In vitro Gransking av MexAB efflukspumpe Fra Pseudomonas aeruginosa

Summary

Vi beskriver her en protokoll for in vitro-undersøkelse av efflux pumper fra Pseudomonas aeruginosa. Denne protokollen tillater generering av en robust, reversible, og avstembar proton-gradient i løpet av liposom-membranen, og derfor bør kunne tilpasses til en hvilken som helst membran protein energiseres ved protomotive kraft.

Abstract

Det er en ny vitenskapelig behov for pålitelige verktøy for overvåking av membran protein transport. Vi presenterer en metode som fører til rekonstituering av efflux pumper fra Gram-negative bakterier Pseudomonas aeruginosa i en biomimetic miljø som muliggjør en nøyaktig undersøkelse av deres aktivitet for transport. Tre forutsetninger er oppfylt: compartmentation i en lipidic miljø, bruk av en relevant indeks for transport, og generering av et proton gradient. Den membranprotein transporter rekonstitueres i liposomer sammen med bacteriorhodopsin, et lysaktivert protonpumpe som genererer en proton-gradient som er robust, samt reversible og avstembar. Aktiviteten til proteinet er utledet fra de pH-variasjoner som forekommer inne i liposomet, ved hjelp av pyranin, en pH-avhengig fluorescerende probe. Vi beskriver en steg-for-trinn prosedyre hvor membran protein rensing, liposomdannelse, protein tilberedning, og transport ennalysis er adressert. Selv om de var spesielt designet for en RND transporter, kunne de beskrevne metoder potensielt være tilrettelagt for bruk sammen med noen annen membran protein transporter energi av et proton gradient.

Introduction

Integrerte membranproteiner representere opptil 30% av de gener som er kodet i eukaryotiske genomer. De deler sentrale roller som gate keeping (reseptorer), transport av næringsstoffer, ioner eller skadelige forbindelser (transportører) eller vedlikehold av permeabilitet over membran bilayers (kanaler) blant alle levende celler ^en. Effluks-pumper har en sentral rolle i motstanden mot antibiotikabehandling ^to. I Gram-negative bakterier Pseudomonas aeruginosa, som er beskyttet av en ytre membran, er efflux transportører organisert som tredelt systemer hvor MexB, efflux pumpe plassert i den indre membran, som arbeider sammen med Mexa, en periplasmiske proteiner, og OPRM, et ytre membran-kanal. Det cytoplasmatiske membranprotein indre virker som en energiavhengig pumpe med brede substratspesifisitet. Den ytre membran protein virker som en Porin mens den tredje er plassert i det periplasmiske rom og er antatt å stabilisere hele komplekset

Strukturell informasjon har akkumulert over de siste fem årene, takket være X-ray fastsettelse av homolog protein AcrB fra Escherichia coli ^4-7. Selv om det er helt klart viktig å par slike opplysninger med dynamiske og kinetiske data, utforme en funksjonell analyse for denne transport er en reell utfordring ^åtte. Faktisk må membranproteiner opprettholdes i en membran miljø og et lukket kammer må opprettholdes for en vectorial transport av substratet som skal oppnås.

Tilberedning av membran proteiner til proteoliposomes har blitt grundig presentert og gjennomgått (se Rigaud og Levy ^9). Slike protokoller tillate overvåking av membranproteiner aktivitet, for eksempel ved å følge substrater over liposom-membranen. I dette tilfellet begrensninger oppstår fra envailability av titrerbare substrater (fluorescerende, radioaktive, etc.), og fra det faktum at meget ofte disse substrater er hydrofobe og har en tendens til å krysse membraner uten hensyn til tilstedeværelsen av transportøren. Som et alternativ, kan man følge de spektroskopiske varianter av en rapporterings fargestoff følsomme for kjemiske endringer som oppstår som følge av transport. Som nevnt ovenfor, protoner energi transport via MexB. Derfor er en relevant muligheten til å overvåke spektroskopiske varianter av et pH-følsomt fargestoff rapportering til å følge pH-variasjoner på grunn av proton-drevet substrat transport. Valget av et fluorescerende fargestoff unngår enhver kunstig virkninger som skyldes den hydrofobe naturen av substratet.

