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Chemistry

La fonctionnalisation assistée par micro-ondes de poly (éthylène glycol) et peptides sur-résine pour l'utilisation dans la polymérisation en chaîne et de la Formation hydrogel

Published: October 29, 2013 doi: 10.3791/50890
Automatic Translation
1, 2, 1,2,3
1Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, 2Department of Chemical Engineering, University of Rochester, 3Center for Musculoskeletal Research, University of Rochester Medical Center

Summary

Cette vidéo d'illustration, un procédé rapide et efficace de méthacrylate de poly (éthylène glycol), permettant à des polymérisations en chaîne et la synthèse de l'hydrogel. Il démontrera comment introduire similaire fonctionnalités de méthacrylamide en peptides, les méthodes d'analyse communs de détail pour évaluer l'efficacité de la fonctionnalisation, des suggestions pour le dépannage et les modifications avancées, et la démonstration de techniques typiques hydrogel de caractérisation.

Abstract

L'un des principaux avantages à l'utilisation de poly (éthylène glycol) (PEG) macromères dans la formation de l'hydrogel, c'est la polyvalence synthétique. La capacité de tirer une grande variété de poids et configurations moléculaires de PEG (nombre de bras, longueur des bras et le motif de ramification) offre aux chercheurs un contrôle serré sur résultant structures et propriétés, y compris le module de Young et maillage hydrogel. Cette vidéo illustre, une méthode rapide, efficace, sans solvant assistée par micro-ondes à méthacrylate précurseurs PEG en poly (éthylène glycol) diméthacrylate (PEGDM). Cette méthode de synthèse fournit les matériaux de départ plus que nécessaires pour des applications dans l'administration de médicaments et la médecine régénérative. La méthode illustrée est supérieure aux méthodes de méthacrylation traditionnels car il est nettement plus rapide et plus simple, ainsi que plus économique et plus respectueux de l'environnement, en utilisant de plus petites quantités de réactifs et de solvants. Nous allons également démontrer une adaptation de cette technique pour méthacrylate en résinefonctionnalisation ylamide de peptides. Cette méthode permet à la résine N-terminale de peptides à être fonctionnalisé avec des groupes méthacrylamide avant déprotection et clivage de la résine. Cela permet d'addition sélective de groupes de méthacrylamide à l'extrémité N-terminales des peptides alors que des acides aminés avec des groupes réactifs latéraux (amine primaire, par exemple de la lysine, de l'alcool primaire de la sérine, d'alcools secondaires de la thréonine et de phénol de la tyrosine) restent protégés, empêchant fonctionnalisation à plusieurs sites. Cet article va méthodes analytiques communes de détail (protons de spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (, H-RMN) et Matrix Assisted Laser désorption ionisation temps de vol spectrométrie de masse (MALDI-TOF)) pour évaluer l'efficacité des fonctionnalisations. Pièges et suggéré des méthodes de résolution de problèmes courants seront abordés, tout comme les modifications de la technique qui peut être utilisée pour d'autres fonctionnalités tune macromère et hydrogel résultant physique et chimiquepropriétés. L'utilisation de produits de synthèse pour la formation d'hydrogels pour la livraison de drogue et les études d'interaction cellule-matériau sera démontré, avec une attention particulière accordée à la modification de la composition d'hydrogel d'affecter le maillage, le contrôle de la rigidité d'hydrogel et la libération du médicament.

Introduction

Poly (éthylène glycol) (PEG) hydrogels sont biomatériaux couramment utilisés en médecine régénérative et de livraison de drogue applications 1-3. Ces hydrogels offrent des avantages significatifs par rapport aux autres biomatériaux. Hydrogels de PEG sont synthétiques, offrant un degré élevé de contrôle sur les propriétés mécaniques telles que le module d'élasticité et le taux de dégradation par rapport à leurs homologues de biomatériaux naturels 1. Comme ils sont un dérivé synthétique, PEG a beaucoup moins de variabilité de lot à lot par rapport à des matériaux d'origine naturelle 4. Du fait de la composition chimique du PEG, ces hydrogels sont hautement hydrophile, résistant à l'adsorption des protéines, et biocompatible 3. Cette résistance à l'adsorption des protéines permet hydrogels de PEG à agir comme un «ardoise vierge», qui permet aux chercheurs d'interroger et étudier les facteurs biologiques ou chimiques spécifiques (médicaments, biomolécules, des peptides d'adhésion cellulaire, etc) et les rôles spécifiques de ces factors jouent dans le contrôle de la cellule et / ou le comportement des tissus.

Figure 1
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Figure 1: Exemples de poly (éthylène glycol) (PEG) architectures A) PEG linéaire B) 4 bras de PEG avec un pentaérythritol noyau C) 8-bras de PEG avec un noyau de hexaglycérol D) 8-bras de PEG avec un.... tripentaérythritol noyau. n est le nombre de PEG se répète sur chaque bras. Chaque répétition a un poids moléculaire de 44 g / mol, par conséquent, n peut être calculé à partir du poids moléculaire global et la structure / le bras #.

Précurseurs PEG sont disponibles avec une variété d'architectures et de poids moléculaires (Figure 1 ). Faire varier l'architecture (bras #) et répète l'éthylène glycol (n) de PEG peuvent être utilisés pour contrôler les propriétés des réseaux d'hydrogels formés à partir de ces macromères. PEG non modifié contient des groupes hydroxyle terminaux qui doivent être remplacées par une autre fonctionnalité pour faciliter la réticulation covalente par l'intermédiaire de polymérisations, la stratégie de reticulation le plus couramment employé pour les hydrogels de PEG, avant la formation de réseaux d'hydrogel. Il existe une variété de groupes chimiques qui peuvent être incorporés dans des macromères PEG pour faciliter la polymérisation et la réticulation du réseau (acrylate, méthacrylate, éther de vinyle, le norbornène, etc.) En dépit de la variété de fonctionnalités de terminaux disponibles pour faciliter la réticulation, il n'y a que deux mécanismes par lesquels la polymérisation peut se produire: l'étape et à croissance de chaîne (ou un mélange des deux, en mode mixte).

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Résultats de polymérisation théorique réseau hydrogel schématique A) traditionnelles résultats de polymérisation en chaîne croissance dans des réseaux hétérogènes contenant poly dense (méthacrylate) régions et l'augmentation des idéalités de réseau tels que les boucles, les précurseurs n'ayant pas réagi, et enchevêtrements permanents réticulation B) étape de croissance dans: Figure 2.. structures de réseau nettement plus homogènes (pas à l'échelle).

Des fonctionnalités réticulables via polymérisation en chaîne croissance ne nécessitent pas la présence d'un agent de reticulation supplémentaire. Toutefois, les hydrogels polymérisés à chaîne produisent des structures de réseaux hétérogènes contenant des régions de réticulation dense (Figure 2A) 1. En revanche, l'étape de croissance polymérisation exires l'utilisation d'un agent de réticulation ou de co-monomère qui est réactif avec les groupes fonctionnels terminaux des macromères PEG. Étant donné que les groupes fonctionnels terminaux sur le PEG ne peuvent réagir avec l'agent de réticulation et l'agent de reticulation ne peuvent réagir avec les groupes fonctionnels terminaux sur le PEG, il en résulte une plus grande homogénéité de la structure du réseau (figure 2B) 1. Polymérisations étape de croissance aussi généralement conduisent à une plus grande conversion de groupes fonctionnels, la diminution de la quantité de précurseurs n'ayant pas réagi et le potentiel de réponses immunitaires / inflammatoires dues à solubles, macromères non constituées en société 1. Procédés de polymérisation en mode mixte ont également été développés qui combinent à la fois l'étape de polymérisation et de croissance en chaîne grâce à l'utilisation de macromères qui peut à la fois auto-réagir (chaîne de croissance) et réagir avec un agent de réticulation (étape de croissance). On obtient des hydrogels avec des caractéristiques de chacun des mécanismes de polymérisation, et peut être utilisé pour produire des structures de réseau plus complexes et diversifiés que soitétape ou réseaux à croissance de chaîne seuls 1.

