Pseudomonas aeruginosa से MexAB तपका पम्प के इन विट्रो जांच में

Summary

हम Pseudomonas aeruginosa से तपका पंपों के इन विट्रो जांच के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. इस प्रोटोकॉल liposome झिल्ली के भीतर एक मजबूत प्रतिवर्ती, और tunable प्रोटॉन ढाल की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है और इसलिए protomotive बल से सक्रिय किसी भी झिल्ली प्रोटीन के लिए अनुकूल होना चाहिए.

Abstract

झिल्ली प्रोटीन परिवहन की निगरानी के लिए विश्वसनीय उपकरण के लिए एक उभरते वैज्ञानिक आवश्यकता है. हम परिवहन के लिए उनकी गतिविधि का सही जांच के लिए अनुमति देता है एक biomimetic वातावरण में ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया Pseudomonas aeruginosa से तपका पंप के पुनर्गठन के लिए अग्रणी एक पद्धति को प्रस्तुत करते हैं. तीन आवश्यक शर्तें पूरी होती हैं: एक lipidic पर्यावरण, परिवहन के लिए एक प्रासंगिक सूचकांक का उपयोग करते हैं, और एक प्रोटॉन ढाल की पीढ़ी में compartmentation. झिल्ली प्रोटीन ट्रांसपोर्टर एक साथ bacteriorhodopsin, मजबूत और साथ ही प्रतिवर्ती और tunable है कि एक प्रोटॉन ढाल उत्पन्न करता है कि एक प्रकाश सक्रिय प्रोटॉन पंप के साथ liposomes में पुनर्गठन किया गया है. प्रोटीन की गतिविधि pyranin, एक पीएच निर्भर फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग, liposome के भीतर होने वाली पीएच विविधताओं से deduced है. हम एक कदम दर कदम प्रक्रिया जहां झिल्ली प्रोटीन शुद्धीकरण, liposome गठन, प्रोटीन पुनर्गठन, और परिवहन एक वर्णनnalysis संबोधित कर रहे हैं. वे विशेष रूप से एक RND ट्रांसपोर्टर के लिए डिजाइन किया गया है, वर्णित विधियों संभवतः एक प्रोटॉन ढाल से सक्रिय किसी भी अन्य झिल्ली प्रोटीन ट्रांसपोर्टर के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

Introduction

अभिन्न झिल्ली प्रोटीन यूकेरियोटिक जीनोम में encoded जीनों के ऊपर से 30% का प्रतिनिधित्व करते हैं. वे इस तरह के फाटक रखते हुए (रिसेप्टर्स), पोषक तत्वों, आयनों या हानिकारक यौगिकों (ट्रांसपोर्टरों) के परिवहन या सभी जीवित कोशिकाओं ¹ के बीच झिल्ली bilayers (चैनल) के पार पारगम्यता बनाए रखने के रूप में निर्णायक भूमिका का हिस्सा है. तपका एंटीबायोटिक चिकित्सा ² के खिलाफ प्रतिरोध में एक केंद्रीय भूमिका है पंपों. ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया में एक बाहरी झिल्ली द्वारा संरक्षित है जो Pseudomonas aeruginosa, तपका ट्रांसपोर्टरों MexB, भीतर की झिल्ली में स्थित तपका पंप, Mexa, एक periplasmic प्रोटीन, और OprM के साथ संयोजन के रूप में काम करता है जहां त्रिपक्षीय प्रणाली, एक के रूप में आयोजित कर रहे हैं बाहरी झिल्ली चैनल. cytoplasmic भीतरी झिल्ली प्रोटीन व्यापक सब्सट्रेट विशिष्टता के साथ एक ऊर्जा पर निर्भर पंप के रूप में कार्य करता है. तीसरे एक periplasmic अंतरिक्ष में स्थित है और पूरे परिसर को स्थिर माना जाता है, जबकि बाहरी झिल्ली प्रोटीन एक porin के रूप में कार्य करता है

