Summary
我们已经开发了用于picoinjecting微滴，不需要金属电极的技术。因此，结合我们的技术设备是简单的制造和使用。
Abstract
对于picoinjecting试剂进入微滴现有方法需要集成到微流控芯片的金属电极。这些电极的集成增加了麻烦和容易出错的步骤，该装置的制造过程。我们已经开发了消除picoinjection在金属电极的需求的技术。相反，它使用的注射液本身作为一个电极，因为大多数生物试剂含有溶解的电解质和具有导电性。通过消除在电极上，我们减少器件的制造时间和复杂性，并且使设备更加坚固。此外，用我们的方法中，注射量取决于施加到picoinjection溶液中的电压;这使我们能够迅速调整通过调整施加电压的注入量。我们证明，我们的方法是用掺入普通的生物化合物，包括缓冲液，酶和核酸的试剂相容。
Introduction
在液滴的基于微流体，微米级的水滴被用作“试管”用于生物反应。在执行中的微小液滴反应的优点是，每一滴用试剂只有几个PL，并与微流体液滴可形成并在千赫速率1处理。结合这些特性使数以百万计的反应与个体细胞，核酸分子，或将在最小的事，总材料微升进行化合物。
使用滴像这些应用，需要技术加试剂的体积控制到滴;这样的操作是类似的移液到试管。一种用于实现这一点是electrocoalescence，其中一滴试剂是通过施加电场合并与靶下降。的电场扰乱了表面活性剂分子的结构上的液滴的界面，INDucing薄膜的不稳定性和乳液触发聚结是稳定的，否则2。电诱导融合也利用在picoinjector，即注入的试剂成液滴，因为它们流过的加压通道3的设备的设计。以应用电场，picoinjector装置利用金属电极，但金属电极集成到微流控芯片通常是一个复杂且容易出错的过程，作为液体焊料导线由气泡或灰尘等杂物的通道容易受到损害，以及从应力性骨折或设备安装过程中弯曲。
这里，我们提出以执行picoinjection无需使用金属电极，使得制造更简单和更可靠的方法。触发picoinjection，我们改用注射液本身作为一个电极，因为大多数生物试剂含有溶解的电解质和具有导电性。我们还添加了一个“法拉第莫阿t“的屏蔽装置，并作为一个通用地面（ 图1）的敏感区域的电壕沟通过提供一接地，以防止意外的液滴合并隔离picoinjection站点的液滴上游。我们的技术的一个好处是，在量注入滴依赖于所施加的电压的大小，允许它通过调整施加的信号进行调整。
我们采用软光刻技术制造4,5我们在聚二甲基硅氧烷设备（PDMS）。我们的方法是与制作在其它材料的设备兼容，如树脂，塑料，以及环氧树脂。该通道具有高度和宽度为30微米，这是最适合于与液滴50微米的直径（65 PL）工作。我们通过插入在设备制造与0.50毫米活检穿孔，类似的方法创建单位描述端口聚乙烯管（0.3/1.09毫米内/外径）引入试剂离子束增强沉积以前5。注入流体的精确化妆取决于具体的应用。唯一的流体需要含有溶解的电解质的浓度高到足以产生足够的导电性为要被发送到的picoinjector的电信号。在台架测试中，我们已经发现，离子浓度大于10mM的应该足够6，尽管这个值和流体的电导率取决于特定器件的尺寸和所施加的电压的幅值。
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Protocol
1，设计器件尺寸和拓扑根据实验需要使用计算机辅助设计（CAD）软件
注意：选择乳液通道的直径比球形液滴的直径。这迫使液滴成圆柱形或“腊肠”形，并能更有效地picoinjection。我们的目的，我们设计了30×30微米的渠道为分别为50微米直径的液滴。
- 模型picoinjection工地后那些由硫磷等 3与该异常的通道，该金属电极被除去，因为它们是不必要的说明。
- 加信道，作为法拉第壕沟（ 图1），该picoinjection网站，并在上游乳剂，使得它们从屏蔽电场的液滴之间运行。
注：这可以防止意外的合并。
2，使用软Photolith制造设备海洋学技术
- 生成基于使用现有的商业服务CAD文件透明光刻掩模。
- 从光罩，光阻固化在硅片上产生一个主设备，如前面4所述。
- PDMS浇在包含在5cm的聚苯乙烯培养皿设备主用固化剂（11:1比例）混合。
- 将主带在真空干燥器中PDMS为大约15分钟，以除去任何气泡。
- 通过将其放置在95℃的烘箱中1小时，固化的PDMS装置。可替换地，PDMS将24小时后固化在RT。
- 通过削减在周边用手术刀片，小心剥离从主设备中删除该设备。
- 冲入口，并使用0.5mm的活检穿孔器出口孔进入PDMS。
- 使用等离子焊接机4粘合设备到玻璃显微镜幻灯片。
3，准备一个气压控制泵加压到一个水库容纳流体
- 通过2.7毫米的内直径的聚乙烯管的长度改变泵的输出，使得所述加压空气出口。
- 构造它，使得由管子上的路厄氏锁的后部嵌合的管腔通过乳头终止于路厄锁注射器尖端。
- 通过填充鲁尔锁的线程并用环氧树脂管之间的空间密封。
- 附上27.5号针头。
4，准备一个单分散乳液的水（水包油）悬浮于惰性氟基础油与2％（重量/重量）液滴溶解生物相容性表面活性7
包含在这些液滴中的特定试剂取决于应用
- 在准备回注，加载乳液为1 ml注射器用27.5号针头。
- 安全注射器在注射器泵和定向的泵的垂直（针向上）。