Bien qu'il existe une grande variété de groupes fonctionnels qui peuvent être utilisés pour fonctionnaliser le PEG et de faciliter la formation de l'hydrogel, les méthacrylates et les norbornènes sont quelques-uns des fragments les plus courantes de polymérisation en chaîne et de l'étape de croissance, respectivement. Ces deux fonctionnalités offrent un excellent contrôle spatio-temporel sur la polymérisation du réseau, et lorsqu'il est utilisé pour encapsuler des cellules, ces réseaux soutiennent la survie cellulaire global élevé 5-7. Diméthacrylate de PEG fonctionnalisé (PEGDM) réticulation par polymérisation en chaîne et permet l'incorporation de biomolécules ou d'autres facteurs à travers la co-polymérisation avec de l'acrylate, de méthacrylate de biomolécules, ou similaire fonctionnalisés 5,6. Hydrogels PEGDM ont des avantages significatifs par rapport aux systèmes de polymérisation en chaîne croissance alternatifs tels que l'acrylate PEG fonctionnalisé (PEGDA). En utilisant des méthodes traditionnelles, PEGDA peut être synthétisé plus rapidement que PEGDM; hoWever, en utilisant la synthèse assistée par micro-ondes, synthèse PEGDM est encore plus efficace. PEGDA est souvent synthétisé en une nuit ou 8 ou 24 h 9 réactions, mais peut également être synthétisé en quatre heures à des températures élevées 10. PEGDM est également traditionnellement synthétisé en faisant réagir pendant une nuit ou pendant 24 11 h 5, avec certaines méthodes prolongeant la durée de réaction à 4 jours 12. En utilisant la méthode assistée par micro-ondes démontré ici, PEGDM peut être produite dans une réaction de 5 min. Bien que PEGDM a plus lentes cinétique de la réaction que PEGDA 13, la réaction de réticulation pour PEGDM est encore rapide, se produisant en quelques minutes, et permet d'obtenir une conversion de macromère supérieure PEGDA que l'hydrophobicité accrue du groupe méthacrylate augmente l'agrégation groupe fonctionnel en solution, ce qui augmente la probabilité d' transfert radical et conversion méthacrylate 14. PEGDM hydrogels sont également associées à une augmentation viabilité cellulaire et de la croissance en tant quepar rapport à des hydrogels PEGDA, probablement en raison de la baisse des taux de réaction à un moment donné, ce qui réduit la concentration en radicaux et macromères n'ayant pas réagi présents 14. les polymérisations en thiol-ène, tels que ceux utilisant norbornène fonctionnalisé PEG (PEGn) forment des hydrogels par polymérisation étape de croissance, et de nécessiter l'utilisation d'un agent de réticulation PEGn et qui contiennent en moyenne plus de deux groupes fonctionnels. Etant donné que les radicaux réagissent avec thiyles norbornène doubles liaisons carbone-carbone, contenant un thiol multi-agents de réticulation sont couramment utilisés pour la réticulation des hydrogels PEGn, permettant une incorporation facile des peptides avec les acides aminés cystéine fonctionnalités 7. Bien qu'il existe de nombreux autres chimies qui réagissent par polymérisation étape de croissance (réactions d'addition de Michael tels que thiol-acrylate 15 et sulfone thiol-vinyle 16 ", cliquez sur" des réactions telles que alcyne-azide 17 etc), les hydrogels de thiol-norbornène sont très fréquent, comme la souche dele cycle norbornène augmente de manière significative la vitesse de réaction et diminue les risques de polymérisation du norbornène à double chaîne subissant de liaison 7.

La décision entre méthacrylate, norbornène, ou autre fonctionnalisation pour faciliter la formation hydrogel est en grande partie basée sur l'approche. Par exemple, les réseaux polymérisé PEGDM chaîne de croissance ont été démontrés aussi bien adaptée pour contrôler la localisation cellulaire dans le développement d'une ingénierie tissulaire 18,19 périoste. Les réseaux de PEG étape de croissance pour polymériser sont mieux adaptés à l'incorporation de séquences de peptides pour faciliter la dégradation des hydrogel enzymatique sensible, en raison de la facilité d'incorporation de séquences de substrat de l'enzyme à l'aide de thiol (cysteine) contenant des peptides et norbornène macromères fonctionnalisés 20. Si la question de recherche sera mieux traitée par l'utilisation d'hydrogels étape de croissance, Fairbanks et al. Fournit une description détaillée de la norborstratégie de fonctionnalisation nene pour PEG 7. Ce détail la façon dont le papier volonté PEG et les séquences peptidiques peuvent être fonctionnalisés (avec un méthacrylate de PEG, et un méthacrylamide de peptides) pour des réactions de polymérisation en chaîne.

Traditionnellement, PEGDM est produit en faisant réagir le PEG avec du chlorure de méthacryloyle et de la triéthylamine dans le dichlorométhane. On laisse la réaction de progresser à une nuit à température ambiante 11 ou à 24 h 5, avec des méthodes qui s'étendent temps de réaction de 4 jours 12 avant la filtration, la précipitation dans l'éther éthylique, et la collecte. Bien qu'il existe de nombreuses variantes de cette approche, tous sont de temps, ont besoin d'un large éventail d'équipements de synthèse chimique, et ne sont pas respectueux de l'environnement, car elles impliquent l'utilisation de quantités relativement importantes de réactifs de haute pureté et de solvant. Pour contourner ces limitations, Lin-Gibson et al. Mis au point une méthode sans solvant assistée par micro-ondes pour fonctionnaliser PEG te groupes méthacrylate rminal (figure 3A) 12. Dans cette réaction, les groupes alcool terminaux du PEG réagissent avec l'un des atomes de carbonyle de l'anhydride méthacrylique pour former un groupe carboxyle. Ceci génère le produit PEGDM, avec de l'acide méthacrylique en tant que produit secondaire. Cette synthèse présente de nombreux avantages caractéristiques de la synthèse par micro-ondes, y compris une réduction du temps de réaction et des procédés de synthèse sans solvant 21. La synthèse par micro-ondes est préférable aux procédés précédemment discutés comme il est nettement plus rapide, nécessite moins étendue équipement de synthèse (par exemple, de la verrerie, des plaques de réaction), et utilise moins réactif global et des quantités de solvants comme les solvants ne sont nécessaires que pour la purification du produit / recueil et non pour synthèse, ce qui rend plus économique et plus respectueux de l'environnement.

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Figure 3:. Schémas de fonctionnalisation A) en poly (éthylène glycol) est mis à réagir avec 10 fois un excès molaire de l'anhydride méthacrylique à produire un poly (éthylène glycol) le méthacrylate de B) Le même procédé peut être utilisé pour fonctionnaliser l'extrémité N-terminale de séquences peptidiques, la formation d'un. méthacrylamide peptide fonctionnalisé. En effectuant cette procédure avant le clivage du peptide de la résine, la fonctionnalisation sélective de l'extrémité N-terminale peut être effectuée en tant que groupes latéraux d'acides aminés restent protégés. n: nombre de PEG se répète dans le macromère (n = 45,5, 227 et 455, respectivement, pour les deux, 10 et 20 kDa PEG linéaire utilisé). R1 à RN: les chaînes latérales acides de l'acide. PG1 au PGN: protecteurs de chaîne latérale des groupes. TFA: acide trifluoroacétique. CONSEILS: triisopropylsilane. Dodt: 3,6-dioxa-1 ,8-octaneditHiol. H 2 O: l'eau.

La méthode de la méthacrylation par micro-ondes a été récemment adapté par notre groupe de fonctionnaliser l'extrémité N-terminale de peptides avec des groupes de méthacrylamide (figure 3b) pour faciliter l'incorporation peptide dans une variété de polymères et les réseaux polymères. Dans cette réaction, l'amine primaire de l'extrémité N-terminale du peptide réagit avec l'atome de carbonyle de l'anhydride méthacrylique pour former un amide. Ceci génère le méthacrylamide peptide fonctionnalisé, avec l'acide méthacrylique produit en tant que produit secondaire. Lors de l'utilisation de cette procédure pour fonctionnaliser l'extrémité N-terminale de séquences peptidiques, il est important que les acides aminés contenant des chaînes latérales réactives (amines primaires (lysine), les alcools (sérine, thréonine), et les phénols (tyrosine)) sont protégés au cours de la fonctionnalisation, et groupes protecteurs ne sont clivés après incorporation méthacrylamide.

