Pseudomonas aeruginosa itibaren MexAB dışa atım pompa in vitro olarak incelenmesi

Summary

Biz, Pseudomonas aeruginosa'dan akış pompaları in vitro incelenmesi için bir protokol mevcut. Bu protokol, lipozom zarı içinde sağlam, tersinir ve ayarlanabilir proton gradyanının oluşturulması için izin verir ve bu nedenle protomotive güç ile enerji herhangi bir zar proteini için uyarlanabilir olmalıdır.

Abstract

Membran protein taşınmasını izlemek için güvenilir araçlar için gelişmekte olan bir bilimsel ihtiyaç vardır. Bu taşıma onların aktivitenin kesin bir inceleme sağlayan bir biyo-taklit ortamında Gram-negatif bakteriler Pseudomonas aeruginosa'dan akış pompaların yeniden oluşturulması için gelen bir yöntem sunuyoruz. Üç önkoşulları yerine getirilmesi: bir lipidik çevre, ulaşım için uygun bir dizin kullanımı, ve bir proton degrade nesil bölmeleştirme. Membran protein taşıyıcı birlikte bakteriyorodopsin, sağlam hem de ters çevrilebilir ve ayarlanabilir bir proton derecesi üreten bir ışık ile aktive olan proton pompası ile lipozomlara sulandırılır. Proteinin etkinliği pyranin, pH değerine bağımlı bir floresan sonda kullanarak, lipozom içinde meydana gelen pH varyasyonlarından çıkarılır. Bir adım adım prosedür zar proteini saflaştırılması, lipozom formasyonu, protein yeniden oluşturulması, ve bir taşıma tanımlamaknalysis ele alınmaktadır. Onlar özellikle, bir taşıyıcı RND için tasarlanmış olmakla birlikte, tarif edilen yöntemler, potansiyel olarak proton gradyanı ile enerji başka bir membran protein taşıyıcı ile kullanım için adapte edilebilir.

Introduction

Yekpare zar proteinleri, ökaryotik genomlarında kodlanan genlerin kadar% 30 temsil eder. Bunlar kapı tutma (reseptörler), besin, iyonlar ya da zararlı bileşikler (taşıyıcılar) taşıma veya tüm canlı hücreleri ¹ arasında membran bilayers (kanal) karşısında geçirgenliği korumak gibi çok önemli rolleri paylaşın. Akış antibiyotik tedavisinin ² karşı direnç ve merkezi bir role sahip pompalar. Gram-negatif bakteriler ise bir dış zar ile korunmaktadır Pseudomonas aeruginosa, akış taşıyıcıları MexB, iç zar bulunan akış pompa, Mexa, periplazmik protein ve öprm ile birlikte çalışır üçlü sistemler, bir olarak düzenlenir dış zar kanalı. Sitoplazmik iç zar proteini geniş substrat spesifikliği olan bir enerji-bağımlı bir pompa görevi görür. Üçüncü bir periplazmik boşlukta bulunan ve bütün kompleksi stabilize düşünülmektedir ise dış zar protein porini gibi davranır

Yapısal bilgi Escherichia coli ^4-7 homolog protein AcrB X-ışını tayin son 5 yıldır sayesinde üzerinde birikmiş. Açıkça bu taşıyıcı için işlevsel bir test tasarımı, dinamik ve kinetik verileri ile çift bu tür bilgilerin, önemli olmasına rağmen gerçek bir meydan okuma ^8'dir. Gerçekte, bu zar proteinleri, bir zar ortamda muhafaza edilmesi ve kapalı bir bölme elde edilecek alt-tabakanın bir vektörel taşınması için muhafaza edilmelidir.