संरचनात्मक जानकारी कोलाई ^4-7 से मुताबिक़ प्रोटीन AcrB की एक्स - रे के लिए दृढ़ संकल्प के लिए पिछले 5 वर्षों के धन्यवाद पर जमा हो गया है. यह स्पष्ट रूप से इस ट्रांसपोर्टर के लिए एक कार्यात्मक परख डिजाइनिंग गतिशील और गतिज डेटा के साथ जोड़ी इस तरह की जानकारी, के लिए महत्वपूर्ण है एक असली चुनौती ⁸ है. दरअसल, झिल्ली प्रोटीन एक झिल्लीदार वातावरण में बनाए रखा जाना चाहिए और एक बंद डिब्बे को प्राप्त किया जा सब्सट्रेट के एक vectorial परिवहन के लिए बनाए रखा जाना चाहिए.

Proteoliposomes में झिल्ली प्रोटीन के पुनर्गठन के लिए बड़े पैमाने पर (Rigaud और लेवी ⁹ देखें) प्रस्तुत किया है और समीक्षा की गई है. ऐसे प्रोटोकॉल liposome झिल्ली भर substrates पालन करके उदाहरण के लिए झिल्ली प्रोटीन गतिविधि की निगरानी के लिए अनुमति देते हैं. इस मामले में सीमाओं एक से उठताtitratable substrates के vailability (फ्लोरोसेंट रेडियोधर्मी, आदि.) और बहुत बार इन substrates हाइड्रोफोबिक हैं और चाहे ट्रांसपोर्टर की उपस्थिति की झिल्ली को पार करने के लिए एक प्रवृत्ति है कि इस तथ्य से. एक विकल्प के रूप में, एक परिवहन का एक परिणाम के रूप में होते हैं कि रासायनिक परिवर्तन के प्रति संवेदनशील एक रिपोर्टिंग डाई के स्पेक्ट्रोस्कोपी विविधताओं का पालन कर सकते हैं. जैसा कि ऊपर कहा, प्रोटॉन MexB के माध्यम से परिवहन energize. इसलिए, एक प्रासंगिक विकल्प प्रोटॉन संचालित सब्सट्रेट परिवहन की वजह से पीएच विविधताओं का पालन करने के लिए एक पीएच के प्रति संवेदनशील रिपोर्टिंग डाई के स्पेक्ट्रोस्कोपी विविधताओं नजर रखने के लिए है. एक फ्लोरोसेंट डाई का चुनाव सब्सट्रेट के हाइड्रोफोबिक प्रकृति के कारण किसी भी artifactual प्रभाव से बचा जाता है.

एक अतिरिक्त कठिनाई एक प्रोटॉन ढाल की पीढ़ी है. कई प्रोटोकॉल साहित्य में पाया जा सकता है. उनमें से, valinomycin तकनीक का उपयोग बड़े पैमाने पर है, लेकिन हम इसे ^10-11 प्रदर्शन करने के लिए कठिन है कि पता चला है. इसके अलावा यह हैप्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य नहीं है और यह प्रतिवर्ती नहीं है. हम bacteriorhodopsin (बीआर), Halobacter salinarium से एक प्रकाश सक्रिय प्रोटॉन पंप, एक halophilic समुद्री ग्राम नकारात्मक लाचार एरोबिक archaeon का उपयोग करने के लिए सहारा है. इस प्रोटीन रोशनी पर, बीआर liposomes के अंदर प्रोटॉन पंप और इसलिए सब्सट्रेट ^12-13 परिवहन के लिए प्रोटीन द्वारा की जरूरत (अंदर अम्लीय) ΔpH बनाता है, MexB साथ liposomes में coreconstituted और है.