Cet article va montrer à la fois de ces microwméthodes ave assisté à synthétiser PEGDM et fonctionnaliser sur résine séquences peptidiques, en soulignant les pièges courants et suggère des méthodes de dépannage. Dans cet article, les méthodes pour effectuer des techniques de chimie analytique couramment employées pour évaluer les produits fonctionnalisation seront détaillés et des suggestions et des ressources pour effectuer des modifications plus avancées seront donnés. Les résultats typiques seront démontrés, qui comprennent l'aide de la PEGDM synthétisé pour former des réseaux d'hydrogel, en exploitant les hydrogels formés à contrôler la libération d'un médicament modèle, et en utilisant des peptides fonctionnalisés pour faciliter les interactions cellulaires-hydrogel. Une attention particulière sera accordée à la caractérisation hydrogel maillage et discuter de la façon composition hydrogel peut être réglé pour affecter cette propriété physique sous-jacente, qui à son tour contrôle des propriétés des matériaux en vrac tels que la rigidité et le profil de libération de médicament.

Protocol

Une. Synthèse assistée par micro-ondes de PEGDM

  1. Pour éviter la contamination avec de l'eau, de pré-sécher toute la verrerie utilisée dans un four (> 60 ° C) pendant 1 heure.
    Remarque: la verrerie requis comprend: deux béchers de 100 ml, un bécher de 250 ml, 3 spatules, un flacon de 250 ml de Büchner, un entonnoir de Büchner 7 cm, un verre de montre de 10 cm.
  2. Pré-froid 100-150 éther éthylique anhydre ml (74,12 g / mol) pour la précipitation ensuite effectué à l'étape 1.6 en le versant dans un bol, couvrir le bécher avec un verre de montre, et plaçant le bécher dans un plat de recristallisation rempli de glace. Déplacez micro-ondes et de tourbillons dans une hotte chimique.
    Remarque: l'éther de diéthyle peut également être préalablement refroidie en plaçant le bécher dans un congélateur chimique. La température de l'éther diéthylique inférieure obtenue par refroidissement dans un congélateur augmentera la vitesse et l'efficacité de la précipitation.
  3. Dans un petit bateau peser, peser 5 g de poly (éthylène glycol) (PEG) de la molépoids de lar de votre choix (1,000-100,000 Da).
    1. Le cas échéant, retirer la pièce en plastique du couvercle du flacon à scintillation. Tarer le flacon, et distribuer 10 un excès molaire de l'anhydride méthacrylique dans le flacon (MA, 154,16 g / mol) par l'équation 1 dans le capot. Ajouter du PEG dans le flacon de scintillation.
      Equation 1 (1)
      où Équation 1.1 est la masse de PEG en g, Équation 1.2 est le poids moléculaire du PEG en g / mol, Équation 1.3 est le nombre de groupes OH terminaux sur le PEG, et Équation 1.4 est la molépoids de lar de maîtrise en g / mol.
  4. Librement tordre le bouchon sur le flacon à scintillation. Réglez le four micro-ondes à 5 min à puissance maximale. Le port de gants résistants à la chaleur, retirer la cuvette de la micro-ondes toutes les 30 secondes.
    1. Serrer à fond le bouchon et vortex pendant 30 secondes. Répétez jusqu'à ce que la solution a été micro-ondes pour le plein 5 min. Le bouchon peut avoir besoin d'être remplacée au cours de la procédure en raison de la fissuration.
  5. Avec le bouchon desserré, laissez le PEGDM refroidir à température ambiante. Dissoudre le PEGDM dans une petite quantité (10 à 15 ml) de dichlorométhane (DCM, 84,93 g / mol).
    Note: Il est recommandé que le PEGDM laisser refroidir de façon significative (~ 5 min) avant l'addition DCM, pour éviter l'ébullition du DCM (un cancérogène suspecté) en raison de la chaleur résiduelle. Le PEGDM peut être divisé en petits morceaux à l'aide d'une spatule et vortex pour favoriser la dissolution.
  6. Précipiter le PEGDM en 10x excès d'éther diéthylique glacée pendant 20 min.
    Remarque: Il peut être nécessaire de scl'écartement des cylindres du côté du bêcher avec une spatule pour initier la formation de cristaux de précipiter les PEG de poids moléculaire inférieur (2500 Da), mais le PEG avec un poids moléculaire inférieur à 1000 Da ne précipite pas malgré la rayure.
  7. Büchner et ballon, gagner la PEGDM par filtration sous vide. Ne pas filtrer jusqu'à dessiccation complète, car cela favoriser l'adsorption de l'eau à la PEGDM.
    Remarque: si nécessaire pour le système à vide spécifique en cours d'utilisation, un piège à vide peut être placé entre l'installation de filtration et la source de vide afin de protéger la pompe à vide contre les dommages par les vapeurs de solvant.
  8. Transférer le PEGDM filtré dans un tube conique de 50 ml avec une aiguille de gros calibre percée à travers le capuchon de ventilation. Stocker pendant une nuit dans une chambre à vide pour sécher.
  9. Redissoudre PEGDM dans DCM et reprécipiter (comme dans les étapes 1.5 à 1.7) comme une étape finale pour éliminer MA n'ayant pas réagi. Sécher à nouveau comme dans l'étape 1.8.

2. Caractérisation des PEGDM fonctionnalisation

  1. En utilisant du chloroforme deutéré (120,38 g / mol) en tant que solvant, pour préparer des échantillons 1 H-RMN. Placer un petit échantillon de la PEGDM (≈ 10 mg) dans un flacon à scintillation avec une petite quantité de solvant (≈ 1,0 ml). La concentration de la cible est de 10 mg / ml.
    1. Une fois que l'échantillon est dissous, le transférer dans un tube de RMN propre. L'échantillon doit remplir les bas de 4-5 cm du tube de RMN.
  2. Recueillir des spectres de RMN du proton. Nos données sont recueillies à l'aide d'un spectromètre de 400 MHz. Exécutez les échantillons à température ambiante pendant au moins 64 analyses pour obtenir une résolution de données suffisantes.
  3. Si l'analyse par RMN (figure 4) indique PEGDM fonctionnalisation est inférieur à 90%, la procédure de méthacrylation doit être répété. Ajuster la masse de MA utilisé pour tenir compte de la quantité réduite de non fonctionnalisé PEG.

Note: pour cent de PEG fonctionnalisé en PEGDM peut être calculée à partir de la observé: rapport théorique de méthacrylate borneylate protons (a, b et c) pour les protons centraux de PEG (d) (Figure 4). Pour le PEG linéaire, le nombre théorique de protons centraux de PEG est calculée par l'équation 2:

Equation 2 (2)
où Équation 2.1 est le poids moléculaire du PEG en g / mol et Équation 2.2 est le poids moléculaire du PEG d'une répétition unique (44 g / mol). Pour non linéaire PEG, cette équation doit être modifié pour refléter la structure de branchement spécifique (figure 1). La fonctionnalisation pour cent peut alors être calculée en utilisant l'équation 3:
Equation 3 (3)
où L'équation 3.1 est l'aire sous les pics observés méthacrylate de protons (a, δ = 1,94 ppm, b et c, δ = 5,57 et 6,12 ppm), et Équation 3.3 est le nombre théorique de méthacrylate protons (a = 3 * Équation 1.3 , B = 1 * Équation 1.3 et c = 1 * Équation 1.3 - 6, 2 et 2, respectivement, pour le PEG linéaire). Le calcul de fonctionnalisation pour cent devrait être effectuée en utilisant des pics a, b et c séparément, puis averaged obtenir un pour cent fonctionnalisation globale.