Proteoliposomes içine membran proteinlerinin Sulandırılması yoğun (Rigaud ve Levy ⁹⁾ sunulan ve gözden geçirilmiştir. Bu protokoller lipozom zarı boyunca tabakaları izleyerek, örneğin zar proteinleri aktivitesinin izlenmesi için izin verir. Bu durumda sınırlamalar a kaynaklanantitrasyon substratların vailability (floresan radyoaktif, vb.) ve çoğu zaman alt-tabakalar, bu hidrofobik olan ve ne olursa olsun taşıyıcı varlığı zarlarını geçme eğilimi gerçeğinden. Bir alternatif olarak, bir ulaşım bir sonucu olarak meydana gelen kimyasal değişikliklere duyarlı bir raporlama boya spektroskopik varyasyonları takip edebilirsiniz. Yukarıda belirtildiği gibi, protonlar MexB ile taşıma enerji. Bu nedenle, uygun bir seçenek proton güdümlü alt-tabaka taşıma nedeniyle pH değişimleri izlemek için bir pH-duyarlı bir raporlama boyanın spektroskopik varyasyonları izlemektir. Bir flüoresan boyanın seçimi alt-tabakanın hidrofobik doğası nedeniyle herhangi bir suni önler.

Ek bir zorluk, bir proton degrade kuşaktır. Birçok protokol literatürde bulunabilir. Bunlar arasında, valinomycin tekniğinin kullanımı yaygın ama biz ^10-11 gerçekleştirmek için sıkıcı olduğunu göstermiştir. Üstelik olduğutekrarlanabilir değil ve geri dönüşümlü değildir. Biz, bakteriyorodopsin (BR), Halobacter salinarium bir ışık ile aktive olan proton pompası, halofilik deniz Gram-negatif aerobik zorunlu arke kullanımına başvurmuştur. Bu protein aydınlatma üzerine, BR lipozomların içine proton pompaları ve bu nedenle, alt tabakanın ^12-13 taşımak için ihtiyaç duyulan proteini ile (iç asidik) ΔpH oluşturur MexB ile lipozomlara coreconstituted ve kapanır.

Protocol

1.. Protein Üretimi ve Saflaştırılması

1. Mexa, Pseudomonas aeruginosa'dan MexB
   1. , Bir E. Mexa ve MexB genleri barındıran plasmidleri Transform coli üretim suşu (örneğin C43 DE3). LB agar levhalar ortam, uygun antibiyotik ile takviye edilmiştir. O / N Önlüktür aşılamak için tek bir koloni seçin. Ertesi sabah, LB 1 L ön kültür aşılamak ve çalkalanarak (240 rpm) 37 ° C'de büyür.
   2. Hücreler üstel faz ulaştığında (OD ₆₀₀ = 0.6-0.8) 1 mM IPTG ile neden. Ajitasyon altında 30 ° C'de 2-3 saat boyunca indüksiyon yapın.
   3. Santrifüj hücreleri (20 dakika boyunca 9,000 x g) ve 30 ml Tris-HCl 20 mM, pH 8, NaCI 150 mM olarak tekrar süspansiyon.
   4. Bir Fransız basını (10,000 psi, 4 geçişi) kullanarak hücreleri bozar. 20 dakika boyunca 9,000 x g de santrifüj ile bozulmamış hücreler ve cisimciği atın.