Protocol

1. प्रोटीन के उत्पादन और शोधन

1. Mexa, Pseudomonas aeruginosa से MexB
   1. एक ई. में Mexa और MexB जीन शरण plasmids रूपांतरण कोली उत्पादन तनाव (जैसे C43 DE3). लेग अगर पर प्लेट मध्यम उचित एंटीबायोटिक के साथ पूरक. एक हे / एन preculture टीका लगाना करने के लिए एक ही कॉलोनी उठाओ. अगली सुबह, लेग का 1 एल में preculture टीका लगाना और आंदोलन (240 आरपीएम) के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ता है.
   2. कोशिकाओं घातीय चरण तक पहुँच चुके हैं एक बार ₍₆₀₀ आयुध डिपो = 0.6-0.8) 1 मिमी IPTG साथ प्रेरित. आंदोलन के तहत 30 डिग्री सेल्सियस पर 2-3 घंटे के लिए प्रेरण प्रदर्शन करना.
   3. अपकेंद्रित्र कोशिकाओं (20 मिनट के लिए 9000 XG) और 30 एमएल Tris-एचसीएल 20 मिमी, पीएच 8, NaCl 150 मिमी में Resuspend.
   4. एक फ्रेंच प्रेस (10,000 साई, 4 पास) का उपयोग कोशिकाओं को बाधित. 20 मिनट के लिए 9000 XG पर centrifuging द्वारा अटूट कोशिकाओं और शामिल किए जाने के शव त्यागें.
   5. 100,000 XG और अनुसंधान पर गोली झिल्ली 1 घंटा30 मिलीलीटर बीआईएस Tris 10 मिमी 7.4 पीएच, ग्लिसरॉल 20% (w / v), imidazole 10 मिमी, NaCl 500 मिमी में प्रत्येक गोली esuspend.
   6. बीसीए वर्णमिति परख का उपयोग कुल झिल्ली प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण और डिटर्जेंट कि ताकि निर्धारित अंतिम मात्रा में 2% dodecyl maltoside (DDM) के साथ झिल्ली हे / एन solubilize: प्रोटीन (डब्ल्यू / डब्ल्यू) 1:1.5 है.
   7. गैर solubilized और एकत्रित सामग्री त्यागने के लिए 1 घंटे के लिए 100,000 XG पर ultracentrifuge.
   8. एक निकल राल (Mexa शुद्धि) या बीआईएस Tris 10 मिमी 7.4 पीएच, ग्लिसरॉल 5% के साथ equilibrated एक कोबाल्ट राल (MexB शोधन) के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए सतह पर तैरनेवाला सेते (w / v), imidazole 10 मिमी, NaCl 500 मिमी, DDM 0.2%.
   9. एक खाली कॉलम में राल डालो. प्रवाह के माध्यम से ले लीजिए.