Remarque: PEGDM suffisamment fonctionnalisé peut ensuite être dialysée (dans l'eau, à l'eau) et recueilli par lyophilisation pour éliminer l'anhydride méthacrylique résiduel et l'acide méthacrylique. Le produit final doit être mélangée avec une petite quantité (0,01% en poids) d'un inhibiteur tel que l'acide citrique ou de la vitamine C et stocké avec dessiccateur à -20 ° C jusqu'à utilisation. Le produit de PEGDM finale peut être utilisée pour produire des hydrogels, tel que décrit dans l'article JoVE par Khetan Burdick et 22.

3. La fonctionnalisation assistée par micro-ondes de peptides sur résine

Remarque: Les peptides sont synthétisés en utilisant une résine Fmoc-Gly-Wang, en utilisant un synthétiseur automatique de peptides avec surveillance du rayonnement UV, et des solutions à 0,2 M d'acide aminé en N-méthyl-pyrrolidone (NMP, 99,1 g / mol). 5% de pipérazine (86,1 g / mol) dans du diméthylformamide (DMF, 73,1 g / mol) est utilisé pour la déprotection, 0,5 M de O-benzotriazole-N, N, N ', N'-tétraméthyl-uronium-hexafluoro-phosphate (HBTU, 379,3 g / mol) dans du DMF est utilisé comme activateur, et 2 M de la diisopropyléthylamine (DIEA, 129,3 g / mol) dans de la NMP est utilisée comme la base de l'activateur. Les peptides peuvent également être obtenus auprès d'un fournisseur commercial de peptide. Lors de l'utilisation de sources commerciales, il est essentiel que les peptides sont obtenus sur résine avec la chaîne latérale d'acide aminé des groupes protecteurs intacts plutôt que complètement clivé, comme cela est standard.

Remarque: il est important que les acides aminés avec des chaînes latérales réactives sont protégées de sorte que le méthacrylamide fonctionnalisation se produit uniquement à l'amine primaire de l'extrémité N-terminale de la séquence. Voir le tableau 1 pour les acides aminés avec des groupes latéraux réactifs, et groupes protecteurs typiques. Les acides aminés avec des groupes de protection sont incorporés dans la séquence au cours de la synthèse des peptides de la même manière que les acides aminés non protégés, et sont souvent disponibles auprès des mêmes fournisseurs d'acides aminés.

Acide aminé Groupe réactif Groupe protecteur
Lysine Amine primaire tert-butyloxycarbonyle (Boc)
Serine L'alcool primaire tert-butyle (tBu)
Thréonine L'alcool secondaire tBu
Tyrosine Phénol tBu

Tableau 1: acides aminés réactives et des groupes protecteurs typiques.

  1. Synthétiser des peptides en utilisant la synthèse classique de peptides en phase solide, et de les stocker sur une résine à 4 ° C dans du DMF, avant d'être prêt à l'emploi.
  2. En utilisant un entonnoir Büchner 7 cm avec du papier filtre et ballon de 250 ml, de recueillir la résine de peptide de la DMF par filtration.
  3. S'il est présent retirer la pièce en plastique du couvercle de la fiole à scintillation. Transférer la résine dans le flacon de scintillation. En utilisant une pipette jetable, ajouter juste assez pour couvrir MA la résine dans le flacon de scintillation.
  4. Librement placer le bouchon sur le flacon à scintillation. Réglez le four micro-ondes à 3 min à puissance maximale. Le port de gants résistants à la chaleur, retirer la cuvette de la micro-ondes toutes les 15-20 secondes.
    1. Serrer à fond le bouchon et vortex pendant 15 secondes. Répétez jusqu'à ce que la solution a été micro-ondes pour le full 3 min.
  5. Avec le bouchon desserré, laisser la solution de peptide refroidir à température ambiante. En utilisant une petite quantité de DMF et d'un entonnoir Büchner avec un papier filtre et d'un flacon, de recueillir la résine de peptide à partir de la fiole.
  6. Transférer la résine de peptide à un flacon à scintillation de frais et de cliver et déprotéger le peptide.
    1. Par 0,25 mmol de résine, on utilise une réaction dès la température ambiante 2 heures avec rotation, en utilisant un cocktail de clivage de 18,5 ml d'acide trifluoroacétique (TFA, 114,02 g / mol) avec 0,5 ml chacun de triisopropylsilane (TIPS, 158,36 g / mol), 3,6-dioxa-1 ,8-octanedithiol (Dodt, 182,30 g / mol) et de l'eau désionisée (18,02 g / mol).
      Remarque: Ce cocktail est suffisant pour la plupart des peptides, mais ne sera pas déprotéger 2,2,4,6,7-pentaméthyl-dihydrobenzofuran-5-sulfonyle acides aminés (Pbf)-protégées (couramment utilisés pour protéger les chaînes latérales d'arginine). Si la séquence contient des groupes Pbf protégés, 0,5 ml de la TFA doivent être remplacées par 0,5 ml de thioanisole (124.20 g / mol) et le clivage du temps passé à 4 heures.
      Remarque: Si un ciel nuageux, les formes de la substance cristalline dans le cocktail de clivage, le peptide est susceptible de s'écraser dans la solution et le volume du cocktail de clivage devrait être doublé.
  7. Réfrigérer 400 ml d'éther éthylique anhydre sur la glace dans un bécher recouvert de verre de la montre.
  8. Précipiter le peptide en 10x excès d'éther diéthylique, et diviser la solution équitablement entre quatre tubes de 50 ml coniques. Centrifugeuse à 3200 g pendant 10 min pour recueillir le peptide.
    1. Décanter l'éther, et remettre en suspension le peptide dans 100 ml d'éther diéthylique frais divisé entre deux tubes coniques de 50 m. Répétez le processus de centrifugation, remise en suspension dans 50 ml d'éther frais deux fois pour un total de 4 lavages éther.
      Remarque: Cette opération supprime les produits chimiques utilisés dans le cocktail de clivage de groupes protecteurs et clivage du peptide solide.
  9. Après la dernière étape de centrifugation, la décantation des déchets etelle et sécher le peptide nuit sous vide.

4. Caractérisation du peptide Fonctionnalisation

  1. Utilisation 50:50 H 2 O: acétonitrile (41,05 g / mole) + 0,1% de TFA en tant que solvant pour l'analyse MALDI-TOF des échantillons peptidiques. Placer un petit échantillon (1 - 2 mg) du peptide dans un tube Eppendorf de 1,5 ml et dissoudre l'échantillon dans 1 ml de solvant MALDI.
  2. Préparer la solution de matrice. Une matrice acide couramment utilisé est α-cyano-4-hydroxycinnamique (ACSSD, 189,2 g / mol) comme matrice. Dissolvez 10 mg / ml matrice dans un solvant MALDI, formant une solution de matrice d'actions.
    Remarque: La solution stock de la matrice peut être conservé à température ambiante pendant jusqu'à une semaine pour des analyses supplémentaires.
  3. Combiner le peptide et la solution de matrice dans un rapport de 1:1. Découvrir cette solution combinée sur trois endroits différents sur la plaque d'échantillons MALDI, en ajoutant 1 pl / place.
    1. Sécher les taches, soit par séchage à l'air ou à l'aide d'un pistolet thermique. Respot et sec chaqueéchantillon.
      Remarque: Respotting produit un échantillon peptide / matrice plus uniforme et aide à obtenir un signal clair. Un mélange de peptides standard doit aussi être combiné avec la solution de matrice dans un rapport de 1:1 et repéré (une seule fois) sur la plaque MALDI.
  4. Recueillir les données MALDI-TOF. En raison de l'addition du groupe de méthacrylamide à l'extrémité N-terminale du peptide, il devrait y avoir une augmentation de 68 g / mol à poids moléculaire supérieur à celui de la masse moléculaire du peptide seul.
    Remarque: Contrairement à la synthèse de PEGDM, les peptides ne peuvent pas être refunctionalized, comme lors du clivage des groupes protecteurs sur les acides aminés ayant des chaînes latérales réactives sont enlevés, et la fonctionnalisation sélective de la N-terminales ne peuvent plus être assurés.
    1. Si l'analyse MALDI (Figure 5) indique que le peptide a été correctement fonctionnalisé et tous les groupes protecteurs clivé de manière appropriée, le peptide peut être dialysée (dans de l'eau, contre de l'eau) et recueilli par lyophilisation pour enlee contaminants résiduels (cocktail de clivage, l'éther, clivés groupes protecteurs, etc.) Le peptide solide doit être transféré dans un petit tube Eppendorf et conservé à -20 ° C jusqu'à utilisation.

