In vitro-undersökning av MexAB utflödespumpen från Pseudomonas aeruginosa

Summary

Vi presenterar ett protokoll för utredning av effluxpumpar från Pseudomonas aeruginosa in vitro. Detta protokoll gör det möjligt för alstringen av en robust, reversibel och avstämbar protongradient inuti liposommembranet och därför bör kunna anpassas till varje membranprotein aktiveras av protomotive kraft.

Abstract

Det är en växande vetenskaplig behovet av tillförlitliga verktyg för övervakning av membranprotein transport. Vi presenterar en metod som leder till upplösning av effluxpumpar från gramnegativa bakterier Pseudomonas aeruginosa i en biomimetisk miljö som gör det möjligt för en noggrann undersökning av deras verksamhet av transporter. Tre förutsättningar är uppfyllda: sektionering i ett lipidic miljö, användning av ett relevant index för transport, samt generering av en proton gradient. Den membranprotein transportören återställs till liposomer tillsammans med bacteriorhodopsin, ett ljusaktiverat protonpump som genererar en proton gradient som är robust och reversibel och avstämbara. Aktiviteten för proteinet som härletts från de pH-variationer som förekommer i liposomen, med användning PYRANIN, ett pH-beroende fluorescerande sond. Vi beskriver en steg-för-steg-förfarande där membranproteinrening, liposombildning, protein beredning och transport enNALYS behandlas. Även om de var särskilt utformade för en RND transportör, kan de beskrivna metoderna eventuellt anpassas för användning med andra membranprotein transportör aktiveras av en proton gradient.

Introduction

Integrerade membranproteiner utgöra upp till 30% av de gener som kodas i eukaryota genom. De delar avgörande roller såsom gate hållning (receptorer), som transporterar näringsämnen, joner eller skadliga ämnen (transportörer) eller behålla av genomsläppligheten över membrandubbelskikt (kanaler) bland alla levande celler ^1. Utflödespumpar har en central roll i resistens mot antibiotikabehandling ^2. I gramnegativa bakterier Pseudomonas aeruginosa, som är skyddad av ett yttre membran, är uttransportörer organiserat som trepartssystemet där MexB, effluxpumpen belägen i det inre membranet, fungerar tillsammans med MexA, ett periplasmiskt protein och OprM, en yttermembrankanalen. Den cytoplasma inre membranproteinet fungerar som en energiberoende pump med bred substratspecificitet. Det yttre membranproteinet fungerar som en porin medan den tredje en är belägen i det periplasmatiska utrymmet och tros stabilisera hela komplexet

Strukturell information har ackumulerats under de senaste fem åren tack vare röntgenbestämning av den homologa protein AcrB från Escherichia coli ^4-7. Även om det är helt klart viktigt att koppla informationen med dynamiska och kinetiska data, utforma en funktionell analys för denna transportör är en verklig utmaning ^8. I själva verket måste de membranproteiner bibehållas i ett membranliknande miljö och en sluten avdelning måste upprätthållas för en vektoriell transport av substratet som skall uppnås.

Beredning av membranproteiner i proteoliposomer har utförligt presenteras och omdömet (se Rigaud och Levy ^9). Sådana protokoll möjliggöra övervakning av membranproteiner aktivitet, till exempel genom följande substraten över liposommembranet. I detta fall uppstår begränsningar från ettvailability titrerbar substrat (fluorescerande, radioaktiv osv.) och av det faktum att mycket ofta dessa substrat är hydrofoba och har en tendens att passera membranen oberoende av närvaron av transportören. Som ett alternativ kan man följa de spektroskopiska variationer av ett rapporterande färgämne känslig för kemiska förändringar som sker till följd av transporter. Såsom angivits ovan protoner energize transport via MexB. Därför är ett relevant alternativ för att övervaka spektroskopiska variationer av en pH-känslig rapportering färgämne för att följa pH-variationer på grund av proton-driven substrattransport. Valet av ett fluorescerande färgämne undviker alla artefaktuella effekter på grund av den hydrofoba naturen hos substratet.