注：这种定位使得水滴在一层载体油上面收拾。当泵启动时，液滴将根据他们的油层被压出注射器在高体积分数。
5，准备试剂介绍微流控芯片
- 冲30.5毫米孔入15ml离心管（带旋盖任何容器就足够了），用活检穿孔器，针或钻的上限。
- 插入一个0.5mm直径的线电极和PE-2管道的约20厘米长通过两个孔，使得它们到达管底。
- 在剩余的孔中，一个线程〜2.5厘米PE管材的约20厘米长的，使得其将休息高于液体高度。
- 密封件用UV固化的环氧树脂的盖的顶部没有任何间隙。
- 填充管与picoinjection流体和螺钉上的盖子。
- 从空气压力控制泵的输出连接管通过插入较短的长度，以ing的针刺入管腔。针应紧贴。
- 填写1毫升注射器1 M氯化钠作为法拉第护城河。
- 连接一个27.5号针头并固定在注射器注射泵。
- 填写另有1毫升注射器与运营商/油隔，连接27.5号针头，并且将其固定在注射泵。
6，准备了微流控装置Picoinjection
- 从注射流体容器连接输出管（长径）向所述微流体芯片上的picoinjection流体的入口。
- 连接含有1M NaCl的用于法拉第壕沟的入口端口的微流控芯片用PE管的长度上的注射器。
- 连接包含载体油的微流控芯片用PE管的长度的进气口的注射器。
- 将PE管材到微流体芯片上的乳状液出口。油管应终止在乳液收集容器，也不马利1.5 ml的离心管中。
- 将PE管材成法拉第护城河出口的微流控芯片上。管道应终止在一个不导电的，电隔离的容器，以防止短路。
- 高电压（HV）放大器通过鳄鱼夹的输出连接到淹没在picoinjection流体金属电极。
- 经由鳄鱼夹连接高压放大器的接地电极，以含1M NaCl的注射器针头的金属。
7，输液试剂为微流控芯片
- 介绍了1M NaCl的（法拉第壕沟）到设备在100的速率 微升/小时。
- 介绍在适合于该设备的尺寸率液滴乳剂和载体油。对于我们的演示设备，介绍200分别滴石油和400微升/小时。流速应该让液滴通过picoinjector在分离定期通过载体油的差距。
- 调整施加到picoinjection流体使得在picoinjection孔中的流体压力与所述液滴通道机械平衡的压力。
注意：在这个压力（拉普拉斯压力），注射液应隆起成液滴通道，而萌芽了，并形成了自己滴（ 图2）。在上述这些流速下，可以应用的〜13 psi的压力来喷射流体，以达到平衡，在注射部位。
8。 开始Picoinjection
- 作为液滴通过喷射孔，应用一个0-10伏，10千赫，交流信号放大1000×由HV型放大器（ 图3）。
- 通过改变施加的电压的振幅调制的注射体积。
注意：较高的电压应该允许更多的流体被引入到液滴。在我们的测试中，我们观察到稳定持续注入，在电压是之间100和3,000 V采用氯化钠注射液，范围从10-500毫米（ 图4）。
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Representative Results
采取在picoinjection现场表演显微图像，该picoinjection流体的电气化是足以触发注射（ 图2）。注入量可以通过调节所施加的电压的振幅，具有更高的电压允许更高的喷射量进行控制。我们绘制了喷射量与所施加电压的注射液中（ 图3）3代表摩尔浓度的大小。为了演示速度我们的方法中，我们有选择地注入通过注射部位取决于存在或荧光染料（ 电影1）的缺勤液滴。滴通过喷射器，在200赫兹，虽然率高达10千赫是可能的，这取决于液滴检测机构3的功能。
我们认为注射量所施加的电压的依赖这样的事实，作为液滴接触并传递picoinject离子孔口，从隆起在注射部位中分离液滴界面油层的厚度减小8。的阈值电压的电感应薄膜不稳定正比于该层9,10的厚度。因此，当液滴接近picoinjector，聚结的时刻取决于电场的幅度。更高的外加电压允许液滴喷射流体之间早期的聚结，导致较长的喷射持续时间。因为注射量取决于喷射持续时间，但因此也取决于施加的电压。
低摩尔浓度离子溶液更容易地衰减所施加的信号和降低电场强度在注射部位相比更浓缩的溶液。因此，注射液与溶解的离子的摩尔浓度下需要较高的施加电压来实现相同的进样量。这关系髋关节被证实为一个范围的离子的摩尔浓度和施加的电压在一个二维的热图（ 图4）。
图1基本设定装置。液滴，载体油，和1M NaCl的是通过注射泵引入到设备中。密密麻麻的水滴均匀地隔开使用基本流程对焦的几何形状。作为液滴通过picoinjection站点，电场被施加交流信号，在picoinjection流体容器（以红色表示）插入一个电极产生。电场允许通过飞沫和picoinjection流体之间的聚结。液滴注射部位的上游从电场屏蔽由法拉第壕沟 - 1 M氯化钠（任何高摩尔浓度离子溶液应该足够了）在接触器的信道行动与高压放大器（黑色表示）的接地电极。根据需要器件尺寸可以缩放;我们的目的，我们设计了30×30微米通道（注射部位的上游）为分别为50微米直径的液滴。
图2。的picoinjection站点的明场显微术图像，在不存在电场（A）的 ，表面活性剂分子的聚结防止在注射部位和鲜明的边界是在液滴/注射流体界面中可见。在施加250 V的10千赫的交流信号，边界消失，试剂被注入的液滴的通行证（B）。对于可视化，注射液已被着色的溴酚蓝染料2毫克/毫升。图重新发布FROM 6与皇家化学学会（RSC）的许可