Representative Results

Résonance magnétique nucléaire du proton est l'une des techniques analytiques les plus courantes afin d'évaluer l'efficacité d'une réaction chimique, comme l'aire sous chaque pic du spectre est proportionnelle aux niveaux relatifs de ce protons dans l'échantillon, permettant de déterminer les ratios de produit et de réactif dans l'échantillon. Pour cette réaction, une analyse 'H-RMN (figure 4) peut être utilisée pour calculer la fonctionnalisation% par rapport à la observé: rapport théorique de protons de méthacrylate de bornes (a, b et c) pour les protons centraux de PEG (d). Le PEGDM représenté sur la figure 4 était de 2.000 Da avant fonctionnalisation, donc n = 2000 Da / (44 répétition Da / PEG) = 45,5, alors d = 4 * (n-1) = 178, ce qui rend le proton: RMN rapport d'unité 178 / 102,16 = 1,74. Dans ce cas, un pic ne peut être utilisé dans l'évaluation% fonctionnalisation, comme la présence d'eau dans l'échantillon augmente artificiellement la zone sous le pic. Utilisation pic b, la fonctionnalisation% est de 1,00 * 1,74 / 2 * 100% = 87,1%; using pic c, la fonctionnalisation est de 1,08% * 1,74 / 2 * 100% = 94,1%. Par conséquent, la fonctionnalisation% global est de 91% et ce PEGDM est correctement fonctionnalisé pour une utilisation dans la synthèse de l'hydrogel. En règle générale, environ 90% fonctionnalisation est obtenue après un seul tour de méthacrylation.

En raison de la multitude de pics de protons qui se posent dans une analyse 'H-RMN des peptides, le peptide fonctionnalisation est plus facilement étudiée en utilisant MALDI-TOF. Cela est illustré dans la Figure 5, où la GKRGDSG de peptide a été synthétisé et soumis à une fonctionnalisation méthacrylamide. Une petite fraction du peptide a été clivé de prefunctionalization évaluation du poids moléculaire (figure 5A), ce qui montre le pic observé des poids moléculaires se produisant à 676 g / mol, la masse moléculaire attendue du peptide, ce qui indique la synthèse correcte de la séquence peptidique. Le reste du peptide a subi méthacrylamide fonctionneltion avant clivage. Comme ce peptide contient Pbf protégé R acides aminés, le clivage a été effectué dans un cocktail contenant thioanisole pendant 4 heures. Après fonctionnalisation méthacrylamide, le pic observé à poids moléculaire se produit à 744 g / mol (figure 5B), la masse attendue de la méthacrylamide peptide fonctionnalisé (68 676 g / mol) et non à la masse moléculaire attendue du peptide non fonctionnalisé, ce qui indique correct fonctionnalisation.

Pour démontrer la fonctionnalité à la fois du PEG et le méthacrylamide peptide fonctionnalisé, PEGDM hydrogels ont été produits avec et sans 0,5 mM méthacrylamide fonctionnalisé GKRGDSG (Figure 6). Les hydrogels ont été produites avec 10% en poids linéaire de 10 kDa PEGDM dans du PBS, avec 0,05% en poids de lithium phényl-2 ,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) en tant que photoamorceur. La solution de précurseur d'hydrogel a été injectée entre deux lames de verre séparées par une lame de verre d'écartement et maintenues ensemble par des clips liant. solution de précurseur a été ensuite exposé à 365 nm de la lumière UV à 2 mW / cm 2 pendant 10 minutes pour induire la réticulation, après quoi les gels de 8 mm de diamètre ont été prélevés à l'aide d'un poinçon cylindrique. Les gels sont rincés dans du PBS et on laisse gonfler pendant 2 jours afin d'assurer des conditions d'équilibre de gonflement ont été réalisées 16,20. MSC humaines de passage (3) ont été cultivées jusqu'à 80% de confluence et ensemencées sur des hydrogels à 15 000 cellules / cm 2. Les cellules ont été autorisés à adhérer pendant 48 heures avant d'être transféré à un milieu frais contenant 0,5 ul / ml calcéine AM et 2 pl ml éthidium homodimère / (LIVE / kit viabilité DEAD de Invitrogen) et imagée en contraste de phase et fluorescence à un grossissement 10X en utilisant un Nikon Eclipse Ti 2000. MSC ont été incapables de respecter les hydrogels de PEG non fonctionnalisés (figure 6A), mais sur l'inclusion de l'adhésion cellulaire peptide RGD ils ont réussi à respecter et à se répandre sur la surface d'hydrogel (figure 6B). Les images LIVE / DEADprésenté ne représente pas la viabilité de la population MSC graines, comme les CSP sont des cellules d'adhésion dépendant qui se détachent de la surface du gel sur la mort et seront supprimés au cours du processus de transfert des médias, ce qui entraîne un gonflement artificiel de la viabilité des cellules ensemencées. Au contraire, les images fluorescentes sont destinés à délimiter entre les cellules adhérentes et de petites variations dans la topologie de l'hydrogel, qui peut être difficile sous contraste de phase seule. Fait intéressant, les cellules ensemencées sur nonspread les seuls gels PEG-tache positif à la fois pour la calcéine AM et l'éthidium homodimère, ce qui indique que les cellules meurent au moment de la formation d'image.

L'un des nombreux avantages des hydrogels de PEG est de leur nature hautement accordable. Modification de la composition spécifique de l'hydrogel PEG offre aux chercheurs un degré élevé de contrôle sur les propriétés telles que le module d'élasticité. Comme illustré sur la figure 7, à la fois le poids moléculaire du PEG (figure 7A) et le pourcentage en poids ( (Figure 8). Tous les hydrogels ont été produites avec 10% en poids PEGDM linéaire dans du PBS, 0,05% en poids avec LAP en tant que photoamorceur. 40 ul de solution de précurseur d'hydrogel est en seringues de 1 ml avec des pointes coupées, et exposés à 365 lumière nm UV à 2 mW / cm 2 pendant 10 minutes pour former des hydrogels, en produisant des géométries cylindriques d'environ 5 mm de diamètre et de 2 mm de hauteur . Les gels ont été autorisés à gonfler dans du PBS pendant 2 jours avant le test mécanique. Hydrogel module a été déterminée en utilisant un MTS QT / 5 avec une cellule de charge de 5 N en comprimant entre 5 et 10% de la hauteur initiale de l'hydrogel à une vitesse de 0,1 mm / sec. Après l'essai mécanique a été achevée, la taille de maille est déterminée en mesurant hydrogel mass avant (M s) et post-(M D) 24 heures de lyophilisation par l'équation de Flory-Rehner comme détaillé dans la section de discussion, avec les calculs effectués dans MATLAB. Comme supposé, ce qui augmente le poids moléculaire du PEG macromère a provoqué une augmentation de la taille des mailles hydrogel (Figure 8A) et une diminution de la rigidité de l'hydrogel (Figure 8B). Hydrogel taille des mailles et la rigidité de gel résultante peut également être contrôlée en modifiant le pourcentage en poids de PEG. Les hydrogels ont été réalisés en faisant varier% en poids de 10 kDa PEGDM linéaire, et la rigidité de l'hydrogel, et la taille de maille ont été déterminés comme décrit précédemment (figure 9). Comme on l'a illustré sur la figure 7B, en augmentant% en poids de PEG provoque une diminution significative de la taille des mailles (figure 9A) et l'augmentation de la rigidité d'hydrogel (Figure 9B).