En ytterligare svårighet är den generation av en proton-gradient. Flera protokoll finns i litteraturen. Bland dem är användningen av valinomycin teknik utbrett men vi har visat att det är jobbigt att utföra ^10-11. Dessutom är detinte reproducerbar och det är inte reversibel. Vi har tillgripit användningen av bacteriorhodopsin (BR), ett ljusaktiverat protonpump från Halobacter salinarium, en halofiliskt marina gramnegativa obligat aerob archaeon. Detta protein coreconstituted i liposomer med MexB och, vid belysning, pumpar BR protoner inuti liposomerna och därmed skapar ApH (sur invändigt) som behövs av proteinet för att transportera substratet ^{12 till 13.}

Protocol

1. Protein Produktion och rening

1. MexA, MexB från Pseudomonas aeruginosa
   1. Förvandla de plasmider som härbärgerar de MexA och MexB gener i ett E. coli-stammar (t.ex. C43 DE3). Platta på LB-agar-medium, kompletterat med lämpligt antibiotikum. Välj en enda koloni att ympa en O / N förkultur. Nästa morgon, inokuleras förkulturen i 1 liter LB och växa vid 37 ° C under omröring (240 rpm).
   2. När cellerna har nått den exponentiella fasen (OD ₆₀₀ = 0,6 till 0,8) inducerar med 1 mM IPTG. Utför induktion för 2-3 h vid 30 ° C under omröring.
   3. Centrifugera cellerna (9000 x g under 20 min) och återsuspendera i 30 ml Tris-HCl 20 mM, pH 8, NaCl 150 mM.
   4. Sönderdela cellerna genom att använda en fransk press (10.000 psi, 4 pass). Kasta obrutna celler och inklusionskroppar genom att centrifugera vid 9000 xg under 20 minuter.
   5. Pellet membranen 1 h vid 100.000 x g och resuspend varje pellet i 30 ml bis-Tris 10 mM pH 7,4, glycerol 20% (vikt / volym), imidazol 10 mM, NaCl 500 mM.
   6. Bestäm den totala membranproteinkoncentration med användning av BCA-kolorimetrisk analys och solubilisera membranen O / N med 2% dodecyl maltoside (DDM) i en slutlig volym bestäms så att rengöringsmedel: protein är 1:1,5 (vikt / vikt).
   7. Ultracentrifugera vid 100.000 xg i 1 timme för att göra sig av icke upplöst och aggregerat material.
   8. Inkubera supematanten under 2 h vid 4 ° C med en nickel-harts (MexA rening) eller en kobolt-harts (MexB rening) bringad till jämvikt med Bis-Tris 10 mM pH 7,4, glycerol 5% (vikt / volym), imidazol 10 mM, NaCl 500 mM, DDM 0,2%.
   9. Häll av hartset i en tom kolonn. Samla Flow Through.
   10. Tvätta hartset med 50 ml bis-Tris 10 mM pH 7,4, glycerol 20% (vikt / volym), imidazol 10 mM, NaCl 500 mM, DDM 0,2%, sedan med 25 ml av Bis-Tris 10 mM pH 6, glycerol 5% (vikt / volym), imidazol 10 mM, NaCl 500 mM, DDM 0,2%.
   11. Eluera protein med 20 ml bis-Tris 10 mM pH 7,4, glycerol 5% (vikt / volym), imidazol 300 mM, NaCl 500 mM, DDM 0,2%.
   12. Koncentrera proteinet med en ultrafiltreringsanordning ned till 3 ml och last på en avsaltningskolonn ekvilibrerad med en imidazol-buffert. Precis innan rekonstituering (se nedan), ultracentrifug de solubiliserade proteinerna (100.000 x g under 20 min) för att bli av lipider och unsolubilized proteiner. Sedan koncentrera proteinet igen till 0,3 ml.
2. Bacteriorhodopsin från Halobacter salinarium
   1. Väx Halobacter salinarium celler under belysning vid 37 ° C under 10 dagar i ett flytande odlingsmedium innehållande NaCl 4 M MgSO ₄ 150 mM, citrat 10 mM, KCl 30 mM, jästextrakt 5 g / I, och pepton 5 g / L.
   2. Sönderdela cellerna genom dialys mot avjoniserat vatten.
   3. Rena den lila membran på en 30 till 40% (vikt / volym) sackarosgradient (100.000 x g under 17 tim).
   4. Solubilisera membran uppskov med 2% octylglucOside under 24 h vid 37 ° C (volym för solubilisering för att resuspendera membranet med en 02:01 (vikt / vikt) detergent: protein-förhållande). Uppskatta koncentrationen av upplöst BR använda ε (570 nm) = 54.000 M ^-1 cm ^-1. Precis innan rekonstituering (se nedan), ultracentrifug det solubiliserade BR (100.000 x g under 20 min) för att bli av lipider och unsolubilized proteiner.
      Anm: De nativa membran är naturligt anrikad i BR så ingen ytterligare rening behövs.