   5. 100.000 xg ve r Pelet membranlar 1 saat30 ml Bis-Tris 10 mM, pH 7.4,% 20 gliserol (a / h), 10 mM imidazol, 500 mM NaCl, her pelet esuspend.
   6. BCA kolorimetrik deneyi kullanılarak toplam membran protein konsantrasyonu belirlenir ve bu, deterjan şekilde belirlenen bir son hacim içinde% 2 dodesil maltoside (DDM) ile zarları O / N çözündürülmesi: protein (a / a) 1:1.5.
   7. Non çözündürülmüş ve toplanmış malzemenin atmak için 1 saat boyunca 100,000 x g'de Ultrasantrifüj.
   8. Bir nikel reçinesi (Mexa saflaştırma) ya da Bis-Tris 10 mM, pH 7.4,% 5 gliserol ile dengelenmiş bir kobalt reçinesi (MexB saflaştırma) ile 4 ° C'de 2 saat boyunca inkübe supernatant (ağ / h), 10 mM imidazol, NaCl 500 mM, DDM% 0.2.
   9. Boş bir sütunun içindeki reçineyi dökün. Sayesinde Akışı toplayın.
   10. Daha sonra Bis-Tris 10 mM, pH 7.4,% 20 gliserol (a / h), 10 mM imidazol, 500 mM NaCl,% 0.2 DDM, Bis-Tris 10 mM, pH 6, gliserol, 25 ml ile 50 ml reçine yıkayın % 5 (ağ / h), 10 mM imidazol, 500 mM NaCl,% 0.2 DDM.
   11. P Zehir20 mi Bis-Tris 10 mM, pH 7.4,% 5 gliserol (ağ / h), 300 mM imidazol, 500 mM NaCl,% 0.2 ile DDM K'e.
   12. Bir imidazol içermeyen tampon maddesi ile dengelenmiş bir tuz giderme kolonu üzerinde 3 ml ve yüke göre aşağı bir ultrafiltrasyon cihazı ile protein konsantre edilir. Sadece daha önce sulandırma (aşağıya bakınız), çözünür proteinler lipid ve çözülmeyen proteinlerin kurtulmak için (20 dakika boyunca 100,000 xg) Ultrasantrifüj. Daha sonra 0.3 ml yeniden protein konsantre edin.
2. Halobacter salinarium dan bacteriorhodopsin
   1. 4 M NaCl, MgSO ₄ 150 mM, 10 mM sitrat, 30 mM KCl, maya özütü 5 g / L, pepton ve 5 g / L ihtiva eden bir likit büyüme ortamı içinde 10 gün boyunca 37 ° C'de aydınlatma altında Halobacter salinarium hücrelerin büyümesine
   2. Iyonu giderilmiş suya karşı diyaliz hücreleri bozabilir.
   3. Bir% 30-40 üzerinde mor membran (ağ / hac) sakroz gradyanı (17 saat boyunca 100,000 x g) saflaştırılır.
   4. % 2 octylgluc ile zar süspansiyonu çözünürleştirilir37 ° C (: protein oranı, 2:01 (a / a) deterjan de membran tekrar süspansiyon için çözündürme için hacim) 24 saat boyunca oside. Ε (570 nm) = 54000 ^M-1cm-1 ile çözündürülmüş BR konsantrasyonunu tahmin. Sadece daha önce sulandırma (aşağıya bakınız), lipidler ve çözülmeyen proteinlerin kurtulmak için çözündürülmüş BR (20 dakika boyunca 100,000 xg) Ultrasantrifüj.
      Not: yerel Zarlar doğal çok daha fazla saflaştırma gerekli br zenginleştirilmiştir.