图3。数据显示对（A）100毫米外加电压和体积分数增加滴（VF）注射后之间的关系，（B）50毫米，以及（C）25毫米（氯化钠）注射液。强电场更多容易破裂的油/水界面，并允许注射在通过液滴较大的长度 - 这会导致更大的注射量。溶解电解质的高摩尔浓度增加注射溶液的导电性，在注射部位为给定电压产生强电场，导致增加的注射体积。误差棒表示1在任一方向为> 1200滴采样在每个点的标准偏差。连接数据点的线做不代表任何曲线拟合或计算的理论模型。滴体积是由在6所述的荧光检测系统测定。图重新发布从6与皇家化学学会（RSC）的许可。 请点击此处查看该图的放大版本。
。36 PL与〜2.6皮升（4％Vf的一项决议- 图4热图显示注射量为外加电压和氯化钠溶解在注射液中的摩尔浓度的函数的注射量可在0的范围内调整）与所施加的信号的100V的增量。最大注射量分别为3,000 V和100毫米流体实现。 Increasi吴电场上面这允许电润湿，导致滴自发形成的picoinjector，注射疗效和一致性产生不利影响。箭头/刻度表示的数据点。图重新发布从6与皇家化学学会（RSC）的许可
电影1。高速影像展示picoinjector的选择性切换。仅下降含有IR-783荧光染料（2毫克/毫升）注射用试剂（500mM的NaCl）中。
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Discussion
注射量和施加的电压之间的关系依赖于许多因素，包括设备的尺寸，管携带picoinjection流体的设备，摩尔浓度picoinjection流体的长度，并且液滴的速度，因为它们通过它们喷射器。出于这个原因，我们建议量/电压的关系，通过测量的进样量在电压和摩尔浓度的工作范围的边缘被定性picoinjection的每次运行前。此外，在更高的电压和注射液的摩尔浓度，我们观察到的现象，其中picoinjection流体不再是在上面的喷射孔的平衡保持，而是芽断，并形成小滴的流路。我们认为这种行为对电润湿，其中水相部分润湿的疏水性通道，导致它爬出来的孔并进入在流道11。如果所需的之前出现这种不稳定注射量达到，考虑减少液滴的流速，因为他们通过进样器和缩小液滴渠道增加喷射持续时间。
除了显着地简化器件的制造，这种技术还应该简化更复杂的组合和反应机制的执行。例如，在执行多个picoinjections与我们的技术只要求在注入的所需位点添加picoinjection频道。相比之下，以前的方法需要picoinjection渠道和相应的金属电极被包含在所有站点。此外，以前的办法调节注射量相对缓慢通过改变喷油压力或液滴速度。用我们的方法，注射量可以通过电子的速率比报道（详见披露）最高降幅速率更快的调整。这使得更复杂的实验的执行，以针对特定条件的进样量每个微滴中蒸发散。规范化和注射剂的多分散成液滴的人群，例如，将需要上的即时测定进样体积。
这种技术已被开发并展示在利用picoinjection为多步生物反应如数字PCR和基因分型检测装置12的工作。然而，很少或没有变化的协议，该技术应该是使用于任何实验者需要添加试剂以液滴的任何生物，化学或工业应用中 - 只要注射液含有溶解的离子物质。
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Disclosures
我们并不完全理解其背后在我们的实验中观察到的施加电压和进样量之间的关系确切的物理机制。该实验室的兴趣和专长的相关领域并不非常适合追求这个挥之不去的问题。我们鼓励那些有更多的物理学和工程学的敏锐探讨这一现象。
Acknowledgments
这项工作是由生物工程和治疗科学系加州大学旧金山分校，定量生物科学（QB3），加州理工学院的支持，并从罗杰斯家庭基金会缩小差距奖。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml Luer-Lok™ syringes | BD Medical | 309628 | |
| LocTite UV-cured adhesive | Henkel | 35241 | |
| PE-2 tubing | Scientific Commodities | BB31695-PE/2 | |
| Novec HFE-7500 | 3M | 98-0212-2928-5 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | |
| 1.5 ml centrifuge tubes | Eppendorf | 22363531 | |
| BD Falcon 15 ml tube | BD Biosciences | 352097 | |
| Air pressure control pump | Control Air Inc. | We recommend one under the control of DAQ and control software | |
| Syringe pumps | New Era | Must be capable of holding 1 ml syringes and flowing at rates as low as 100 μl/hr | |