2. Beredning av proteoliposomer

1. Liposombildning: Sätt 400 pl av DOPC löstes i kloroform (25 mg / ml) i en glasbägare och tillsätt 1,5 mg kolesterol lagras som ett pulver. Torka dem precis innan manipulation i en ånga av kväve eller vakuum i minst 1 timme i en glasbägare. Den DOPC: kolesterol molförhållandet är 3,3:1.
   1. Efter att de har torkat, hydratisera lipiderna med 1 ml HEPES 25 mM pH 7,K ₂ SO ₄ 100 mM, _MgCl2 2 mM, pyranin 2 mM. Suspensionen ska visas grumlig i det här skedet.
   2. Värm lösningen under 10 min vid 37 ° C. Sonikera under 10 min vid 40 W med 30 sek puls, 30 sekunders paus cykler vid RT. Suspensionen skall vara klar i detta skede.
   3. För att få en monodispers population av liposomer, utföra två cykler av extrudering och för varje cykel, passera liposomsuspensionen genom filtret minst 11x. För den första cykeln, använd en membran porstorlek om 200 nm och för den andra cykeln, använda ett membran porstorlek på 100 nm. Dynamiska mätningar ljusspridning kan utföras i detta steg för att kontrollera homogenitet suspensionen.
2. Protein inkorporering
   Princip: membranproteiner kan rekonstitueras i liposomer, tack vare den solubiliserande effekten av detergenter. Detergent-solubiliserade liposomerna inkuberas med detergent-solubiliserade membranprotein och bildningen av proteoliposomes utlöses av snabb eliminering av detergenten med polystyrenpärlor ^9.
   1. Lägg 28 mg Triton X-100 (0,56% slutlig) och inkubera O / N vid 4 ° C (solubiliseringen temperatur kan anpassas till det protein som studeras).
   2. Fyll på diskmedel-solubiliserade proteinet (BR, MexB och MexA) till de solubiliserade liposomerna och inkubera 15 minuter vid 4 ° C. Lägg proteinerna till den solubiliserade liposomsuspensionen vid följande förhållanden (vikt / vikt): lipider / MexB = 20, MexB / MexA = 2,5, och lipider / BR = 30.
   3. Lägg polystyrenpärlor vid ett 30:1 pärlor: detergent-förhållande (vikt / vikt, med tanke på den totala vikten av tvättmedlet, inklusive diskmedel med de renade proteinerna) och inkubera 5 h, i mörker (på grund av den BR) vid RT under försiktig omröring. Före denna procedur aktiverar biobeads med metanol och etanol inkubation och utför tvätta med vatten.
   4. Rena proteoliposomer protein och fria substrat med hjälp av en PD-10avsaltningskolonn ekvilibrerad med HEPES 25 mM pH 7, K ₂ SO ₄ 100 mM och MgClj ₂ 2 mM.
   5. Förvara proteoliposomer vid 18 ° C i mörker under upp till 2-3 veckor.
3. Bedömning av beredning effekt på sukrosgradient.
   För att kontrollera att både MexB och BR har rekonstitueras i liposomer, rena proteoliposome fjädring på en diskontinuerlig sackarosgradient.
   1. Försiktigt reglera proteoliposomer på en fem-skikts gradient av sackaros (60%, 20%, 10%, 5% och 2,5%, vikt / volym).
   2. Ultracentrifugera i 17 timmar vid 100.000 xg (med minimal acceleration och retardation priser).
   3. Noggrant samla de olika gradientfraktioner (speciellt gränssnitten mellan varje skikt av sackaros) och analysera dem på SDS-PAGE (10%) med användning av Coomassie-färgning eller Western blotting. Aggregerade proteiner som finns i botten av röret, medan nonincorporated, detergent-solubiliserade proteiner som finns på toppen avröret. Proteoliposomer och liposomer finns på sackaros gränssnitt som motsvarar deras inneboende täthet. Tomma liposomer återvinns längre upp i gradienten än proteoliposomer.

