Summary
Nous avons mis au point une technique pour picoinjecting gouttes microfluidiques qui ne nécessite pas des électrodes métalliques. En tant que tel, les dispositifs incorporant notre technique sont plus simples à fabriquer et à utiliser.
Abstract
Les méthodes existantes pour picoinjecting réactifs en gouttes microfluidiques nécessitent des électrodes métalliques intégrés dans la puce microfluidique. L'intégration de ces électrodes ajoute des étapes fastidieuses et sources d'erreurs dans le processus de fabrication de l'appareil. Nous avons développé une technique qui évite les besoins des électrodes métalliques pendant picoinjection. Au lieu de cela, il utilise le fluide d'injection elle-même comme une électrode, étant donné que la plupart des réactifs biologiques contiennent des électrolytes dissous et sont conductrices. En éliminant les électrodes, nous réduisons dispositif le temps de fabrication et de la complexité, et faisons les dispositifs plus robuste. En outre, notre approche, le volume d'injection dépend de la tension appliquée à la solution de picoinjection; ce qui nous permet d'ajuster rapidement le volume injecté par modulation de la tension appliquée. Nous démontrons que notre technique est compatible avec des réactifs comportant des composés biologiques courants, y compris des tampons, des enzymes et des acides nucléiques.
Introduction
Dans la microfluidique à base de gouttelettes, gouttelettes aqueuses l'échelle du micron sont utilisés comme "tubes à essai" pour des réactions biologiques. L'avantage de réaliser des réactions dans les minuscules gouttelettes est que chaque goutte utilise seulement quelques pl de réactif et, avec la microfluidique, les gouttes peut être formée et traitée à taux de kilohertz 1. Ces propriétés combinées, permettent des millions de réactions avec des cellules individuelles, des molécules d'acide nucléique, ou des composés à accomplir en quelques minutes avec ul de matière totale.
Pour utiliser des gouttes pour les applications comme celles-ci, les techniques sont nécessaires pour l'ajout de volumes contrôlés de réactifs pour les gouttes; ces opérations sont analogues à pipetage dans des tubes à essai. Un procédé pour réaliser ceci est électrocoalescence, dans lequel une goutte de réactif est fusionné avec la chute de cible en appliquant un champ électrique. Le champ électrique perturbe l'agencement des molécules de tensioactif sur les interfaces des gouttes, inducing une instabilité à film mince et le déclenchement coalescence des émulsions qui sont par ailleurs stable 2. Fusion induite électriquement est également exploité dans la conception de la picoinjector, un appareil qui injecte des réactifs en gouttes lorsqu'ils s'écoulent dernier d'un canal sous pression 3. Pour appliquer le champ électrique, les dispositifs de picoinjector utilisent des électrodes métalliques, mais l'intégration d'électrodes métalliques en puces microfluidiques est souvent un processus complexe et source d'erreurs que les fils liquide-soudure sont facilement compromis par des bulles d'air ou de la poussière et d'autres débris dans le canal , ainsi que des fractures de stress ou de flexion lors de l'installation de l'appareil.
Ici, nous présentons une méthode pour effectuer picoinjection sans l'utilisation d'électrodes en métal, ce qui rend la fabrication plus simple et plus robuste. Pour déclencher picoinjection, on utilise à la place du fluide d'injection elle-même comme une électrode, étant donné que la plupart des réactifs biologiques contiennent des électrolytes dissous et sont conductrices. Nous ajoutons également un "Faraday Moat "pour protéger les régions sensibles de l'appareil et d'agir comme un terrain universel (Figure 1). Le fossé isole électriquement les gouttelettes en amont du site de picoinjection en fournissant un terrain, empêchant involontaire gouttelettes fusion. Un avantage supplémentaire de notre technique est que le volume injecté dans les gouttes dépend de l'amplitude de la tension appliquée, ce qui lui permet d'être ajusté en réglant le signal appliqué.
Nous fabriquons nos appareils dans le poly (diméthyl) (PDMS) en utilisant des techniques de photolithographie douces 4,5. Notre approche est compatible avec les appareils fabriqués dans d'autres matériaux, comme des résines, des matières plastiques et des résines époxy. Les canaux ont des hauteurs et des largeurs de 30 um, qui sont optimales pour travailler avec des gouttelettes de 50 um de diamètre (65 pl). Nous introduisons réactifs via un tube en polyéthylène (0.3/1.09 mm de diamètre intérieur / extérieur) inséré dans les ports créées pendant la fabrication de l'appareil avec 0,50 mm de poinçons de biopsie, semblables à des méthodes described auparavant 5. La composition exacte du fluide d'injection dépend de l'application spécifique. Le fluide doit seulement contenir des électrolytes dissous à des concentrations suffisamment élevées pour obtenir une conductivité suffisante pour le signal électrique devant être transmis à la picoinjector. Dans les essais au banc, nous avons trouvé que les concentrations ioniques supérieures à 10 mM 6 devraient suffire, bien que cette valeur de conductivité du fluide, et dépendent des dimensions de périphériques spécifiques et amplitude de la tension appliquée.