Les hydrogels contenant encapsulé albumine de sérum bovin (BSA) ont été formés en utilisant différents au molecular PEG de poids (2, 10, et 20 kDa). Tous les hydrogels ont été produites avec 10% en poids PEGDM dans du PBS contenant 50 pg / ml de BSA, comme décrit pour la figure 6. Les gels ont été incubés dans 1 ml de PBS à 37 ° C, et transférés dans du PBS frais à chaque point de temps. BSA libérée a été quantifiée en utilisant le dosage de Bradford de Thermo Scientific. Hydrogel maillage a été déterminé comme décrit pour la figure 8. Comme illustré sur la figure 7A, BSA libération se produit plus rapidement à partir d'hydrogels formés en utilisant PEGDM de plus haut poids moléculaire, par suite de la plus grande taille de maille à l'intérieur de l'hydrogel (Figure 10).

Figure 4
Figure 4. Représentant 1 H-RMN de 2 kDa PEGDM linéaire fonctionnalisée selon la méthode assistée par micro-ondes. Pourcentage fonctionnalisation peut être calculated basé sur le fait observer:. rapport théorique des protons de méthacrylate terminaux (a, b et c) de centrales protons PEG (d) Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 5
Figure 5. Représentative MALDI-ToF de peptide GKRGDSG (A) avant et (B) après fonctionnalisation à l'aide de la méthode assistée par micro-ondes. Noter que le pic de poids moléculaire observé après fonctionnalisation a lieu à 744 g / mol, le poids attendu du méthacrylamide fonctionnalisé peptide (676 68 g / mol) et non au poids moléculaire attendu du peptide non fonctionnalisé (676 g / mol). Cliquez ici pour agrandir l'image .


Figure 6. Contraste de phase représentant (à gauche) et LIVE / DEAD (vert / rouge) images fluorescentes (à droite) de CSM cultivées sur seulement et B gels A) PEG) des gels de PEG contenant 0,5 mM Méthacrylamide GKRGDSG fonctionnalisé. MSC sont incapables de respecter et répartis sur les seuls gels PEGDA, mais lors de la constitution de l'adhésion cellulaire peptide RGD, sont en mesure de respecter et répandre sur la surface de l'hydrogel. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 7
Figure 7. A) poids moléculaire et B PEG) pourcentage en poids de PEG utilisé pour former des réseaux hydrogel affecte hydrogel maillage (_8 ;) et une raideur de la hydrogel et la vitesse de libération de médicaments encapsulés. A) L'augmentation de PEG de poids moléculaire (de gauche à droite) au pourcentage de poids constant augmente la taille hydrogel de maillage, ce qui diminue la rigidité d'hydrogel et d'augmenter le taux de libération du médicament. B) La diminution de la masse pourcentage de PEG (de gauche à droite) utilisé pour former des hydrogels augmente la taille hydrogel de maille, la baisse de la même rigidité d'hydrogel et d'augmenter le taux de libération du médicament (pas à l'échelle). Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 8
Figure 8. A) augmente et B de taille de maille) raideur d'hydrogel diminue avec l'augmentation du poids moléculaire du macromère PEG. N = 10, les barres d'erreur = SEM, *** p &# 60; 0,001 par une analyse de la variance avec le test post-hoc de HSD de Tukey. Toutes les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide Prism 5. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 9
Figure 9. A) Mesh diminue et B taille) hydrogel rigidité augmente avec l'augmentation de% en poids de PEG. N = 9-10, les barres d'erreur = SEM, ** p <0,01, *** p <0,001 par ANOVA avec HSD de Tukey post- test hoc. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 10
Figure 10. Sortie de encamodèle psulated médicament albumine de sérum bovin (BSA) à partir des hydrogels formés à l'aide de 2 kDa, 10 kDa, 20 kDa de poids moléculaire du PEG. BSA libération se produit plus rapidement à partir d'hydrogels formés à l'aide de poids moléculaire plus élevé PEGDM, en raison de la taille de maille plus grande à l'intérieur de l'hydrogel . n = 6, les barres d'erreur = SEM. Le BSA% libéré est significativement différent (p <0,0001) entre les trois groupes à chaque point de temps sauf t = 1 et 2,5 heures lorsque la libération des 2 et 10 gels kDa sont équivalentes, par deux voies répétition-mesures ANOVA avec Bonferroni post-hoc test. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Discussion

Les procédés précédemment illustrés sont précieux pour la synthèse de PEGDM et méthacrylamide fonctionnalisation des peptides ou d'autres composés contenant une amine. Ces matériaux peuvent ensuite être utilisés pour la médecine régénérative et des applications de délivrance de médicaments. En raison de la nature hydrophile du PEG, les hydrogels formés à partir de macromères PEG ont une forte teneur en eau proche de nombreux tissus de l'organisme 2. Cette qualité donne PEG très résistant à l'adsorption des protéines et donc inerte dans le corps 3. Cependant, la nature hygroscopique de PEG peut s'avérer gênant lors de fonctionnalisation. Si l'eau est présente dans l'échantillon de PEG pendant la procédure de méthacrylation, l'anhydride méthacrylique réagira préférentiellement avec de l'eau pour produire de l'acide méthacrylique, et la fonctionnalisation de PEG pauvre en résultera.

Par conséquent, l'une des étapes les plus importantes qui peuvent être prises pour assurer méthacrylation succès du PEG ou du peptide est de maintenir anhydredes conditions de réaction rous. L'étape de séchage recommandée toute la verrerie avant l'utilisation est destinée à prévenir la contamination de l'eau. La présence d'eau dans l'échantillon peut être vu dans l'analyse par RMN, comme un pic large à 1,7 ppm (figure 4). Si pauvre méthacrylation est observé même après séchage toute la verrerie, les produits chimiques peuvent être séchés sur du sulfate de sodium ou d'autres agents de séchage (un tamis moléculaire, etc) avant l'utilisation. La distillation peut également être utilisé pour éliminer l'eau et de purifier l'anhydride méthacrylique avant l'utilisation, et une distillation azéotropique peut être utilisé pour sécher le PEG 23. Dans les cas extrêmes, la synthèse peut être effectuée en boîte à gants afin d'assurer de façon adéquate en outre conditions anhydres. Une deuxième série de méthacrylation, suivant la même procédure, peut également être réalisée pour augmenter la fonctionnalisation. Car il ya toujours une chance que des tours supplémentaires de fonctionnalisation seront nécessaires, il convient de veiller à l'étape 1.7 et 1.9 pour recueillir rapidement PEGDM par filtration sous vide. La filtration sous vide plus longtemps que les augmentations absolument nécessaires exposition de PEG à l'air, ce qui augmente la possibilité d'adsorption de l'eau.

Même si le pour cent excès d'anhydride méthacrylique à groupes fonctionnels hydroxyle reste inchangé, l'augmentation de la fonctionnalisation PEG (par exemple bras #) sur le précurseur PEG est généralement associée à une diminution de fonctionnalisation pour cent obtenus (résultats non publiés, Benoit laboratoire). Pour remédier à cette préventivement réduction de l'efficacité de fonctionnalisation, ou si des difficultés particulières sont rencontrées réalisation fonctionnalisation suffisamment élevée, la durée de la réaction par micro-ondes peut être augmenté, à condition que l'intervalle de micro-ondes est maintenue à 30 sec. Alors que 10 l'excès molaire est habituellement suffisante, la quantité de l'anhydride méthacrylique utilisé dans la réaction peut également être augmentée pour augmenter la fonctionnalisation atteint 12 pour cent.

