celleoverflatedynamikken til en axonveiledningsreseptor både in vitro og in vivo i den utviklende kyllingens ryggmarg. Vi benyttet oss av den pH-avhengige fluorescensegenskapen til en grønn fluorescerende proteinvariant (GFP) for å spesifikt oppdage brøkdelen av axonveiledningsreseptoren som er adressert til plasmamembranen. Vi beskriver først in vitro-valideringen av slike pH-avhengige konstruksjoner, og vi beskriver ytterligere deres bruk in vivo, i kyllingens spinal akkord, for å vurdere den romlige-temporale dynamikken i axonveiledningsreseptoren av interesse.
Introduction
Under navigasjonen integrerer axoner flere miljøsignaler som veileder dem mot målet. Disse signalene aktiverer veiledningsreseptorer på overflaten av axonterminaler, vekstkjeglene, som igjen starter en passende signalvei. Dermed er den tidsmessige og romlige reguleringen av celleoverflatefordelingen av reseptorene avgjørende for å sette følsomheten til vekstkjeglen1. I denne sammenhengen er midtlinjekryssing av kommissurale axoner en utmerket modell for å undersøke reguleringen av reseptorcelleoverflatenivåer. I den utviklende ryggmargen tiltrekkes kommissurale aksoner i utgangspunktet mot ventral gulvplate der de krysser midtlinjen. Etter kryssing mister de sin respons på gulvplatens tiltrekningsmidler og får respons på gulvplateavstøtende midler slik at de kan gå ut av gulvplaten og navigere mot deres endelige destinasjon i den kontralaterale siden av nervesystemet2,3. Regulering av reseptortilgjengelighet på vekstkjegleoverflaten er en av mekanismene som ligger til grunn for overgangen av respons til midtlinjesignaler4,5. Dermed er selektiv overvåking av reseptorene som er tilstede ved plasmamembranen av vekstkjegler av største betydning. Vi beskriver her en metode basert på den pH-avhengige fluorescensegenskapen til en grønn fluorescerende protein (GFP) -variant for å visualisere axonveiledningsreseptorene som er adressert til plasmamembranin vitro og in vivo, i den utviklende kyllingens ryggmarg.
Rothman og kolleger konstruert av punktmutasjoner pH-sensitive varianter av GFP inkludert ecliptic pHluorin6. Ecliptic pHluorin har egenskapen til å være ikke-påvirkende når den utsettes for sur pH (<6), samtidig som den er fluorescerende ved nøytral pH. Dette gjør det mulig å skille nonfluorescent reseptorer lokalisert i intracellulære sure rom (dvs. endosomer, trafficking vesicles) fra fluorescerende reseptorer innlemmet i plasmamembranen og dermed utsatt for den ekstracellulære nøytrale pH7. Vi benyttet oss av dette for å overvåke plasmamembranlokaliseringen av plexinA1, en axonveiledningsreseptor som formidler vekstkjegleresponsen til midtlinjeavstøtende semaphorin 3B5 (figur 1A). Vi beskriver her in vitro karakterisering av en pHluorin-plexinA1 konstruksjon, sammen med i ovo elektroporasjon8-10 av denne konstruksjonen i den utviklende kylling ryggmargen etterfulgt av mikroskopisk analyse av kryoseksjoner som gjør det mulig å følge axon veiledning reseptor dynamikken in vivo med både romlige og temporale oppløsninger.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen gir en trinnvis prosedyre for å følge dynamikken i en axonveiledningsreseptor både i cellekultur og i utviklingskonteksten til kyllingembryoens ryggmarg.
For å designe et de novo pHluorin-merket protein, må to punkter vurderes angående kloningsstrategien. For det første bør pHluorin-taggen eksponeres for lumen av de sure endosomene, og følgelig til det ekstracellulære rommet for å visualisere plasmamembranreseptorbassenget. Dermed er riktig posisjonering a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Homaira Nawabi, Frederic Moret og Isabelle Sanyas for deres hjelp. Dette arbeidet støttes av CNRS, Association Francaise contre les Myopathies (AFM), ANR YADDLE, Labex DevWeCan, Labex Cortex, ERC YODA til V.C.; C.D-B og A.J støttes av henholdsvis la Ligue contre le cancer og Labex DevWeCan fellowships.