3. Fluorescensmätning

1. Genomför fluorescensmätningar vid 25,0 ° C med hjälp av en spektrofluorometer möjliggör dubbla våglängdsmätningar (Xe-lampa, 150 W). Alternativa belysningsperioder (för att aktivera BR med excitation / emissionsvåglängder av 550 nm / 550 nm) och fluorescensmätningar med excitation / emissionsvåglängder av 455 nm / 509 nm under 2 sekunder för att mäta pyranin fluorescens. Ställ in excitation och emissionsbandbredder till 5 nm. Utför mätningarna i närvaro av 50 nM valinomycin för att förhindra bildningen av en omvänd membranpotential ΔΨ.
   Anmärkning: I själva verket, eftersom BR pumpar protoner finns det mer positiva laddningar inuti liposomen än utanför. Denna avgiftgradient kan kasseras med användning av valinomycin, som är en K ⁺ selektiv jonofor. När läggs till liposomer fjädring valinomycin, som en hydrofob molekyl, kommer att sätta in liposommembranet, passivt transportera K ^+, och därmed skingra membranpotentialen ΔΨ.

Representative Results

Analysen består i att övervaka pyranin fluorescens som en funktion av tid, medan en protongradient genereras. För detta ändamål används prover utsattes alternativt för belysning (därav protonpump efter BR utlöses) och därefter för fluorescensmätning med användning av excitations-och emissionsvåglängder av pyranin (λ _ex = 455 nm och λ _em = 509 nm).

Figur 1 visar en representativ kontroll erhålles med analysen i frånvaro av MexA / MexB, kontroll av att den protongradient som genereras av BR är reversibel. Efter en cykel av försurning är proteoliposomer hölls i mörker under 45 minuter för att den BR att sluta pumpa protoner (protoner diffundera långsamt och passivt över lipiddubbelskikt efter deras koncentrationsgradient). Efter denna återhämtningstid, är aktivering av BR möjligt, helt enkelt genom att belysa samma fjädring igen.

Figur 2motsvarar en faktisk mätning transport. En negativ kontroll med proteinfria liposomer visar att, som väntat, är pH-värdet konstant vid belysning (fig. 2A och 2B, apelsin cirklar). Emellertid proteoliposomer innehållande BR i deras membran behöver pumpa proton, sålunda pH inuti liposom minskar och en stabil gradient byggs (figurerna 2A och 2B, lila rutor). Grå trianglar och röda diamanter (Figur 2A) representerar pH inuti proteoliposomer innehåller BR och MexB, i närvaro eller i frånvaro av Hoechst 33342, respektive. Vi observerar ett substrat oberoende verksamhet där protongradient endast delvis skingras genom MexB kontra transporter. Vi tillskriver denna observation till en basal aktivitet MexB.

För att testa effekten av MexA på aktiviteten av MexB ades MexA sattes till rekonstituering, först i frånvaro av substrat ( (Figur 2B, gröna trianglar), som en följd av substrattransport genom pumpen.

. Figur 1 reversibilitet protongradient byggdes av BR belysning: pyranin fluorescence av BR proteoliposomer mätt som en funktion av tiden. Från 0-15 min, pumpar BR protoner till följd av ljusaktivering. Från 15 till 60 min, är proteoliposomer inkuberas i mörker, under denna tid, protoner passivt röra sig ut ur liposomerna tills intravesikulär pH och extravesicular pH är lika. Från 60-75 min, är BR fortfarande funktionell och pumpar protoner vid belysning.

. Figur 2 Transport assay: pyranin fluorescens, omvandlas till motsvarande pH-variationer, såsom en funktion av tiden A) pH inuti styr liposomer (orange cirklar), pH inne i proteoliposomer innehållande BR i membranet (lila rutor); pH inuti. av proteoliposomer innehåller BR, och MexB i membranet utan Hoechst 33342 (röd diamonds), pH inuti proteoliposomer innehåller BR och MexB i membranet med Hoechst 33.342 (grå trianglar) B) pH inne i kontroll liposomer (orange cirklar);. pH inuti proteoliposomer innehåller BR i membranet (lila rutor); pH inne av proteoliposomer innehåller BR, MexB och MexA i membranet utan Hoechst 33.342 (blå diamanter), pH inuti proteoliposomer innehåller BR, MexB och MexA i membranet med Hoechst 33.342 (gröna trianglar).