En ytterligere vanskelighet er genereringen av en proton-gradient. Flere protokoller kan bli funnet i litteraturen. Blant dem, er bruken av Valinomycin teknikk utbredt, men vi har vist at det er tungvint å utføre ^10-11. Dessuten er detikke reproduserbare, og det er ikke reversibel. Vi har tydd til anvendelse av bacteriorhodopsin (BR), et lysaktivert protonpumpe fra Halobacter salinarium, et halofile marine Gram-negative obligat aerob archaeon. Dette proteinet er coreconstituted i liposomer med MexB og, ved belysning, BR pumper protoner på innsiden av liposomene og således skaper ΔpH (surt innsiden) som trengs av proteinet for å transportere substratet ^12-13.

Protocol

En. Protein Produksjon og rensing

1. Mexa, MexB fra Pseudomonas aeruginosa
   1. Transform plasmidene skjuler de Mexa og MexB gener i en E. coli produksjonsstamme (f.eks C43 DE3). Plate på LB-agar-medium supplert med de egnede antibiotika. Plukk en enkelt koloni til å vaksinere en O / N forkulturen. Neste morgen, inokulere forkulturen i 1 L til LB og vokse ved 37 ° C under omrøring (240 rpm).
   2. Når cellene har nådd den eksponentielle fasen (OD ₆₀₀ = 0,6-0,8) indusere med en mM IPTG. Utfør induksjon i 2-3 timer ved 30 ° C under omrøring.
   3. Sentrifuger cellene (9000 xg i 20 min) og resuspender i 30 ml Tris-HCl 20 mM, pH 8, 150 mM NaCl.
   4. Forstyrre celler ved hjelp av en fransk presse (10000 psi, 4 pass). Kast ubrutte celler og inklusjonslegemer ved sentrifugering ved 9000 x g i 20 min.
   5. Pellet membraner i 1 time ved 100.000 x g og resuspend hver pellet i 30 ml Bis-Tris 10 mM pH 7,4, 20% glyserol (w / v), 10 mM imidazol, 500 mM NaCl.
   6. Bestem den totale membranproteinkonsentrasjon ved hjelp av BCA-kolorimetrisk analyse og oppløse membraner O / N med 2% dodecyl maltoside (DDM) i et sluttvolum bestemmes slik at vaskemiddel: protein er 1:1,5 (vekt / vekt).
   7. Ultrasentrifuge ved 100.000 x g i 1 time for å forkaste ikke oppløseliggjort og aggregert materiale.
   8. Inkuber supernatant i 2 timer ved 4 ° C med en nikkel-harpiks (Mexa rensing) eller en kobolt-harpiks (MexB rensing) ekvilibrert med Bis-Tris 10 mM pH 7,4, 5% glyserol (w / v), 10 mM imidazol, NaCl 500 mM, DDM 0,2%.
   9. Hell harpiksen i en tom kolonne. Samle Flow Through.
   10. Vask harpiksen med 50 ml Bis-Tris 10 mM pH 7,4, 20% glyserol (w / v), 10 mM imidazol, 500 mM NaCl, DDM 0,2%, deretter med 25 ml Bis-Tris 10 mM pH 6, glycerol 5% (vekt / volum), 10 mM imidazol, 500 mM NaCl, DDM 0,2%.
   11. Eluering av protein med 20 ml Bis-Tris 10 mM pH 7,4, 5% glyserol (w / v), imidazol-300 mM, NaCl 500 mM, DDM 0,2%.
   12. Konsentrer proteinet med en ultrafiltreringsenhet ned til 3 ml og belastning på et avsalting kolonne ekvilibrert med en imidazol-fri buffer. Like før tilberedning (se nedenfor), ultrasentrifuge det oppløste proteiner (100000 XG for 20 min) for å bli kvitt fett og unsolubilized proteiner. Deretter konsentrere proteinet igjen til 0,3 ml.
2. Bacteriorhodopsin fra Halobacter salinarium
   1. Dyrk Halobacter salinarium celler under belysning ved 37 ° C i 10 dager i et flytende vekstmedium inneholdende 4 M NaCl, MgSO ₄ 150 mM, 10 mM citrat, 30 mM KCl, gjærekstrakt 5 g / l, og pepton 5 g / L.
   2. Forstyrre cellene ved dialysering mot deionisert vann.
   3. Rens det lilla membran på en 30-40% (w / v) sukrose gradient (100 000 xg i 17 timer).
   4. Oppløseliggjøre membransuspensjonen med 2% octylglucoside i 24 timer ved 37 ° C (volum for oppløseliggjøring for å resuspendere membranen ved et 2:1 (w / w) vaskemiddel: protein-forhold). Estimere konsentrasjonen av løselig BR hjelp ε (570 nm) = 54000 M ^-1 cm ^-1. Like før tilberedning (se nedenfor), ultrasentrifuge det oppløste BR (100 000 xg i 20 min) for å bli kvitt fett og unsolubilized proteiner.
      Merk: De innfødte membraner er naturlig beriket i BR så ingen ytterligere rensing er nødvendig.