Materials
| COS7 cells | ATCC | CRL-1651 | |
| DMEM GlutaMAX | GIBCO | 61965-026 | |
| Sodium pyruvate | GIBCO | 11360-039 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO | 10270-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Exgen500 reagent | Euromedex Fermentas | ET0250 | |
| PBS -Ca2+ -Mg2+ | GIBCO | 14190-094 | |
| Fast green dye | Sigma | F7252 | |
| 32% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy | 15714-S | Dilute extemporaneously in PBS to achieve a 4% solution |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7041 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Cryomount | Histolab | 00890 | |
| Hoechst 34580 | Invitrogen | H21486 | |
| Mowiol 4-88 | Fluka | 81381 | |
| Consumables | |||
| Bottom-glass 35 mm dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| 5 ml Syringe | Terumo | SS-05S | |
| Needles 0.9 mm x 25 mm | Terumo | NN-2025R | |
| Capillaries | CML | PP230PO | capillaries are stretched manually in the flame |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | 4951PLUS | |
| Material | |||
| Curved scissors | FST | 129-10 | |
| Microscalpel | FST | 10316-14 | |
| Forceps | FST | Dumont #5 REF#11254 | |
| Equipment/software | |||
| Time lapse microscope | Zeiss | Observer 1 | |
| Temp module S | PECON for Zeiss | ||
| CO2 module S | PECON for Zeiss | ||
| Metamorph software | Metamorph | ||
| Eggs incubator | Sanyo | MIR154 | |
| Electroporator apparatus | Nepa Gene CO., LTD | CUY21 | |
| Electrodes | Nepa Gene CO., LTD | CUY611P7-4 | 4 mm platinum electrodes |
| Fluorescence stereomicroscope | LEICA | MZ10F | |
| Cryostat | MICROM | HM550 | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000, X81 | |
| Fluoview software | Olympus | ||
| CLC Main Workbench software | CLC Bio | ||
References
- Winckler, B., Mellman, I. Trafficking guidance receptors. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, (2010).
- Jacob, T. C., et al. . J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).
- Nawabi, H., Castellani, V. Axonal commissures in the central nervous system: how to cross the midline. Cell Mol. Life Sci. 68, 2539-2553 (2011).
- Keleman, K., Ribeiro, C., Dickson, B. J. Comm function in commissural axon guidance: cell-autonomous sorting of Robo in vivo. Nat. Neurosci. 8, 156-163 (2005).
- Nawabi, H., et al. A midline switch of receptor processing regulates commissural axon guidance in vertebrates. Genes Dev. 24, 396-410 (2010).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Miesenbock, G. Synapto-pHluorins: genetically encoded reporters of synaptic transmission. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 213-217 (2012).
- Avraham, O., Zisman, S., Hadas, Y., Vald, L., Klar, A. Deciphering axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the chick neural tube utilizing in ovo electroporation. J. Vis. Exp. (39), 1792-17 (2010).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos. J. Vis. Exp. (9), (2007).
- Wilson, N. H., Stoeckli, E. T. In ovo electroporation of miRNA-based plasmids in the developing neural tube and assessment of phenotypes by DiI injection in open-book preparations. J. Vis. Exp. (68), (2012).
- Rohm, B., Ottemeyer, A., Lohrum, M., Puschel, A. W. Plexin/neuropilin complexes mediate repulsion by the axonal guidance signal semaphorin 3A. Mech. Dev. 93, 95-104 (2000).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. J. Vis. Exp. (8), (2007).
- Alberts, P., et al. Cdc42 and actin control polarized expression of TI-VAMP vesicles to neuronal growth cones and their fusion with the plasma membrane. Mol. Biol. Cell. 17, 1194-1203 (2006).
- Perret, E., Lakkaraju, A., Deborde, S., Schreiner, R., Rodriguez-Boulan, E. Evolving endosomes: how many varieties and why. Curr. Opin. Cell Biol. 17, 423-434 (2005).
- Li, Y., et al. Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons. J. Vis. Exp. (69), (2012).
- Tojima, T., Itofusa, R., Kamiguchi, H. Asymmetric clathrin-mediated endocytosis drives repulsive growth cone guidance. Neuron. 66, 370-377 (2010).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J. Vis. Exp. (54), 3024-30 (2011).
- Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Dev. Biol. 7 (107), (2007).
- Holzhausen, L. C., Lewis, A. A., Cheong, K. K., Brockerhoff, S. E. Differential role for synaptojanin 1 in rod and cone photoreceptors. J. Comp. Neurol. 517, 633-644 (2009).
- Shang, Y., Claridge-Chang, A., Sjulson, L., Pypaert, M., Miesenbock, G. Excitatory local circuits and their implications for olfactory processing in the fly antennal lobe. Cell. 128, 601-612 (2007).
- Dittman, J. S., Kaplan, J. M. Factors regulating the abundance and localization of synaptobrevin in the plasma membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11399-11404 (2006).
- Bozza, T., McGann, J. P., Mombaerts, P., Wachowiak, M. In vivo imaging of neuronal activity by targeted expression of a genetically encoded probe in the mouse. Neuron. 42, 9-21 (2004).
- Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. Real-time measurements of vesicle-SNARE recycling in synapses of the central nervous system. Nat. Cell. Biol. 2, 197-204 (2000).
- Stark, D. A., Kasemeier-Kulesa, J. C., Kulesa, P. M. Photoactivation cell labeling for cell tracing in avian development. CSH Protoc.. 2008, (2008).
- Hildick, K. L., Gonzalez-Gonzalez, I. M., Jaskolski, F., Henley, J. M. Lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching. J. Vis. Exp. (60), (2012).
- Hanson, G. T., et al. Green fluorescent protein variants as ratiometric dual emission pH sensors. 1. Structural characterization and preliminary application. Biochemistry. 41, 15477-15488 (2002).
- Rose, T., Schoenenberger, P., Jezek, K., Oertner, T. G. Developmental refinement of vesicle cycling at schaffer collateral synapses. Neuron. 77, 1109-1121 (2013).
- Li, Y., Tsien, R. W. pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity. Nat. Neurosci. 15, 1047-1053 (2012).
- de Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons. J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).