   10. तो बीआईएस Tris 10 मिमी 7.4 पीएच, ग्लिसरॉल 20% (w / v), imidazole 10 मिमी, NaCl 500 मिमी, DDM 0.2%, बीआईएस Tris 10 मिमी पीएच 6, ग्लिसरॉल के 25 एमएल के साथ की 50 मिलीलीटर के साथ राल धो लें 5% (w / v), imidazole 10 मिमी, NaCl 500 मिमी, DDM 0.2%.
   11. पी Elute20 मिलीलीटर बीआईएस Tris 10 मिमी 7.4 पीएच, ग्लिसरॉल 5% (w / v), imidazole 300 मिमी, NaCl 500 मिमी, DDM 0.2% के साथ rotein.
   12. एक imidazole मुक्त बफर के साथ equilibrated एक desalting स्तंभ पर 3 मिलीग्राम और लोड करने के लिए नीचे एक ultrafiltration डिवाइस के साथ प्रोटीन ध्यान लगाओ. बस पुनर्गठन से पहले (नीचे देखें), solubilized प्रोटीन लिपिड और unsolubilized प्रोटीन से छुटकारा पाने के लिए (20 मिनट के लिए 100.000 XG) ultracentrifuge. फिर 0.3 मिलीलीटर के लिए फिर से प्रोटीन ध्यान.
2. Halobacter salinarium से Bacteriorhodopsin
   1. NaCl 4 एम, ₄ MgSO 150 मिमी, साइट्रेट 10 मिमी, KCl 30 मिमी, खमीर निकालने 5 ग्राम / एल, और peptone 5 ग्राम / एल से युक्त तरल मध्यम विकास में 10 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रोशनी के तहत Halobacter salinarium कोशिकाओं को विकसित
   2. विआयनीकृत जल के खिलाफ dialyzing द्वारा कोशिकाओं को बाधित.
   3. एक 30-40% पर बैंगनी झिल्ली (w / v) sucrose ढाल (17 घंटे के लिए 100.000 XG) शुद्ध.
   4. 2% octylgluc साथ झिल्ली निलंबन solubilize37 डिग्री सेल्सियस (: प्रोटीन अनुपात 2:1 (डब्ल्यू / डब्ल्यू) डिटर्जेंट पर झिल्ली resuspend के क्रम में solubilization के लिए मात्रा) पर 24 घंटे के लिए oside. Ε (570 एनएम) = 54,000 एम ^{-1 -1} सेमी का उपयोग solubilized बीआर की एकाग्रता का अनुमान है. बस पुनर्गठन से पहले (नीचे देखें), लिपिड और unsolubilized प्रोटीन से छुटकारा पाने के लिए solubilized बीआर (20 मिनट के लिए 100.000 XG) ultracentrifuge.
      नोट: देशी झिल्ली स्वाभाविक रूप से तो कोई आगे शुद्धि आवश्यक है बीआर में समृद्ध है.