2. Utarbeidelse av Proteoliposomes

1. Liposom-dannelsen: Sett 400 ul av DOPC oppløst i kloroform (25 mg / ml) i et begerglass og tilsett 1,5 mg kolesterol som er lagret som et pulver. Tørk dem like før manipulering under en damp av nitrogen eller vakuum i minst 1 time i et begerglass. Den DOPC: kolesterol molart forhold er 3.3:1.
   1. Etter at de er tørket, hydrere lipidene med 1 ml av 25 mM HEPES pH 7,K ₂ SO ₄ 100 mm, MgCl ₂ 2 mM, pyranine 2 mm. Suspensjonen skal vises grumset på dette stadiet.
   2. Varm opp løsningen for 10 min ved 37 ° C. Sonicate for 10 min på 40 W med 30 sek puls, 30 sek pause sykluser ved RT. Suspensjonen skal være klar på dette stadiet.
   3. For å oppnå en monodispers populasjon av liposomer, utfører to sykluser med ekstrudering og for hver syklus, å passere liposom-suspensjonen gjennom filter minst 11x. For det første syklus, bruker en membran porestørrelse på 200 nm, og for den andre syklusen, bruker en membran pore-størrelse på 100 nm. Dynamisk lysspredning målinger kan utføres på dette trinn å kontrollere homogeniteten av suspensjonen.
2. Protein innlemmelse
   Prinsipp: membranproteiner kan rekonstitueres i liposomer takket være den oppløseliggjørende virkning av vaskemidler. Detergent-oppløseliggjort liposomer blir inkubert med detergent-solubilisert membran protein og dannelse av proteoliposomes utløses av rask eliminering av vaskemiddel med isopor perler ^ni.
   1. Til 28 mg av Triton X-100 (0,56% endelig) og inkuberes O / N ved 4 ° C (oppløseliggjøring temperaturen kan tilpasses til proteinet som studeres).
   2. Til detergent-solubilisert protein (BR, MexB og Mexa) til de oppløseliggjorte liposomer og inkuber i 15 min ved 4 ° C. Legg proteinene til det oppløste liposom-suspensjonen ved de følgende forholdstall (vekt / vekt): lipider / MexB = 20, MexB / Mexa = 2,5 og lipider / BR = 30.
   3. Legg polystyren perler ved en 30:1 perler: vaskemiddel-forhold (vekt / vekt, tatt i betraktning den totale vekt av vaskemiddel, inkludert vaskemiddel tilsatt med de rensede proteiner) og inkuberes 5 timer, i mørket (på grunn av den BR) ved RT under forsiktig røring. Forut for denne fremgangsmåten, aktiverer biobeads med metanol og etanol og inkubasjon vaskes omfattende med vann.
   4. Rense proteoliposomes protein og gratis underlag ved hjelp av en PD-10avsalting kolonne ekvilibrert med 25 mM HEPES pH 7, K ₂ SO ₄ 100 mM MgCl-og ₂ 2 mM.
   5. Oppbevar proteoliposomes ved 18 ° C i mørke i opptil 2-3 uker.
3. Vurdering av tilberedning effekt på sukrosegradient.
   For å sjekke at både MexB og BR har blitt rekonstruert i liposomer, rense proteoliposome suspensjon på en usammenhengende sukrosegradient.
   1. Forsiktig avgjøre proteoliposomes på en fem-lags gradient av sukrose (60%, 20%, 10%, 5% og 2,5%, w / v).
   2. Ultrasentrifuger i 17 timer ved 100 000 xg (med minimal akselerasjon og retardasjon priser).
   3. Samle forsiktig de forskjellige fraksjoner (gradient spesielt grensesnitt mellom hvert lag av sukrose), og analysere dem på SDS-PAGE (10%) ved hjelp av Coomassie farging og Western blotting. Aggregerte proteiner blir funnet på bunnen av røret, mens nonincorporated, vaskemiddel-oppløste proteiner finnes øverstrøret. Proteoliposomes og liposomer er funnet at sukrose grensesnitt som svarer til deres iboende tetthet. Tomme liposomer er gjenvunnet lenger opp i gradient enn proteoliposomes.