Discussion

Vi beskriver en beredning förfarande utformat för att analysera membranproteintransport. När etablerade, leder protein rekonstitueringsproceduren till mätningar som är mycket reproducerbara. Dock kommer de exakta betingelserna för rekonstituering av proteinet varierar från ett protein till det andra. Mycket omsorg måste tas för att optimera följande parametrar: i) kvaliteten på reningen (renhet och avsaknad av aggregerat material), ii) effektivitet tvättmedels solubiliserande steg (när det är möjligt, bör låg cmc tvättmedel att föredra eftersom de är lättare att få kvitt); iii) desorption av detergenten (det är exempelvis möjligt att kombinera användningen av polystyrenpärlor med en dialyssteget men detta kan påverka hastigheten för desorption, en kritisk parameter för den efterföljande aktiviteten hos proteinet, se ref [ 9]), iv) lipid rekonstitution (den kemiska naturen hos den lipid, lipid till proteinförhållande, närvaron av ytterligare amphiphiles är kritiska parametrar som måste varieras och optimeras). Förutom temperatur och inkubationstid påverkar alla dessa frågor.

Kvalitetskontroll är alltså primordial vid varje steg av beredning. Ur denna synvinkel är ljusspridning en mycket lämplig teknik eftersom den är snabb, icke-förstörande, och det kräver endast 20 | il av provet vid en koncentration i det mikromolära området. När proteoliposomer bildas, är sukrosgradient också till stor hjälp eftersom det öppnar vägen för en systematisk kontroll av beredning: kvalitativa (är proteinet verkligen inbäddad i liposommembranet) och kvantitativ (hur många protein i en liposomer). Det senare skulle kunna åtgärdas genom att exakt mäta protein-och fetthalter.

Vår analys är inte beroende titreringen av substratet i sig och detta undviker oroliga överväganden rörande möjliga artefaktuella passiv diffusion av molekylen på grund av hydrofoba uppdelning i membranen. Analysen utnyttjar egenskaper pyranin som en tillförlitlig och kvantitativ sond för att övervaka pH-förändringar. Våra resultat överensstämmer med resultat som erhållits med ett annat förfarande där protongradient bildning utfördes med hjälp av valinomycin ^10, men det tillåter en mer robust och reproducerbar lutning ^11. Dessutom kan den protongradient vara exakt avstämda, helt enkelt genom att variera koncentrationen av bufferten (för ytterligare detaljer se Verchere et al. ^12).

I det förfarande som en kontrollmätning utförs först i frånvaro av substrat (detta ger tillgång till den passiva proteinets aktivitet). Den faktiska membranprotein transportöraktivitet mäts sedan efter det att substratet har lagts till i samma kyvett. Detta är verkligen en tillgång eftersom experimentet kan anses vara en verklig, icke tvetydigt, substrat-inducerad utfall.

ent "> Protokollet kunde anpassas till hög-medelhög genomströmning (exempelvis 96-brunnar mätningar) automatisering eftersom belysa provet utlöser reaktionen. Automation och parallellisering skulle bestå i att förbereda en stor sats av proteoliposome, och dispense portioner i en 96 -brunnars platta. Substrat (och också möjliga inhibitorer) skulle sedan tillsättas och efter inkubering i mörker under 45 min plattan skulle utsättas för illuminerande / pyranin fluorescens mätcykler på en mikroplattläsare.

För ytterligare information om protokoll, är läsarna uppmanas att läsa Verchere et al. ^12,13

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)	Avanti Polar Lipids	850375C
Cholesterol	Sigma Aldrich	C8667
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	B2261
Triton X-100	Sigma Aldrich	93427
Valinomycin	Invitrogen	V-1644
Pyranine (8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid)	Invitrogen	H-348
DDM (n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside)	Affymetrix	D310LA
Extruder kit (extruder, Hamilton gas-tight syringes)	Avanti Polar Lipids	610000
Biobeads SM-2 Adsorbents	Bio-Rad	152-3920
Econo-Pac Chromatography empty column	Biorad	732-1010
Desalting columns	Bio-Rad	54805
Dynamic light scattering instrument	Wyatt Technology	DynaPro NanoStar
Fluorometer JASCO FP-6200	JASCO	6816-J002A