2. Proteoliposomes की तैयारी

1. Liposome गठन: एक गिलास बीकर में क्लोरोफॉर्म (25 मिलीग्राम / एमएल) में भंग DOPC के 400 μl रखो और एक पाउडर के रूप में जमा कोलेस्ट्रॉल की 1.5 मिलीग्राम जोड़ें. एक गिलास बीकर में कम से कम 1 घंटे के लिए सिर्फ नाइट्रोजन या वैक्यूम की एक भाप के तहत हेरफेर से पहले उन्हें सूखी. DOPC: कोलेस्ट्रॉल दाढ़ अनुपात 3.3:1 है.
   1. वे सूख गए हैं, के बाद, HEPES 25 मिमी पीएच 7 की 1 मिलीलीटर के साथ लिपिड हाइड्रेटकश्मीर ₂ अतः ₄ 100 मिमी, ₂ MgCl 2 मिमी, pyranine 2 मिमी. निलंबन इस स्तर पर परेशान दिखाई देनी चाहिए.
   2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए समाधान हीट 30 सेकंड पल्स, आरटी पर 30 सेकंड के ठहराव के चक्र के साथ 40 डब्ल्यू पर 10 मिनट के लिए sonicate. निलंबन इस स्तर पर स्पष्ट दिखाई देनी चाहिए.
   3. Liposomes की एक monodisperse जनसंख्या को प्राप्त करने के लिए, बाहर निकालना के दो चक्रों प्रदर्शन और प्रत्येक चक्र के लिए, कम से कम 11x फिल्टर के माध्यम से liposome निलंबन गुजरती हैं. पहले चक्र के लिए, 200 एनएम के एक झिल्ली में छेद के आकार का उपयोग करें और दूसरे चक्र के लिए, 100 एनएम के एक झिल्ली में छेद के आकार का उपयोग करें. गतिशील प्रकाश बिखरने माप निलंबन की एकरूपता की जांच करने के लिए इस कदम पर प्रदर्शन किया जा सकता है.
2. प्रोटीन समावेश
   सिद्धांत: झिल्ली प्रोटीन डिटर्जेंट की solubilizing प्रभाव को liposomes धन्यवाद में पुनर्गठित किया जा सकता है. डिटर्जेंट solubilized liposomes पी के डिटर्जेंट solubilized झिल्ली प्रोटीन और गठन के साथ incubated हैंroteoliposomes polystyrene मोती ⁹ के साथ डिटर्जेंट का तेजी से समाप्त करने से शुरू हो रहा है.
   1. ट्राइटन X-100 (अंतिम 0.56%) के 28 मिलीग्राम जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस (solubilization तापमान प्रोटीन का अध्ययन किया जा रहा करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है) पर हे / एन सेते हैं.
   2. Solubilized liposomes के लिए डिटर्जेंट solubilized प्रोटीन (बीआर, MexB और Mexa) जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट सेते लिपिड / MexB = 20, MexB / Mexa = 2.5, और लिपिड / बीआर = 30: निम्न अनुपात (डब्ल्यू / डब्ल्यू) में solubilized liposome निलंबन करने के लिए प्रोटीन जोड़ें.
   3. (शुद्ध प्रोटीन के साथ जोड़ा डिटर्जेंट सहित डिटर्जेंट के कुल वजन पर विचार डब्ल्यू / डब्ल्यू), डिटर्जेंट अनुपात और कोमल के तहत आरटी पर (क्योंकि बीआर) के अंधेरे में 5 घंटा, सेते: एक 30:1 मोतियों में polystyrene मोती जोड़ें क्रियाशीलता. पहले इस प्रक्रिया को, मेथनॉल और इथेनॉल ऊष्मायन साथ biobeads सक्रिय करने और बड़े पैमाने पर पानी से धो लें.
   4. एक पीडी-10 का उपयोग proteoliposomes प्रोटीन और फ्री substrates शुद्धHEPES 25 मिमी पीएच 7, ₂ कश्मीर के साथ equilibrated desalting स्तंभ अतः ₄ 100 मिमी और ₂ MgCl 2 मिमी.
   5. अप करने के लिए 2-3 सप्ताह के लिए अंधेरे में 18 डिग्री सेल्सियस पर proteoliposomes स्टोर.
3. सुक्रोज ढाल पर पुनर्गठन प्रभावकारिता का आकलन.
   MexB और बीआर दोनों liposomes में पुनर्गठन किया गया है कि जांच करने के लिए एक टूटनेवाला sucrose ढाल पर proteoliposome निलंबन शुद्ध.
   1. धीरे सुक्रोज के एक पांच परत ढाल पर proteoliposomes व्यवस्थित (60%, 20%, 10%, 5%, और 2.5%, w / v).
   2. (न्यूनतम त्वरण और मंदी दरों के साथ) 100000 XG पर 17 घंटे के लिए ultracentrifuge.
   3. ध्यान से विभिन्न ढाल भिन्न (sucrose के प्रत्येक परत के बीच विशेष रूप से इंटरफेस) को इकट्ठा करने और Coomassie धुंधला या पश्चिमी सोख्ता का उपयोग एसडीएस पृष्ठ (10%) पर उनका विश्लेषण. Nonincorporated, डिटर्जेंट solubilized प्रोटीन के शीर्ष पर पाए जाते हैं, जबकि एकत्रित प्रोटीन, ट्यूब के नीचे पाया जाता हैट्यूब. Proteoliposomes और liposomes उनके आंतरिक घनत्व के अनुरूप है कि sucrose के इंटरफेस में पाए जाते हैं. खाली liposomes proteoliposomes से ढाल में आगे अप बरामद कर रहे हैं.