Tre. Fluorescens Måling

1. Utfør fluorescens målinger ved 25,0 ° C ved hjelp av et spektrofluorometer slik at for to-bølgelengdemålinger (Xe-lampe, 150 W). Alternative belysning perioder (for å aktivere BR med eksitasjon / utslipp bølgelengder av 550 nm / 550 nm) og fluorescens målinger med eksitasjon / utslipp bølgelengder av 455 nm / 509 nm for 2 sek å måle pyranine fluorescens. Sett eksitasjon og emisjon båndbredder til 5 nm. Utføre målingene i nærvær av 50 nM Valinomycin å hindre dannelsen av en omvendt membranpotensial ΔΨ.
   Merk: Ja, fordi BR pumper protoner, er det mer positive ladninger inne i liposomet enn utenfor. Dette gebyretgradient kan kastes ved bruk av Valinomycin, som er et K ⁺ selektiv ionofor. Når tilsatt til liposomene suspensjon Valinomycin, som et hydrofobt molekyl, blir den satt inn i liposom-membranen, passivt transportere K ^+, og således spre membranpotensialet ΔΨ.

Representative Results

Testen består av å overvåke pyranine fluorescens som en funksjon av tid, mens en proton gradient er generert. For dette formål, blir prøvene underkastet alternativt til belysning (derav proton pumping av BR er utløst), og deretter å fluorescens måling med eksitasjon og emisjonsbølgelengder på pyranine (λ _ex = 455 nm og λ _em = 509 nm).

Figur 1 viser en representativ styre oppnådd ved analysen, i fravær av Mexa / MexB, verifisere at proton gradient er generert av BR er reversibel. Etter en syklus av surgjøring, blir proteoliposomes holdt i mørke i 45 minutter for at BR å stoppe pumpe (protoner protoner diffundere langsomt og passivt tvers lipid dobbeltlag etter deres konsentrasjon-gradient). Etter denne utvinning tid, er aktivering av BR mulig, ganske enkelt ved å belyse den samme suspensjonen på nytt.

Fig. 2svarer til en faktisk transportmålingen. En negativ kontroll med proteinfrie liposomer, viser at, som forventet, er konstant ved belysning (figurene 2A og 2B, orange sirkler) pH. Imidlertid proteoliposomes inneholder BR i sine membraner gjør pumpe proton, således at pH-verdien innenfor de liposome reduseres og en stabil gradient er bygget (figurene 2A og 2B, lilla firkanter). Grå trekanter og røde diamanter (figur 2A) representerer pH innsiden av proteoliposomes inneholder BR og MexB, i nærvær eller i fravær av Hoechst 33342, henholdsvis. Vi observerer et substrat uavhengig aktivitet der proton gradient er bare delvis utsvevende av MexB mot transport. Vi tilskriver denne observasjonen til en basal aktivitet av MexB.

For å teste effekten av Mexa på aktiviteten av MexB ble Mexa tilsatt til rekonstituering først i fravær av en hvilken som helst substrat ( (figur 2B, grønne trekanter), som en konsekvens av substrat transport av pumpen.

. Figur 1 Reversibilitet av proton gradient bygget av BR belysning: Pyranine fluorescence av BR proteoliposomes målt som en funksjon av tiden. Fra 0 til 15 min, BR pumper protoner som et resultat av lys-aktivering. Fra 15 til 60 min, blir proteoliposomes inkubert i mørket, i løpet av denne tiden, protoner passivt bevege seg ut av liposomene til intravesicular pH og extravesicular pH er like. Fra 60-75 min, er BR fortsatt funksjonell og pumper protoner ved belysning.

. Figur 2 Transport assay: pyranine fluorescens, omdannes til de tilsvarende pH-variasjonene, som en funksjon av tiden A) pH på innsiden av styre liposomer (oransje sirkler); pH innsiden av proteoliposomes inneholder BR i membranen (lilla firkanter); pH på innsiden. av proteoliposomes innehold BR, og MexB i membranen uten Hoechst 33342 (red diamonds); pH innsiden av proteoliposomes inneholder BR og MexB i membranen med Hoechst 33342 (grå trekanter) B) pH innsiden av kontroll liposomer (oransje sirkler);. pH innsiden av proteoliposomes inneholder BR i membranen (lilla firkanter); pH inne av proteoliposomes inneholder BR, MexB og Mexa i membranen uten Hoechst 33342 (blå diamanter), pH innsiden av proteoliposomes inneholder BR, MexB og Mexa i membranen med Hoechst 33342 (grønne trekanter).

