Picoinjection af Mikrofluid Drops Uden metalelektroderne

Summary

Vi har udviklet en teknik til picoinjecting mikrofluide dråber, der ikke kræver metalelektroder. Som sådan udstyr, som indeholder vores teknik er enklere at fremstille og bruge.

Abstract

Eksisterende metoder til picoinjecting reagenser i microfluidic dråber kræver metal elektroder integreret i mikrofluid chip. Integrationen af ​​disse elektroder tilføjer besværlige og fejlbehæftede skridt til enheden produktionsprocessen. Vi har udviklet en teknik, der overflødiggør behovet for metal elektroder under picoinjection. I stedet bruger den injektionsfluid selv som en elektrode, da de fleste biologiske reagenser indeholder opløste elektrolytter og er ledende. Ved at eliminere elektroderne, reducerer vi enheden fabrikation tid og kompleksitet, og gøre enhederne mere robust. Hertil kommer, med vores tilgang, injektionsvolumen afhænger af spænding til picoinjection løsning; dette giver os mulighed for hurtigt at justere lydstyrken injiceres ved at modulere den anvendte spænding. Vi viser, at vores teknik er forenelig med reagenser, der inkorporerer fælles biologiske forbindelser, herunder buffere, enzymer og nukleinsyrer.

Introduction

I dråbe-baserede mikrofluidik er micron skala vandige dråber anvendes som "reagensglas" biologiske reaktioner. Fordelen ved at udføre reaktioner i bittesmå dråber er, at hver dråbe bruger kun et par pl reagens, og med MicroFluidics kan dråberne dannes og behandles i kilohertz ^vækst1. Kombineret disse egenskaber tillader millioner af reaktioner med individuelle celler, nukleinsyremolekyler, eller forbindelser, der skal udføres i løbet af minutter med pi samlede materiale.

For at bruge dråber til applikationer som disse, er der behov for teknikker til at tilføje kontrollerede mængder af reagenser til dråberne; sådanne operationer er analoge til pipettering i reagensglas. En fremgangsmåde til at opnå dette er electrocoalescence, hvor en dråbe reagens sammen med det mål dråbe ved at anvende et elektrisk felt. Det elektriske felt forstyrrer arrangement af molekyler af overfladeaktivt middel på grænsefladerne mellem dråberne, INDucing en tyndfilms ustabilitet og udløser sammenflydning i emulsioner, der ellers er stabile ^2. Elektrisk induceret sammenfletning udnyttes også i udformningen af picoinjector, en enhed, der injicerer reagenser i dråber, når de strømmer forbi en tryksat kanal ^3. At anvende det elektriske felt, picoinjector enheder udnytter metal elektroder, men integrationen af ​​metal elektroder i mikrofluid chips er ofte en kompleks og fejlbehæftet proces som væske-lodde ledninger let bliver kompromitteret af luftbobler eller støv og andet snavs i kanalen , samt frakturer fra stress eller bøjes under installation af enheden.

Her præsenterer vi en metode til at udføre picoinjection uden brug af metal elektroder, hvilket gør fremstillingen enklere og mere robust. At udløse picoinjection, vi i stedet bruge injektionsfluid selv som en elektrode, da de fleste biologiske reagenser indeholder opløste elektrolytter og er ledende. Vi tilføjer også en "Faraday Moat "for at beskytte følsomme områder på enheden og fungere som en universel jord (figur 1). Voldgraven elektrisk isolerer dråberne opstrøms for picoinjection webstedet ved at give en begrundelse, som forhindrer utilsigtet dråber fusion. En ekstra fordel af vores teknik er, at indsprøjtet i dråberne volumen afhænger af størrelsen af ​​den påtrykte spænding, så det kan justeres ved at tune det tilførte signal.

Vi fabrikere vores enheder i poly (dimethylsiloxan) (PDMS) med bløde fotolitografisk teknikker ^4,5. Vores tilgang er kompatibel med enheder, fremstillet i andre materialer, såsom harpiks, plast og epoxy. Kanalerne har højder og bredder på 30 um, som er optimale for at arbejde med dråber 50 um i diameter (65 pl). Vi introducerer reagenser via polyethelene slange (0.3/1.09 mm indvendig / udvendig diameter) indsat i porte oprettet under enheden fabrikation med 0,50 mm biopsi slag, svarende til metoder descrIbed tidligere ^5. Den nøjagtige sammensætning af injektionsfluid afhænger af den specifikke anvendelse. Væsken behøver kun indeholde opløste elektrolytter i koncentrationer høje nok til at give tilstrækkelig ledningsevne til elektrisk signal, der skal sendes til picoinjector. I bench test, har vi fundet, at ioniske koncentrationer over 10 mM burde være nok ^6, selv om denne værdi og væske ledningsevne afhænger af den specifikke enhed dimensioner og størrelsen af den anvendte spænding.