3. प्रतिदीप्ति मापन

1. दोहरे तरंगदैर्य माप के लिए अनुमति spectrofluorometer (Xe दीपक, 150 डब्ल्यू) का उपयोग कर 25.0 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिदीप्ति माप प्रदर्शन. वैकल्पिक रोशनी अवधि (550 एनएम / 550 एनएम उत्तेजना / उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ बीआर सक्रिय करने के लिए) और pyranine प्रतिदीप्ति मापने के लिए 2 सेकंड के लिए 455 एनएम / 509 एनएम उत्तेजना / उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ प्रतिदीप्ति माप. 5 एनएम उत्तेजना और उत्सर्जन बैंडविड्थ निर्धारित करें. एक रिवर्स झिल्ली संभावित ΔΨ के गठन को रोकने के लिए 50 एनएम valinomycin की उपस्थिति में माप प्रदर्शन.
   नोट: दरअसल, बीआर प्रोटॉन पंप, क्योंकि बाहर से liposome के अंदर अधिक सकारात्मक आरोप हैं. इस आरोपढाल एक ⁺ K चयनात्मक ionophore है, जो valinomycin का उपयोग कर खारिज किया जा सकता है. एक बार liposomes निलंबन valinomycin में जोड़ा, एक हाइड्रोफोबिक अणु के रूप में, liposome झिल्ली में डालने निष्क्रिय ⁺ K परिवहन, और इसलिए झिल्ली संभावित ΔΨ नष्ट करना होगा.

Representative Results

परख एक प्रोटॉन ढाल उत्पन्न होता है, जबकि समय के एक समारोह के रूप में pyranine प्रतिदीप्ति की निगरानी के होते हैं. उस प्रयोजन के लिए, नमूने (ट्रिगर है बीआर से इसलिए प्रोटॉन पंप) रोशनी करने के लिए वैकल्पिक रूप अधीन हैं और फिर उत्तेजना और उत्सर्जन pyranine की तरंग दैर्ध्य का उपयोग माप प्रतिदीप्ति (λ _{पूर्व} = 455 एनएम और λ _{उन्हें} 509 एनएम =).

चित्रा 1 बी आर द्वारा उत्पन्न प्रोटॉन ढाल प्रतिवर्ती है, पुष्टि है कि Mexa / MexB के अभाव में, परख के साथ प्राप्त एक प्रतिनिधि नियंत्रण से पता चलता है. अम्लीकरण के एक चक्र के बाद, proteoliposomes प्रोटॉन (प्रोटॉन उनकी एकाग्रता ढाल निम्नलिखित लिपिड bilayers भर में धीरे धीरे और निष्क्रिय फैलाना) पम्पिंग रोकने के लिए BR के लिए आदेश में 45 मिनट के लिए अंधेरे में रखा जाता है. इस वसूली समय के बाद, बीआर की सक्रियता बस एक ही बार फिर निलंबन को प्रकाशित करके, संभव है.

चित्रा 2एक वास्तविक परिवहन माप से मेल खाती है. प्रोटीन मुक्त liposomes साथ एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में की उम्मीद, पीएच (आंकड़े 2A और 2 बी, नारंगी हलकों) रोशनी पर स्थिर है, कि पता चलता है. हालांकि, उनके झिल्ली में बीआर युक्त proteoliposomes, इस प्रकार liposome घटने के अंदर पीएच और एक स्थिर ढाल बनाया गया है (आंकड़े 2A और 2 बी, बैंगनी वर्गों) प्रोटॉन पंप है. ग्रे त्रिकोण और लाल हीरे (2A चित्रा) क्रमश: उपस्थिति में या Hoechst 33342 के अभाव में, बीआर और MexB युक्त proteoliposomes के अंदर पीएच का प्रतिनिधित्व करते हैं. हम प्रोटॉन ढाल केवल आंशिक रूप से MexB जवाबी परिवहन द्वारा छितराया हुआ है जहां एक सब्सट्रेट स्वतंत्र गतिविधि का पालन. हम MexB की एक बेसल गतिविधि के इस अवलोकन विशेषता.

MexB की गतिविधि पर Mexa के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए, Mexa (पहले किसी भी सब्सट्रेट के अभाव में, पुनर्गठन के लिए जोड़ा गया (चित्रा 2B, हरी त्रिकोण) द्वारा छितराया हुआ है कि देख सकते हैं.