Discussion

Vi beskriver en tilberedning prosedyre utviklet for å analysere membran protein transport. Når etablert, fører proteinet omdanningsprosedyren til målinger som er meget reproduserbar. Imidlertid vil de nøyaktige betingelser for rekonstituering av protein varierer fra ett protein til et annet. Mye hensyn må tas for å optimalisere de følgende parametere: i) kvaliteten på rensingen (renhet og fravær av akkumulert materiale), ii) effektiviteten av vaskemiddel oppløseliggjørende trinn (når det er mulig, bør lav cmc vaskemiddel være foretrukket fordi de er lettere å komme kvitt), iii) desorpsjon av vaskemiddelet (det er for eksempel mulig å kombinere bruk av polystyrenkuler med en dialyse trinn, men dette kan påvirke hastigheten av desorpsjon, en kritisk parameter for den påfølgende aktivitet av proteinet, se ref. [ 9]), iv) lipid oppløsning (den kjemiske art av lipidet, lipid til protein-forhold, tilstedeværelsen av ytterligere amphiphiles er kritiske parametere som må være variert og optimalisert). I tillegg er temperatur og inkubasjonstid påvirke alle disse problemene.

Kvalitetskontroll er således opprinnelig ved hvert trinn av omdanningsprosedyren. Fra dette synspunkt er lysspredning en meget hensiktsmessig teknikk fordi den er hurtig, ikke-destruktiv, og den krever bare 20 ul av prøven i en konsentrasjon i det mikromolområde. Når proteoliposomes dannes, er sukrosegradient også til stor hjelp, fordi den åpner veien mot systematisk kontroll av rekonstituering: kvalitative (er proteinet faktisk integreres i liposom-membranen), så vel som kvantitativt (hvor mange protein i en liposom). Sistnevnte vil bli ivaretatt av nøyaktig måling av protein og lipid konsentrasjoner.

Vår analyse ikke er avhengig av titreringen av underlaget selv og dette unngår urolige betraktninger om mulig artifactual passiv diffusjon av molekyl på grunn av hydrofobe oppdeling i membraner. Analysen utnytter egenskapene til pyranine som en pålitelig og kvantitativ sonde for overvåking av pH-endringer. Våre resultater er i samsvar med resultatene som er oppnådd med en annen prosedyre der proton gradient formasjonen ble utført ved hjelp av Valinomycin ^10, men det gir en mer robust og reproduserbar gradient ^11. I tillegg kan proton gradient være nøyaktig innstilt, bare ved å variere konsentrasjonen av buffer (for ytterligere detaljer se Verchere et al. ^12).

I fremgangsmåten en kontrollmåling er først utføres i fravær av substrat (dette gir adgang til den passive aktiviteten av proteinet). Selve membranprotein transportøraktivitet blir deretter målt etter at substratet er blitt tilsatt i samme kyvette. Dette er virkelig en eiendel fordi eksperimentet kan betraktes som en ekte, ikke tvetydig, substrat-indusert utfallet.

ent "> Protokollen kunne tilpasses høy-medium gjennomstrømming (for eksempel 96-brønner målinger) automatisering fordi belyse prøven utløser reaksjonen. Automatisering og parallellisering ville bestå i å forberede en stor gruppe med proteoliposome, og i dispense porsjoner i en 96 -brønner plate. substrater (og også mulige hemmere) ville så bli tilsatt og etter inkubering i mørke i 45 min platen vil bli utsatt for lys / pyranine fluorescens målingssykluser på en mikroplateleser.

For ytterligere informasjon om protokollen, er leserne invitert til å lese Verchere et al. ^12,13

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)	Avanti Polar Lipids	850375C
Cholesterol	Sigma Aldrich	C8667
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	B2261
Triton X-100	Sigma Aldrich	93427
Valinomycin	Invitrogen	V-1644
Pyranine (8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid)	Invitrogen	H-348
DDM (n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside)	Affymetrix	D310LA
Extruder kit (extruder, Hamilton gas-tight syringes)	Avanti Polar Lipids	610000
Biobeads SM-2 Adsorbents	Bio-Rad	152-3920
Econo-Pac Chromatography empty column	Biorad	732-1010
Desalting columns	Bio-Rad	54805
Dynamic light scattering instrument	Wyatt Technology	DynaPro NanoStar
Fluorometer JASCO FP-6200	JASCO	6816-J002A