Il est important que l'étape de précipitation supplémentaire (1,9) est réalisé pour obtenir de bons signaux RMN. Il est tentant d'effectuer la seconde précipitation le même jour que la synthèse, le séchage de l'échantillon pendant une nuit avant de reprécipitation a été trouvée pour faciliter l'enlèvement de l'excès de l'anhydride méthacrylique et l'acide méthacrylique. La préparation des échantillons est également important pour la réalisation de spectres RMN propre, et donc les échantillons doivent être préparés en utilisant les conditions recommandées. Figure 4 montre une représentation des résultats H-RMN pour correctement fonctionnalisé PEGDM. En analysant le rapport de protons de méthacrylate terminaux à protons centraux PEG, le PEGDM était déterminé à être fonctionnalisé de manière adéquate. Préparation des échantillons MALDI est tout aussi important pour atteindre une lecture claire. MALDI est particulièrement sensible à la présence de sels et de fortes concentrations de l'échantillon. Si un MALDI clair lecture (une intensité supérieure à 50 unités arbitraires (ua) avec un signal haute: bruit) ne peut pas être obtenu, l'échantillon slution doit être dilué 1:100 dans un solvant MALDI avant d'être combiné avec la solution de matrice et réanalysé. figure 5 montre des résultats représentatifs MALDI-TOF après fonctionnalisation correcte de peptide, le clivage, et la préparation des échantillons. Le clivage d'un petit échantillon de résine avant fonctionnalisation (Figure 5A) montre la synthèse correcte du GKRGDSG peptidique, avec une fonctionnalisation de méthacrylamide correct du peptide représenté à la figure 5B.

Alors que la fonctionnalisation des peptides sur-résine est une procédure relativement solide, les conditions de clivage nécessaires pour chaque séquence nécessite souvent le réglage. Pendant de longues séquences où de nombreux acides aminés ont protégées chaînes latérales (> 30 acides aminés de long, ou> 15 acides aminés avec des groupes protecteurs), la durée de coupure doit être augmenté d'une heure. Cependant, si le temps de coupure est prolongé trop, la liaison peptidique peut entraîner le clivage en raison de l'exposition à long terme acide. MALDI ana lyse peut être très utile pour révéler les erreurs qui se sont produites dans la synthèse peptidique ou clivage. Une diminution observée en dessous de poids moléculaires attendus peut indiquer que l'acide (s) aminé n'a pas correctement couple, ou que le peptide fractionnement eu lieu (voir le tableau 2 pour les sources de changements fréquemment observés dans le poids moléculaire). Si le poids moléculaire observé est plus élevé que prévu par le poids d'un groupe protecteur utilisé, il est probable que le clivage et la déprotection était insuffisante et le peptide devrait être recleaved de temps supplémentaire.

x "> changement MW (g / mol) <td style = "width: 64px;"> 24 SRD: 64px; "> -113 03px; "> Pro 20 "style =" height: 20px; largeur: 103px; "> Tyr
Suppression d'acides aminés MW changement (g / mol) Protecting Groups clivées Ions généralement présents MW changement (g / mol)
Ala -71 Acétyle 42 Cl - 35
Arg -158 Allyle 40 K + 39
Asn -114 Alloc 85 Mg2 +
Aspic -115 Boc 100 Na + 23
Cys -103 Fmoc 223
Gin -128 OtBu 56
Glu -129 Pbf 252
Gly -57 tBu 56
Son -137 Trt 242
Ile -113
Leu
Lys -128
Met -131
Phe -147
-97
Ser -87
Thr -101
Trp -186
-147
Val -99

Tableau 2. Couramment observé des changements dans le poids moléculaire des peptides.

Macromères produites en utilisant des méthodes de méthacrylation assistée par micro-ondes peuvent être utilisés dans un certain nombre de médecine régénérative ou demandes de délivrance de médicaments. Les peptides fonctionnalisés et PEGDM synthétisés ici peuvent également être incorporées dans des polymères à l'aide de nitroxydes polymérisation (NMP), Atom Transfer Radical Polymerization (ATRP) ou réversible Addition-Fragmentation Transfer (RAFT) méthodes 24. Les réseaux d'hydrogel peuvent également être produits en présence de cellules, comme l'ont démontré précédemment dans l'article JoVE par Khetan Burdick et 22. Ceci nécessite souvent l'incorporation de peptides d'adhésion cellulaire telles que RGD ou molécules de la matrice extracellulaire, comme le PEG seul ne fournit pas d'interactions critiques pour la survie et la fonction de certains types de cellules 25 cellules matériau. Les peptides, par exemple, peuvent être synthétisés en utilisant la synthèse classique de peptides en phase solide et fonctionnalisés tels que décrits ici pour permettre l'incorporation dans des réseaux d'hydrogel. Comme on le voit sur ​​la figure 6, l'inclusion de l'adhésion cellulaire peptide méthacrylamide fonctionnalisé GK RGDS G dans des hydrogels (0,5 mM) favorise l'adhésion des cellules souches mésenchymateuses humaines (CSM) pour des surfaces d'hydrogel de PEG, ce qui augmente le nombre de joint et des cellules d'écartement (Figure 6B ), par rapport aux hydrogels de PEG sans le peptide d'adhésion cellulaire ( 26. À incorporer cet espaceur PEG et d'éviter des interactions non-spécifiques, les peptides peuvent être conjugués à des mono-fonctionnalisé par l'intermédiaire de PEG-N-hydroxysuccinimidyle esters activés, comme décrit par Hern Hubbell et 26.

Les applications de réseaux d'hydrogel nécessitent un contrôle serré sur les propriétés des matériaux. Un avantage important de hydrogels de PEG est un degré élevé de contrôle sur ces propriétés. Par exemple, le poids moléculaire, le nombre de bras, et le% en poids de PEG utilisé dans la formation de réseaux d'hydrogel peut être modifiée pour régler avec tunpropriétés électroniques pour des applications spécifiques. Ceci permet un contrôle étroit sur hydrogel maillage (de ξ), qui contrôle hydrogel rapport de gonflement (Q) et la rigidité (module d'élasticité, E). Ceci est illustré sur la figure 7A et quantifié sur la figure 8, où les résultats de poids moléculaires de PEG macromères augmentant par une augmentation de taille de l'hydrogel maille (Figure 8A) et une diminution de la rigidité de l'hydrogel (Figure 8B).

La caractéristique physique sous-jacente qui contrôle le comportement en vrac dans ces réseaux d'hydrogel, d'un maillage, est calculée en utilisant l'équation de Flory-Rehner 16. Pour effectuer ce calcul, le taux de gonflement volumétrique (Q) est d'abord calculé à partir de l'équation 4:
Equation 4 (4)

où ρ s représente la densité de l'eau (1 g / ml), ρ est la densité p de PEG (1,12 g / ml), M s est la masse gonflée de l'hydrogel et M D est la masse sèche de l'hydrogel (souvent mesurée après congélation et la lyophilisation des hydrogels). Le poids moléculaire entre les reticulations (M c, en g / mol) est alors calculée à partir de l'équation 5:
Equation 5 (5)

où M N est le nombre moyen MW de PEG (en g / mol), Équation 5.05 est le volume spécifique du polymère Équation 5.1 , V 1 est le volume molaire de l'eau (18 ml / mol), V 2 est la fraction volumique de polymère à l'équilibre de l'hydrogel
( Équation 5.2 ), Et X 1 16. Le nombre de liaisons entre réticule (n) est alors calculée à partir de l'équation 6:
Equation 6 (6)

où N b est le nombre de liaisons dans la séquence répétée de PEG (3) et M r est la MW de la répétition de PEG (44 g / mol) 27. Cela permet à la distance de la racine carrée moyenne de bout en bout de la chaîne de polymère Équation 6.1 (En nm) pour être calculé à partir de l'équation 7:
Equation 7 (7)

où l est la longueur moyenne de la liaison (0,146 nm, calculé sur la base de CC et des longueurs de liaison CO) et C n est le rapport caractéristique du polymère (4,0 pour PEG) 28. FiEnfin, la taille de maille de l'hydrogel peut être calculée à partir de l'équation 8:
Équation 8 (8)

Propriétés d'hydrogel peuvent être réglés de façon similaire par réglage de la quantité de PEG utilisé dans la formation d'hydrogels. La diminution du pourcentage en poids des résultats de macromères PEG à une augmentation de la taille hydrogel de maillage, ce qui réduit par la suite la rigidité d'hydrogel. Figure 7B illustre et la figure 9 quantifie le pourcentage en poids de PEG utilisé dans la formation de l'hydrogel peut être utilisé pour contrôler la taille de maille (Figure 9A) et la rigidité de l'hydrogel obtenu (Figure 9B). Comme a été démontré que la rigidité du substrat pour affecter des comportements cellulaires tels que la différenciation des cellules souches 29, la possibilité de contrôler étroitement la rigidité est une caractéristique importante dans la fabrication hydrogel.