2. Proteoliposomes hazırlanması

1. Lipozom sistemi: bir cam beher içinde kloroform ile (25 mg / ml) içinde çözülmüş DOPC 400 ul koyun ve bir toz olarak saklanır kolesterol 1,5 mg ekleyin. Bir cam kap içinde, en az 1 saat boyunca azot ya da sadece bir vakum buhar altında manipülasyon önce onları kurutun. DOPC: kolesterol mol oranının 3.3:1 olduğunu.
   1. Bu kuruduktan sonra, 25 mM HEPES pH 7, 1 ml ile lipitleri hidratK ₂ SO ₄ 100 mM, 2 mM _MgCl2, 2 mM pyranine. Süspansiyon bu aşamada bulanık görünmelidir.
   2. 37 ° C'de 10 dakika için çözüm ısıtın 30 saniye darbe, oda sıcaklığında 30 saniye aralık döngüsü ile 40 W da 10 dakika için sonikasyon. Süspansiyon bu aşamada net görünmelidir.
   3. Lipozomların bir tek dağılımlı popülasyonu elde etmek için, ekstrüzyon, iki döngü yapabilir ve her bir döngü için, en az 11x filtreden lipozom süspansiyonu geçmektedir. İlk çevrim için, 200 nm'lik bir zar gözenek boyutuna kullanımı ve ikinci çevrim için, 100 nm'lik bir zar gözenek boyutu kullanın. Dinamik ışık saçılım ölçümleri, süspansiyonun homojenliğini kontrol etmek için bu aşamada gerçekleştirilebilir.
2. Protein şirketleşme
   İlke: zar proteinleri deterjanların çözündürücü etkisi sayesinde Lipozomlar içinde yeniden edilebilir. Deterjan-çözünebilir lipozomlar p-çözünür deterjan zar proteini ve oluşumu ile kuluçkalanırroteoliposomes polistiren boncuklar ⁹ deterjan hızla ortadan kaldırılması ile tetiklenir.
   1. Triton X-100 (son% 0.56) içinde 28 mg eklenir ve 4 ° C (çözünürleştirme sıcaklık, protein çalışılmaktadır adapte edilebilir) de O / N inkübe edin.
   2. Çözündürülmüş lipozomlara deterjan-çözünür protein (BR, MexB ve Mexa) ilave edin ve 4 ° C'de 15 dakika inkübe Lipidler / MexB = 20, MexB / Mexa = 2.5 ve lipidler / BR = 30: Aşağıdaki oranlarda (ağırlık / ağırlık) seviyesinde çözündürülmüş lipozom süspansiyonuna proteinleri ekleyin.
   3. (Saflaştırılmış protein ile eklenmiştir deterjan içeren deterjan toplam ağırlığı göz önüne alındığında w / w,) deterjan oranı ve yumuşak altında oda sıcaklığında (nedeniyle BR) karanlıkta 5 saat, inkübe edilir: a 30:1 boncuk polistiren boncuk ekleyin karıştırıldıktan. Bundan önce prosedüre, metanol ve etanol inkübasyon ile Biobeads etkinleştirmek ve yaygın olarak, su ile yıkayın.
   4. , Bir PD-10 kullanılarak proteoliposomes protein ve serbest alt tabakaları arındırınHEPES, 25 mM pH 7, K ₂ ile dengelenmiş tuz alıcı sütun SO ₄ 100 mM ve 2 mM _MgCI2.
   5. Kadar 2-3 hafta boyunca karanlıkta 18 ° C 'de proteoliposomes saklayın.
3. Sükroz gradyanı üzerinde yeniden oluşturma etkinliğinin değerlendirilmesi.
   MexB ve BR hem lipozomlarda yeniden olup olmadığını kontrol etmek için, bir süreksiz sukroz gradient proteoliposome süspansiyon arındırmak.
   1. Yavaşça sakaroz beş tabakalı bir gradyanı üzerinde proteoliposomes yerleşmek (% 60,% 20,% 10,% 5 ve% 2.5 ağ / h).
   2. (Minimal hızlanma ve yavaşlama oranları ile) 100,000 xg'de 17 saat Ultrasantrifüj.
   3. Dikkatlice çeşitli gradyan fraksiyonları (sükroz her katman arasında özellikle arayüzler) toplamak ve Coomassie boyama ya da Batı lekeleme ile SDS-PAGE (% 10) üzerinde analiz. Katılmayan, deterjan-çözünür proteinler en üstünde bulunan ise kümelenen proteinlerin, tüpün alt kısmında bulunantüpü. Proteoliposomes ve lipozomlar, kendi iç yoğunluğuna karşılık gelen sükroz arabirimleri bulunur. Boş lipozomlar proteoliposomes daha Degradede öteye kurtarıldı.

3. Floresan ölçümü

1. Dual dalga boyu ölçümleri için izin veren bir spektrofotometreyi (Xe lambası, 150 W) ile 25.0 ° C 'de flüoresan ölçümlerini gerçekleştirir. Alternatif aydınlatma dönemleri (550 Nm / 550 nm uyarma / emisyon dalga boyları ile BR etkinleştirmek için) ve pyranine floresan ölçmek için 2 saniye boyunca 455 nm / 509 nm uyarma / emisyon dalga boylarında floresans ölçümleri. 5 nm uyarma ve emisyon bant genişlikleri ayarlayın. Bir ters zar potansiyeli ΔΨ oluşumunu önlemek için 50 nM valinomycin mevcudiyetinde ölçümleri yapın.
   Not: Aslında, BR proton pompalar, çünkü dışarıda daha lipozom içinde daha olumlu ücretleri vardır. Bu ücretgradyan bir K ⁺ iyonofor seçici olan, valinomycin ile iptal edilebilir. Bir kez lipozomlar, süspansiyon valinomycin ilave bir hidrofobik molekül olarak, lipozom zarı içine yerleştirin pasif olarak K ⁺ taşıma ve bu nedenle, membran potansiyeli ΔΨ buharlaşır.

Representative Results

Bu analiz, bir proton gradyan oluşturulur sırasında zamanın bir fonksiyonu olarak floresans izleme pyranine oluşur. Bu amaç için, numuneler (tetiklenir BR tarafından nedenle proton pompalama) aydınlatma alternatif tabi tutulur ve daha sonra uyarma ve emisyon dalga boyları kullanılarak pyranine ölçümü floresan _(ex λ = 455 nm ve 509 nm λ _em =).