Protocol

1.. Design Device Dimensioner og topologier baseret på eksperimentelle behov ved hjælp af Software Computer Aided Design (CAD)

Bemærk: Vælg emulsion kanal diametre mindre end de sfæriske dråber. Dette tvinger dråberne i en cylindrisk eller "pølse" form og giver mulighed for mere effektiv picoinjection. Til vores formål, vi designet 30 x 30 um kanaler til dråber, der var 50 um i diameter.

1. Model picoinjection site (s), efter der er beskrevet af Abate et al. ³ med den undtagelse, at kanalerne til metalelektroderne fjernes, da de er unødvendige.
2. Tilføj kanaler til at tjene som Faraday Moat (figur 1), der kører mellem picoinjection site (s) og opstrøms emulsionen er en sådan, at de skærmer dråber fra det elektriske felt.
   Bemærk: Dette forhindrer utilsigtet sammensmeltning.

2. Fabrikere enheder Brug af Soft Photolithographic Techniques

1. Generer en gennemsigtighed fotolitografisk maske baseret på CAD-filen ved hjælp af eksisterende kommercielle tjenester.
2. Med fotomaske helbrede fotoresist på siliciumskiver til at producere en anordning mester, som beskrevet tidligere ^4.
3. Hæld PDMS blandet med hærder (11:01 ratio) over enheden mester er indeholdt i en 5 cm polystyren petriskål.
4. Placer mester med PDMS i vakuum for omkring 15 minutter for at fjerne eventuelle luftbobler.
5. Cure PDMS-enheden ved at placere det i en 95 ° C ovn i 1 time. Alternativt vil PDMS hærde ved stuetemperatur efter 24 timer.
6. Fjern enheden ved at skære langs kanten med en kirurgisk kniv og omhyggeligt skrælning enheden fra master.
7. Punch ind-og udtag huller i PDMS brug af en 0,5 mm biopsi punch.
8. Obligation enheden til et objektglas ved hjælp af et plasma Bonder ^4.

3.. Forbered en LufttrykKontrol Pumpe at presse et reservoir indeholdende den Fluid

1. Ændre pumpens output sådan, at trykluft ud gennem en længde på 2,7 mm indvendig polyethylen diameter slange.
2. Konstruere det sådan, at slangen slutter ved en luer-lock sprøjtens spids ved at anbringe hulrummet over nippel på bagsiden af ​​luer-lock.
3. Seal ved at fylde rummet mellem luer-lock gevind og slangen med epoxy.
4. Vedhæft et 27,5 G kanyle.

4.. Forbered en Monodisperse Emulsion vandige (vand-i-olie) Dråber Suspenderet i et inaktivt fluorerede Carrier Oil med 2% (vægt / vægt) opløst Biokompatible Overfladeaktivt ⁷

De specifikke reagenser, der er indeholdt i disse dråber afhænger af anvendelsen

1. Som forberedelse til reinjektion, indlæse emulsionen ind i en 1 ml sprøjte med en 27,5 G kanyle.
2. Fastgør sprøjten i en sprøjtepumpe og orientere pumpen lodret (nål opad).
   Bemærk: Denne orientering bevirker dråberne at pakke i et lag over transportøren olie. Når pumpen startes, vil dråberne blive skubbet ud af sprøjten ved fraktion høj lydstyrke af olie lag under dem.