. बीआर रोशनी द्वारा निर्मित प्रोटॉन ढाल की चित्रा 1 उलटने: Pyranine FLसमय के एक समारोह के रूप में मापा बीआर proteoliposomes की uorescence. 0-15 मिनट से, बीआर प्रकाश सक्रियण का एक परिणाम के रूप में प्रोटॉन पंप. 15-60 मिनट से, proteoliposomes अंधेरे में incubated हैं; intravesicular पीएच और extravesicular पीएच बराबर हैं जब तक इस समय के दौरान, प्रोटॉन निष्क्रिय liposomes के बाहर चले जाते हैं. 60-75 मिनट से, बीआर अभी भी कार्य है और रोशनी पर प्रोटॉन पंप.

.. चित्रा 2 परिवहन परख: pyranine प्रतिदीप्ति, समय के एक समारोह के नियंत्रण liposomes (नारंगी हलकों) के अंदर एक) पीएच के रूप में, इसी पीएच बदलाव के लिए परिवर्तित कर दिया, झिल्ली में बीआर (बैंगनी वर्गों) युक्त proteoliposomes के अंदर पीएच, पीएच के अंदर Hoechst 33342 (लाल घ बिना झिल्ली में बीआर, और MexB युक्त proteoliposomes की. iamonds); Hoechst 33342 (ग्रे त्रिकोण) बी नियंत्रण liposomes (नारंगी हलकों) के अंदर) पीएच के साथ झिल्ली में बीआर और MexB युक्त proteoliposomes के अंदर पीएच, झिल्ली (बैंगनी) वर्ग में बीआर युक्त proteoliposomes के अंदर पीएच, पीएच के अंदर Hoechst 33342 (नीले हीरे) के बिना झिल्ली में बीआर, MexB और Mexa युक्त proteoliposomes की; Hoechst 33342 (हरा त्रिकोण) के साथ झिल्ली में बीआर, MexB और Mexa युक्त proteoliposomes के अंदर पीएच.

Discussion

हम झिल्ली प्रोटीन परिवहन परख करने की क्रिया के लिए बनाया गया एक पुनर्गठन की प्रक्रिया का वर्णन. एक बार स्थापित, प्रोटीन पुनर्गठन प्रक्रिया बहुत प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं कि माप की ओर जाता है. हालांकि, प्रोटीन पुनर्गठन के लिए सही स्थितियों एक प्रोटीन से दूसरे से भिन्न होगी. बहुत देखभाल निम्नलिखित मानकों के अनुकूलन में लिया जाना चाहिए: शुद्धि (पवित्रता और एकत्रित सामग्री का अभाव) के i) गुणवत्ता, डिटर्जेंट solubilizing कदम (जब संभव का द्वितीय) दक्षता, कम सीएमसी डिटर्जेंट प्राथमिकता दी जानी चाहिए कि वे पाने के लिए आसान कर रहे हैं क्योंकि ) से छुटकारा, डिटर्जेंट की तृतीय) desorption (यह एक डायलिसिस कदम के साथ polystyrene मनकों का उपयोग गठबंधन करने के लिए लेकिन इस desorption की दर, प्रोटीन के बाद गतिविधि के लिए एक महत्वपूर्ण पैरामीटर प्रभावित कर सकता है, उदाहरण के लिए संभव है, रेफरी [देखना 9]), चतुर्थ) लिपिड पुनर्गठन (लिपिड की रासायनिक प्रकृति, प्रोटीन अनुपात, अतिरिक्त amphiph की उपस्थिति के लिए लिपिडIles) विविध और अनुकूलित किया जाना चाहिए कि महत्वपूर्ण मानकों हैं. इसके अलावा तापमान और ऊष्मायन समय में इन सभी मुद्दों पर प्रभावित करते हैं.