| HV-amplfier | Must be capable of 1,000x amplification of signals between 0.01 and 10 V | ||
| Plasma bonder/cleaner | Harrick Plasma | ||
| 3” silicon wafers | Sigma Aldrich | 647535 | |
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 with curing agent should be included | |
| SU-8 photoresist | MicroChem | Viscocity depends on device dimensions |
References
- Kritikou, E. It's cheaper in the Picolab. Nat. Rev. Genet. 6 (9), (2005).
- Ahn, K., Agresti, J., Chong, H., Marquez, M., Weitz, D. A. Electrocoalescence of drops synchronized by size-dependent flow in microfluidic channels. Appl. Phys. Lett. 88 (26), (2006).
- Abate, A. R., Hung, T., Mary, P., Agresti, J. J., Weitz, D. A. High-throughput injection with microfluidics using picoinjectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 107, 19163-19166 (2010).
- Harris, J., et al. Fabrication of a microfluidic device for the compartmentalization of neuron soma and axons. J. Vis. Exp. (7), (2007).
- Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J., Whitesides, G. M. Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Anal. Chem. 70 (23), 4974-4984 (1998).
- O'Donovan, B., Eastburn, D. J., Abate, A. R. Electrode-free picoinjection of microfluidic drops. Lab on a Chip. 12 (20), 4029-4032 (2012).
- Holtze, C., et al. Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions. Lab on a Chip. 8 (10), 1632-1639 (2008).
- Chung, C., Lee, M., Char, K., Ahn, K., Lee, S. Droplet dynamics passing through obstructions in confined microchannel flow. Microfluid. Nanofluid. 9, 1151-1163 (2010).
- Herminghaus, S. Dynamical instability of thin liquid films between conducting media. Phys. Rev. Lett. 83 (12), 2359-2361 (1999).
- Priest, C., Herminghaus, S., Seemann, R. Controlled electrocoalescence in microfluidics: Targeting a single lamella. Appl. Phys. Lett. 89 (13), 134101-134103 (2006).
- Florent, M., Siva, A. V., Hao, G., Dirk, E., Frieder, M. Electrowetting-controlled droplet generation in a microfluidic flow-focusing device. J. Phys: Condens. Matter. 19 (46), (2007).
- Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Picoinjection enables digital detection of RNA with droplet rt-PCR. PLoS ONE. 8 (4), (2013).