5.. Forbered reagenser til Introduktion til Mikrofluid Chip

1. Punch tre 0,5 mm huller i låget af en 15 ml centrifugerør (enhver beholder med skruelåg vil være tilstrækkeligt) ved hjælp af en biopsi punch, nål, eller boremaskine.
2. Indsætte en 0,5 mm diameter tråd elektrode og en ~ 20 cm længde af PE-2 rør gennem to af hullerne, således at de når bunden af ​​røret.
3. I den resterende hul tråd en ~ 2,5 cm af en ~ 20 cm længde af PE-rør, således at det vil hvile over væskeniveau.
4. Seal eventuelle huller på toppen af ​​hætten med UV-hærdet epoxy.
5. Fyld glasset med picoinjection væske og skrue på hætten.
6. Tilslut udgangen fra luft-trykregulering pumpen til kortere længde af slangen ved insertning nålen ind i lumen. Nålen skal passe stramt.
7. Fyld en 1 ml sprøjte med 1 M NaCI for at tjene som Faraday Moat.
8. Tilslut en 27,5 G kanyle og fastgør sprøjten i en sprøjtepumpe.
9. Fyld en anden 1 ml sprøjte med carrier / spacer olie, tilslutte en 27,5 G kanyle, og fastgør den i en sprøjtepumpe.

6.. Forbered Mikrofluid Anordning til Picoinjection

1. Forbind udgangen slangen (længere længde) fra injektionsfluid beholder til indløbsåbningen af ​​picoinjection væske på mikrofluid chip.
2. Forbind sprøjten indeholdende 1 M NaCI til indløbsåbningen for Faraday Moat på mikrofluid chip med en længde på PE slange.
3. Forbind sprøjten indeholdende bæreren olie til indgangsporten mikrofluid chip med en længde på PE slange.
4. Indsæt PE rør i emulsionen udløbsporten på mikrofluid chip. Slangen skal slutte i en emulsion samling fartøj, heller ikkenormalt en 1,5 ml centrifugerør.
5. Indsæt PE slangen i udgangsporten for Faraday Moat på mikrofluid chip. Slangen skal slutte i en ikke-ledende og elektrisk isoleret beholder for at forhindre en kortslutning.
6. Forbind udgangen af ​​den høje spænding (HV) forstærker via krokodillenæb til metallet neddykket i picoinjection væske.
7. Tilslut jordelektrode på HV forstærker via krokodillenæb til metallet i kanylen indeholdende 1 M NaCl.

7.. Indgyde Reagenser til Mikrofluid Chip

1. Indføre 1 M NaCl (Faraday Moat) til enheden med en hastighed på 100 ul / time.
2. Indføre dråben emulsionen og luftfartsselskab olie på anvendelige for enhedens dimensioner. Til vores demo-enhed, vi introducere de dråber og olie ved 200 og 400 ul / time. Strømningshastighederne bør tillade dråberne at passere picoinjector regelmæssigt adskilteved et hul på luftfartsselskab olie.
3. Justere trykket påføres picoinjection væske, således at fluidumtrykket på picoinjection åbningen er i mekanisk ligevægt med dråben kanal.
   Bemærk: Ved dette tryk (Laplace tryk), bør injektionen væske bule i dråben kanal uden spirende ud og danne sin egen dråber (fig. 2). Ved disse strømningshastigheder er beskrevet ovenfor, anvender vi et tryk på ~ 13 psi til injektionsvæsken at nå ligevægt ved injektionsstedet.

8.. Begynd Picoinjection

1. Som dråber passerer injektionsåbningen, anvende en 0-10 V, 10 kHz, AC-signal forstærkes 1.000 x fra HV-forstærker (Figur 3).
2. Modulere injektionsvolumen ved at ændre amplituden af ​​den anvendte spænding.
   Bemærk: Højere spændinger bør give mulighed for mere flydende at blive introduceret til de små dråber. I vores test, vi observerer stabil og ensartet indsprøjtning ved spændinger væremellem 100 og 3000 V ved hjælp af injektionsopløsninger NaCl spænder fra 10 til 500 mM (figur 4).

Representative Results

Mikroskopiske billeder taget på picoinjection stedet viser, at elektrificering af picoinjection væske er nok til at udløse injektion (figur 2). Det injicerede volumen kan styres ved at modulere amplituden af ​​den påtrykte spænding, med højere spændinger giver mulighed for større mængder injektion. Vi plot injektionsvolumen versus størrelsen af den påtrykte spænding til tre repræsentative molariteter injektion væske i (figur 3). For at demonstrere den hastighed vores metode, vi selektivt injicerede dråber passerer injektionsstedet afhængig af tilstedeværelsen eller fravær af et fluorescerende farvestof (Movie 1). Dråber passere injektoren ved 200 Hz, men er mulige satser så højt som 10 kHz, afhængigt af kapaciteter af mekanismen ³ dråber afsløring.