Şekil 1, bu BR tarafından üretilen proton gradyan geri doğrulayarak, Mexa / MexB yokluğunda, yöntemle elde edilen bir temsili kontrol göstermektedir. Asidifikasyon bir devir sonra proteoliposomes protonlar (proton konsantrasyon gradyanı aşağıdaki lipid çift tabakaları üzerinde yavaşça ve pasif olarak yaygın) pompalama durdurmak için BR için sırayla 45 dakika boyunca karanlıkta tutulur. Bu geri kazanım süresinden sonra, BR aktivasyonu sadece yine aynı süspansiyon aydınlatarak, mümkündür.

Şekil 2,gerçek bir nakil ölçüme karşılık gelir. Protein içermeyen lipozomlar ile bir negatif kontrol, beklendiği gibi, pH (Şekil 2A ve 2B, portakal halkaları) aydınlatma üzerine sabit olduğunu göstermektedir. Ancak, membranlarda br içeren proteoliposomes, bu nedenle lipozom içinde azalır ve dengeli bir pH gradyanı inşa edilmiştir (Şekil 2A ve 2B, mor kareler) bir proton pompa yok. Gri üçgenler ve kırmızı elmas (Şekil 2A), sırasıyla, varlığında, Hoechst 33342 veya yokluğunda, BR ve MexB içeren proteoliposomes içinde pH değerini temsil eder. Biz proton degrade sadece kısmen MexB karşı-ulaşım tarafından harcanmış bir tabaka bağımsız aktivitesini gözlemlemek. Biz MexB bir bazal etkinlik için bu gözlem bağlıyor.

MexB aktivitesine Mexa etkisini test etmek için, Mexa (ilk olarak bir alt-tabakanın yokluğunda, sulandırma ilave edildi (Şekil 2B, yeşil üçgen) tarafından yayılan olduğunu görebilir.

. BR aydınlatma tarafından inşa proton degrade Şekil 1 Tersinirlik: Pyranine flzamanın bir fonksiyonu olarak ölçülür BR proteoliposomes of uorescence. 0-15 dakika kaynaktan, BR ışık aktivasyonunun bir sonucu olarak protonları pompalar. 15-60 dk, proteoliposomes karanlıkta bekletilir; entravsekiler pH ve vezikül pH eşit olana kadar bu süre boyunca, protonlar pasif lipozomlann dışarı hareket ettirin. 60-75 dak, BR hala işlevsel ve aydınlatma üzerine proton pompalar.

.. Şekil 2, nakliye deneyi: pyranine floresan, zamanın bir fonksiyonu kontrol lipozomlar (turuncu daireler) içindeki A) pH gibi, karşılık gelen pH değişimlerine dönüştürülür, zarda BR (mor kareler) ihtiva eden proteoliposomes içinde pH, pH içinde Hoechst 33342 (kırmızı d olmadan zardaki Br ve MexB içeren proteoliposomes bölgesinin. iamonds), Hoechst 33342 (gri üçgenler) B kontrol lipozomlar (turuncu daireler) içinde) pH ile membran içinde BR ve MexB içeren proteoliposomes içinde pH, zarın (mor kareler) BR ihtiva proteoliposomes içinde pH, pH içinde Hoechst 33342 (mavi karo) olmadan zardaki Br MexB ve Mexa içeren proteoliposomes arasında, Hoechst 33342 (yeşil üçgenler) ile membran içinde BR, MexB ve Mexa içeren proteoliposomes içinde pH.