गुणवत्ता नियंत्रण पुनर्गठन प्रक्रिया के हर कदम पर इस तरह मौलिक है. यह तेजी से nondestructive है, और यह केवल micromolar रेंज में एक एकाग्रता में नमूना के 20 μl की आवश्यकता है, क्योंकि देखने के इस बिंदु से, प्रकाश बिखरने एक बहुत ही सुविधाजनक तकनीक है. गुणात्मक (प्रोटीन वास्तव में liposome झिल्ली में एम्बेडेड है) और साथ ही मात्रात्मक (कितने प्रोटीन एक liposome में): proteoliposomes का गठन हो जाने के बाद यह पुनर्गठन की व्यवस्थित सत्यापन की ओर रास्ता खुल जाता है, क्योंकि sucrose ढाल बहुत मदद की भी है. बाद के ठीक प्रोटीन और लिपिड सांद्रता को मापने के द्वारा संबोधित किया जाएगा.

हमारे परख खुद सब्सट्रेट का अनुमापन पर भरोसा नहीं करता और इस के संभव artifactual निष्क्रिय प्रसार के बारे में असहज विचारों से बचा जाता है कारण झिल्ली में हाइड्रोफोबिक विभाजन को अणु. परख निगरानी पीएच परिवर्तन के लिए एक विश्वसनीय और मात्रात्मक जांच के रूप में pyranine के गुणों का लाभ उठाते. हमारे परिणाम प्रोटॉन ढाल गठन ¹⁰ valinomycin उपयोग किया गया था, जहां एक और प्रक्रिया के साथ प्राप्त परिणामों के साथ समझौते में हैं, लेकिन यह एक और अधिक मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य ढाल ¹¹ की अनुमति देता है. इसके अलावा, प्रोटॉन ढाल ठीक बस (आगे विस्तार के लिए Verchere एट अल. ¹² देखें) बफर की एकाग्रता अलग से, देखते जा सकता है.

एक नियंत्रण माप पहले सब्सट्रेट के अभाव में किया जाता है प्रक्रिया में (इस प्रोटीन की निष्क्रिय गतिविधि के लिए पहुँच देता है). सब्सट्रेट एक ही क्युवेट में जोड़ दिया गया है के बाद वास्तविक झिल्ली प्रोटीन ट्रांसपोर्टर गतिविधि फिर से मापा जाता है. प्रयोग एक असली, गैर अस्पष्ट, सब्सट्रेट प्रेरित परिणाम के रूप में माना जा सकता है क्योंकि यह वास्तव में एक परिसंपत्ति है.

नमूना रोशन प्रतिक्रिया. स्वचालन और parallelization proteoliposome की एक बड़ी खेप तैयार करने में शामिल होगा चलाता है क्योंकि ईएनटी "> प्रोटोकॉल उच्च मध्यम throughput (उदाहरण के लिए 96 कुओं माप) automatization के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, और एक 96 में aliquots के वितरण में कुओं थाली. Substrates (और भी संभव inhibitors) तो जोड़ा जाएगा और 45 मिनट के लिए अंधेरे में ऊष्मायन के बाद थाली एक microplate रीडर पर रोशनी / pyranine प्रतिदीप्ति माप चक्र के अधीन किया जाएगा.

प्रोटोकॉल पर अतिरिक्त जानकारी के लिए, पाठकों Verchere एट अल पढ़ने के लिए आमंत्रित कर रहे हैं. ^12,13

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)	Avanti Polar Lipids	850375C
Cholesterol	Sigma Aldrich	C8667
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	B2261
Triton X-100	Sigma Aldrich	93427
Valinomycin	Invitrogen	V-1644
Pyranine (8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid)	Invitrogen	H-348
DDM (n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside)	Affymetrix	D310LA
Extruder kit (extruder, Hamilton gas-tight syringes)	Avanti Polar Lipids	610000
Biobeads SM-2 Adsorbents	Bio-Rad	152-3920
Econo-Pac Chromatography empty column	Biorad	732-1010
Desalting columns	Bio-Rad	54805
Dynamic light scattering instrument	Wyatt Technology	DynaPro NanoStar
Fluorometer JASCO FP-6200	JASCO	6816-J002A