Vi tilskriver afhængighed injektionsvolumen på den anvendte spænding til det faktum, at som dråberne tilgang og passere picoinjection blænde, tykkelsen af olielaget adskille dråben interface fra bule på injektionsstedet aftager ^8. Tærskelspændingen for en elektrisk induceret tyndfilms ustabilitet er proportional med tykkelsen af dette lag ^9,10. Derfor, som dråberne nærmer picoinjector, tidspunktet for sammensmeltning er afhængig af størrelsen af ​​det elektriske felt. Højere anvendte spændinger muliggøre tidligere sammensmeltning mellem dråben og injektionsvæske, forårsager længere injektion varigheder. Fordi injektionsvolumen afhænger indsprøjtning varighed, det afhænger derfor også anvendt spænding.

Lavere molaritet ioniske opløsninger lettere dæmpe tilførte signal og reducere den elektriske feltstyrke på injektionsstedet sammenlignet med mere koncentrerede opløsninger. Derfor injektionsvæsker med lavere molariteter af opløste ioner kræver højere anvendte spændinger til at opnå de samme injektionsvolumener. Denne relationerhofte er påvist for en række ioniske molariteter og anvendes spændinger i en 2D Heatmap (Figur 4).

Figur 1.. Grundlæggende opsætning af enheden. Dråber, luftfartsselskab olie, og 1M NaCl introduceres til enheden via sprøjtepumper. De tætpakkede dråber bliver jævnt fordelt ved hjælp af grundlæggende flow fokus geometri. Da dråberne passere picoinjection site, er et elektrisk felt genereret ved tilførsel af et AC-signal til en elektrode indsat i picoinjection væskebeholderen (angivet i rødt). Det elektriske felt giver mulighed for sammensmeltning mellem de passerende dråber og picoinjection væske. Dråber opstrøms af injektionsstedet er afskærmet fra det elektriske felt ved Faraday Moat - en kanal 1 M NaCl (enhver høj molariteten ionisk løsning burde være nok) i fortshandle med jorden elektrode HV forstærker (angivet i sort). Enhedens dimensioner kan skaleres efter behov; til vores formål, vi har designet 30 x 30 um kanaler (lige opstrøms på injektionsstedet) for dråber, der var 50 um i diameter.

Figur 2. Lysfeltmikroskopi billeder af picoinjection site. I mangel af et elektrisk felt (A), overfladeaktive molekyler forhindrer sammenflydning på injektionsstedet og en tydelig grænse er synlig ved dråben / indsprøjtning fluidgrænseflade. Ved anvendelse af en 250 V 10 kHz vekselspændingssignal grænsen forsvinder, og reagens injiceres som dråben passerer (B). For visualisering har injektionsvæske blevet farvet med 2 mg / ml bromphenolblåt-farvestof. Figur genudgivet frabout ⁶ med tilladelse fra The Royal Society of Chemistry (RSC)

Figur 3. Data viser forholdet mellem anvendt spænding og volumenfraktion stigning (Vf) af dråber efter injektion for (A) 100 mM, (B) 50 mM, og (C) 25 mM (NaCl) injektionsvæske. Stærkere elektriske felter mere let sprænge olie / vand-grænseflader og tillade injektion over en større længde af passerende dråber - dette fører til større injektionsvolumener. Højere molariteter af opløste elektrolytter øger ledningsevnen af ​​injektionsopløsningen, der producerer stærkere elektriske felter på injektionsstedet i en given spænding, hvilket fører til øget injektionsvolumener. Fejl søjler repræsenterer 1 standardafvigelse i begge retninger for> 1.200 dråber stikprøven ved hvert punkt. Linjer, der forbinder datapunkter gørerepræsenterer ikke nogen kurve-fit eller beregnede teoretiske model. Drop volumen måles ved en fluorescensdetektion der er beskrevet i ^6.. Figur genudgivet fra ⁶ med tilladelse fra The Royal Society of Chemistry (RSC). Klik her for at se en større version af dette tal.