Discussion

Bu membran proteini taşıma test etmek için tasarlanmış bir yeniden oluşturma işlemi tarif eder. Bir kez kurulan, protein sulandırıldıktan prosedürü çok tekrarlanabilir ölçümlere yol açar. Bununla birlikte, protein yeniden yapılandırmak için tam koşullar, bir proteinin diğerine değişecektir. Kadar bakım aşağıdaki parametrelerini optimize alınmalıdır: arıtma (saflık ve toplanan malzemenin yokluğu) i) kalitesi, deterjan eritici aşama (mümkünse ii) verimlilik, düşük cmc deterjan tercih edilmelidir onlar için daha kolay çünkü ) kurtulmak, deterjanın iii) desorpsiyon (bir diyaliz aşaması ile polistiren boncukların kullanımını birleştirmek için ancak bu desorpsiyon oranını, proteinin daha sonraki aktivitesi için kritik bir parametre etkileyebilir Örneğin mümkündür, ref [bakınız 9]), iv) lipid sulandırma (lipid kimyasal doğası, protein oranı, ilave amphiph varlığına lipidiles) çeşitli ve optimize edilmesi gereken kritik parametreler vardır. Ilavesi sıcaklık ve inkübasyon zaman içinde tüm bu sorunları etkiler.

Kalite kontrol yeniden oluşturma prosedürü her adımında böylece ilkel olduğu. Bu, hızlı bir geri dönüşlü ve sadece mikromolar arasındaki bir konsantrasyonda örnek 20 ul gerektirdiğinden Bu açıdan bakıldığında, ışık dağılımı çok uygun bir yöntemdir. Nitel (protein gerçekten lipozom zarı içine gömülü) yanı sıra, kantitatif (kaç protein bir lipozom içinde): proteoliposomes oluşturulmaktadır kez sulandırma sistematik doğrulama doğru yol açar, çünkü, sukroz gradyanlı çok yardımcı aynı zamanda. İkincisi tam protein ve lipid konsantrasyonlarının ölçülmesi ile ele alınacaktır.

Bizim deney alt-tabakanın kendisinin titre bağlı değildir ve bu olası suni pasif difüzyon ile ilgili rahatsızlık hususlar önler nedeniyle zarlarında hidrofobik bölümleme için molekülü. Tahlil izleme pH değişiklikleri için güvenilir ve kantitatif prob olarak pyranine özelliklerini kullanır. Bizim sonuçlar proton degrade oluşumu ¹⁰ valinomycin kullanılarak gerçekleştirildi başka bir prosedür ile elde edilen sonuçlar ile uyum içindedir, ama daha sağlam ve tekrarlanabilir gradyan ¹¹ verir. Buna ek olarak, sadece hassas proton gradyan (daha fazla detay için Verchere et al. ¹²⁾ tamponun konsantrasyonu değiştirilerek, ayarlanabilir.

Bir kontrol ölçümü birinci alt madde yokluğunda gerçekleştirilir prosedürde (bu proteinin aktivitesi pasif erişim sağlar). Alt-tabaka, aynı küvet içinde eklendikten sonra gerçek zar proteini taşıyıcı aktivitesi ölçülür. Deney gerçek olmayan, belirsiz, yüzey kaynaklı bir sonuç olarak kabul edilebilir, çünkü bu gerçekten bir varlıktır.

örnek aydınlatıcı reaksiyon. Otomasyon ve paralelizasyon proteoliposome büyük bir parti hazırlarken oluşacak tetikler çünkü ent "> protokol, yüksek-orta verim (örneğin 96-kuyu ölçümleri) automatization adapte olabilir, ve bir 96 yılında hacimde dağıtma -kuyu plaka. Substratlar (ve aynı zamanda muhtemel inhibitörler) ilave edilir ve 45 dakika süreyle karanlıkta inkübe edildikten sonra plaka, bir mikroplaka okuyucusu üzerinde aydınlatma / pyranine floresan ölçüm döngüsüne tabi olacaktır.

Protokolü hakkında ek bilgi için, okuyucular Verchere ark okumaya davet ediyoruz. ^12,13

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)	Avanti Polar Lipids	850375C
Cholesterol	Sigma Aldrich	C8667
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	B2261
Triton X-100	Sigma Aldrich	93427
Valinomycin	Invitrogen	V-1644
Pyranine (8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid)	Invitrogen	H-348
DDM (n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside)	Affymetrix	D310LA
Extruder kit (extruder, Hamilton gas-tight syringes)	Avanti Polar Lipids	610000
Biobeads SM-2 Adsorbents	Bio-Rad	152-3920
Econo-Pac Chromatography empty column	Biorad	732-1010
Desalting columns	Bio-Rad	54805
Dynamic light scattering instrument	Wyatt Technology	DynaPro NanoStar
Fluorometer JASCO FP-6200	JASCO	6816-J002A