Les hydrogels peuvent également être utilisés pour contrl'administration de médicaments ol. Comme illustré sur la figure 7A et le montre la figure 10, ce qui augmente le poids moléculaire du PEG augmente macromères taille de maille du réseau de l'hydrogel, ce qui augmente par la suite la libération du médicament modèle encapsulé, albumine de sérum bovin (BSA). Tandis que les échantillons d'hydrogel dans cette étude ont été détruites à t = 195 heures pour permettre la mesure des masses humides et sèches hydrogel pour la calcul de la taille de la maille, il est de notre expérience qui a continué BSA libération se ferait avaient les échantillons sont incubés pendant des périodes de temps plus longues. La version incomplète de BSA observé dans la figure 10 n'est pas surprenant, que d'autres groupes ont également signalé que la BSA est résistante à la diffusion dans les réseaux d'hydrogel de PEG 30. Une libération incomplète de la protéine encapsulée peut se produire en raison d'une liaison hydrogène entre les protéines et les macromères PEG, ou la liaison entre le groupe méthacrylate sur le PEG et des groupes amines primaires sur les résidus de lysine dans BSA 31 covalente (figure 2A), il est également possible qu'une fraction de la BSA encapsulé est contenu dans des régions de l'hydrogel qui en sont sensiblement plus petites mailles taille que la moyenne globale dans le gel, empêcher sa libération. Bien incomplète, la libération nonFickian (données non présentées) de encapsulé BSA a été observée dans ce cas, la libération contrôlée Fickian de nombreux autres médicaments de modèles, y compris l'insuline et de l'ovalbumine, a été démontrée en utilisant PEGDM similaire hydrogels 30. En outre, Watkins et Anseth ont utilisé la microscopie confocale à balayage laser pour démontrer que la libération de molécules fluorescentes de hydrogels similaires est modélisé de façon acceptable à la diffusion de Fick moithodes 32.

Alors que les hydrogels formés dans cette étude sont non dégradables, la dégradation du réseau est un autre paramètre qui peut être incorporé à l'intérieur et à l'écoute de ces réseaux. Prévoyant la dégradation d'hydrogel contrôlée peut conduire à des altérations dans le comportement des cellules 33, la promotion de la croissance tissulaire ou la croissance du tissu hôte, ou l'élimination de la nécessité d'une explantation 34. Les hydrogels de PEG dégradables sont généralement synthétisés par ouverture de cycle de la dégradation hydrolytique d, l-lactide, de glycolide, ou des groupes ε-caprolactone sur des groupes hydroxyle au sein de PEG avant méthacrylation 35. Ces trois groupes se dégradent par hydrolyse des fonctions esters, avec les esters de glycolide ayant la plus grande sensibilité à la dégradation, suivie de lactide, de caprolactone et de l'ester, du fait de leur hydrophobicité variable. Après la constitution des groupes dégradables par hydrolyse, PEG peut encore être fonctionnalisé en utilisant la procédure méthacrylation detailed dans cet article, ce qui permet la formation de réseaux d'hydrogel par l'intermédiaire ultérieure de polymérisation en chaîne amorcée par des radicaux 36,37. La vitesse de dégradation des réseaux d'hydrogel peut être contrôlée en faisant varier l'identité du groupe dégradable par hydrolyse (glycolide, lactide, etc) et en faisant varier le nombre de répétitions dégradables incorporés dans la structure 35,38.

Théoriquement, les méthodes démontrées ici pourraient être utilisées pour acrylation de PEG et de peptides en remplaçant l'anhydride méthacrylique avec de l'anhydride acrylique dans les étapes 1.3 et 3.3, respectivement. Cependant, l'anhydride acrylique est plus de 20 fois le coût de l'anhydride méthacrylique 39,40, ce qui acrylation par micro-ondes beaucoup moins attrayant que méthacrylation par micro-ondes.

Nous avons démontré un procédé simple, rapide pour fonctionnaliser PEG et des peptides, la façon d'évaluer l'efficacité de cette procédure, et compte tenu des ressources pour uchanter les matériaux synthétisés pour former des réseaux d'hydrogel. Ces outils de synthèse sont très polyvalents dans leurs applications, et devraient s'avérer un aliment de base dans un certain nombre de vecteurs et des matières médicament des laboratoires de recherche.

Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Acknowledgments

Ce travail a été financé en partie par une bourse Howard Hughes Med-en-Grad (AVH), par des fonds de démarrage fournis à la Dre Danielle Benoit de l'Université de Rochester et la Fondation de la recherche et de l'éducation orthopédique / Transplant Foundation appareil locomoteur (OREF / MTF). Les auteurs tiennent à remercier le Dr James L. McGrath pour l'utilisation de son matériel.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,6-Dioxa-1,8-octanedithiol Tokyo Chemical Industry Co, LTD D2649 CAS 14970-87-7
Acetonitrile J.T. Baker UN1648 CAS 75-05-8
Amino Acids AAPPTech Glycine: AFG101 CAS 29022-11-5
Arginine: AFR105 CAS 154445-77-9
Asparagine: AFD105 CAS 71989-14-5
Serine: AFS105 CAS 71989-33-8
Anhydrous diethyl ether Fisher Scientific UN1155 CAS 60-29-7
Citric acid Sigma Aldrich C1857 CAS 77-92-9
Deuterated chloroform Cambridge Isotope Laboratories Inc. DLM-7-100 CAS 865-49-6
Dichloromethane Fisher Scientific UN1593 CAS 75-09-2
Diisopropylethylamine Alfa Aesar A1181 CAS 7087-68-5
Dimethylformamide Fisher Scientific D119-4 CAS 68-12-2
Fmoc-Gly-Wang resin Peptides International RGF-1301-PI 100-200 mesh size
Methacrylic anhydride Alfa Aesar L14357 CAS 760-93-0
N-Methylpyrrolidone VWR BDH1141-4LG CAS 872-80-4
On-resin peptides Synthesized in-house On-resin peptides can also be purchased from Peptides International, GenScript, AAPPTec, etc.
O-Benzotriazole-N,N,N’,N’-tetramethyl-uronium-hexafluoro-phosphate AnaSpec Inc 510/791-9560 CAS 94790-37-1
Peptide Calibration Standard Care 206195
Piperazine Alfa Aesar A15019 CAS 11-85-0
Poly(ethylene glycol) 2 kDa linear Alfa Aesar B22181 CAS 25322-68-3
Poly(ethylene glycol) 10 kDa linear Alfa Aesar B21955
Poly(ethylene glycol) 20 kDa linear Sigma Aldrich 81300 JenKem Technologies USA is an alternate supplier of linear and multi-arm PEG
Thioanisole Alfa Aesar L5464 CAS 100-68-5
Trifluoroacetic acid Alfa Aesar A12198 CAS 76-05-1
Triisopropylsilane Alfa Aesar L09585 CAS 6485-79-6
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Tokyo Chemical Industry Co, LTD C1768 CAS 28166-41-8

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Chemistry No. 80 poly (éthylène glycol) les peptides la polymérisation les polymères méthacrylation peptide fonctionnalisation, MALDI-TOF les hydrogels la synthèse macromère
La fonctionnalisation assistée par micro-ondes de poly (éthylène glycol) et peptides sur-résine pour l&#39;utilisation dans la polymérisation en chaîne et de la Formation hydrogel
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Van Hove, A. H., Wilson, B. D., Benoit, D. S. W. Microwave-assisted Functionalization of Poly(ethylene glycol) and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation. J. Vis. Exp. (80), e50890, doi:10.3791/50890 (2013).

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