.. Figur 4. Heat kort, der viser injektionsvolumen som funktion af påtrykt spænding og molariteten af opløst NaCl i injektionsfluid Injektionsvolumenet kan justeres i intervallet 0-36 pl med en opløsning på ~ 2,6 pl (4% Vf ) med intervaller 100V den anvendte signal. De største injicerede mængder blev opnået ved 3.000 V og 100 mM væske. Increasing elektrisk felt over dette giver mulighed for electrowetting, der forårsager dråber til spontant at danne på picoinjector, skade injektion effektivitet og konsistens. Pile / flåter indikerer datapunkter. Figur genudgivet fra ⁶ med tilladelse fra The Royal Society of Chemistry (RSC)

Movie 1. Højhastigheds optagelser viser selektiv omskiftning af picoinjector. Kun dråber indeholdende IR-783 fluorescerende farvestof (2 mg / ml) injiceres med reagens (500 mM NaCI).

Discussion

Forholdet mellem injektionsvolumen og påførte spænding er afhængig af mange faktorer, herunder enhed dimensioner, længde af røret, der bærer picoinjection fluidum til anordningen, molariteten af ​​picoinjection fluidum, og hastigheden af ​​dråberne, når de passerer de injektor. Derfor anbefaler vi, at volumen / spænding forholdet karakteriseres før hver kørsel af picoinjection ved at måle injektionsvoluminer på kanterne af de arbejdende serier af spænding og molaritet. Derudover, ved højere spændinger og injektionsfluid molariteter vi observerer et fænomen, hvor picoinjection væsken er ikke længere holdes ved ligevægt på injektionsåbningen, men i stedet knopper fra og danner små dråber i strømningskanalen. Vi tilskriver denne adfærd til electrowetting, hvor den vandige fase delvist befugter de hydrofobe kanaler, der forårsager det til at kravle ud af åbningen og ind i strømningskanalen ^11. Hvis denne ustabilitet inden den ønskedeinjektionsvolumen er opnået, overveje at reducere dråben flow, når de passerer injektoren og indsnævre dråbe kanal for at øge indsprøjtning varighed.

Udover markant strømlining fremstilling af udstyr bør denne teknik også forenkle udførelsen af ​​mere komplekse og kombinatoriske reaktions regimer. For eksempel udføre flere picoinjections med vores teknik kræver kun tilføje picoinjection kanaler på de ønskede steder af injektion. Derimod tidligere metoder kræver picoinjection kanaler og medfølgende metal elektroder, der skal medtages på alle lokaliteter. Endvidere tidligere fremgangsmåder regulere injektionsvolumen relativt langsomt varierende indsprøjtningstryk eller dråber hastighed. Med vores tilgang, kan injektionsvolumen kan justeres elektronisk ved hastigheder hurtigere end de højeste frafald rapporteret (se oplysningspligt). Dette muliggør udførelse af mere komplekse analyser, med injektionsvolumener skræddersyet til den særlige betintioner inden for hver MicroDrop. Normalisering og injektion af reagenser i polydisperse dråbe befolkninger, for eksempel, ville kræve on-the-fly bestemmelse af injektionsvolumener.

Denne teknik er blevet udviklet og demonstreret for at arbejde i anordninger udnytte picoinjection for multi-step biologiske reaktioner, såsom digital PCR og genotypning assays ^12. Men med lidt eller ingen ændringer i protokollen, skal den teknik være til nytte for enhver forsøgslederen kræver tilsætning af reagenser til dråber for eventuelle biologiske, kemiske eller industrielle applikationer - så længe injektionsfluid indeholde opløste ioniske arter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Luer-Lok™ syringes	BD Medical	309628
LocTite UV-cured adhesive	Henkel	35241
PE-2 tubing	Scientific Commodities	BB31695-PE/2
Novec HFE-7500	3M	98-0212-2928-5
NaCl	Sigma Aldrich	S9888
1.5 ml centrifuge tubes	Eppendorf	22363531
BD Falcon 15 ml tube	BD Biosciences	352097
Air pressure control pump	Control Air Inc.		We recommend one under the control of DAQ and control software
Syringe pumps	New Era		Must be capable of holding 1 ml syringes and flowing at rates as low as 100 μl/hr
HV-amplfier			Must be capable of 1,000x amplification of signals between 0.01 and 10 V
Plasma bonder/cleaner	Harrick Plasma
3” silicon wafers	Sigma Aldrich	647535
PDMS	Dow Corning		Sylgard 184 with curing agent should be included
SU-8 photoresist	MicroChem		Viscocity depends on device dimensions