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Protocol
1. Conception Dimensions de l'appareil et de topologies Basé sur Experimental besoins à l'aide Conception Assistée par Ordinateur (CAO)
Remarque: Sélection des diamètres de canaux d'émulsion plus petites que celles des gouttelettes sphériques. Cela force les gouttelettes en une forme "saucisse" ou cylindrique et permet picoinjection plus efficace. Pour nos besoins, nous avons conçu 30 x 30 um canaux de gouttelettes qui étaient de 50 m de diamètre.
- picoinjection site de modèle (s) après ceux décrits par Abate et al. 3 à l'exception que les canaux pour les électrodes métalliques sont éliminés, car ils ne sont pas nécessaires.
- Ajouter des canaux à servir de Faraday Moat (figure 1) qui fonctionnent entre les site (s) de picoinjection et l'émulsion en amont de telle sorte qu'ils protègent les gouttelettes à partir du champ électrique.
Note: Ceci empêche la fusion involontaire.
2. Dispositifs Fabriquer Utilisation souple de photolithographieTechniques ographiques
- Générer un masque de transparence de photolithographie sur la base du fichier CAO en utilisant les services commerciaux existants.
- Avec le photomasque, guérir résine photosensible sur des tranches de silicium pour produire une base de l'appareil, comme décrit précédemment 4.
- Verser PDMS mélangé avec l'agent de durcissement (rapport 11:01) sur la base de l'appareil contenue dans une boîte de Petri de 5 cm de polystyrène.
- Placez le maître avec PDMS dans un dessiccateur à vide pendant environ 15 minutes pour éliminer les bulles d'air.
- Guérir le dispositif PDMS en le plaçant dans un four à 95 ° C pendant 1 heure. Alternativement, les PDMS durcissent à température ambiante après 24 h.
- Retirer le périphérique en coupant autour du périmètre avec une lame chirurgicale et éplucher soigneusement l'appareil du maître.
- Percez entrée et de sortie des trous dans les PDMS en utilisant une biopsie poinçon de 0,5 mm.
- Lier l'appareil à une lame de microscope en verre à l'aide d'une colle de plasma 4.
3. Préparer une pression d'airPompe de contrôle pour pressuriser un réservoir contenant le fluide
- Modifier le débit de la pompe de telle sorte que les sorties d'air sous pression à travers une longueur de 2,7 mm de diamètre intérieur des tubes en polyethylene.
- Construire de sorte que le tube se termine à une extrémité de la seringue Luer-Lok par ajustement de la lumière au-dessus de l'embout à l'arrière de l'ajustement luer-lock.
- Sceller en remplissant l'espace entre les filets de Luer-lock et le tube avec de l'époxy.
- Fixez une aiguille de 27,5 G.
4. Préparer une émulsion monodisperse de aqueuse Les gouttelettes (eau-dans-huile) en suspension dans une huile fluorée support inerte avec 2% (poids / poids) dissous biocompatible tensioactif 7
Les réactifs spécifiques contenues dans ces gouttelettes dépend de l'application
- En préparation pour la réinjection, charger l'émulsion dans une seringue de 1 ml avec une aiguille de 27,5 G.
- Fixez la seringue dans une pompe à seringue et orienter la pompe à la verticale (vers le haut aiguille).
RemarqueCette orientation amène les gouttelettes à emballer dans une couche au-dessus de l'huile support. Lorsque la pompe est démarré, les gouttelettes sont expulsées de la seringue à haute fraction volumique de la couche d'huile sous eux.
5. Préparer les réactifs pour l'introduction de la puce microfluidique
- Poinçon trois trous de 0,5 mm dans le bouchon d'un tube à centrifuger de 15 ml (tout récipient muni d'un bouchon à vis suffira) en utilisant un poinçon de biopsie, à aiguilles, ou une perceuse.
- Insérer une électrode en fil de diamètre 0,5 mm et une longueur de ~ 20 cm de PE-2 tubes à travers deux des trous de sorte qu'elles atteignent le fond du tube.
- Dans le trou restant, un fil ~ 2,5 cm de longueur d'un cm ~ 20 de PE tube de telle sorte qu'il sera de repos au-dessus du niveau du liquide.
- Sceller toutes les lacunes sur le dessus du bouchon avec de l'époxy UV-durci.
- Remplir le tube avec le liquide de picoinjection et la vis sur le capuchon.
- Connectez la sortie de la pompe de commande à pression d'air à la longueur plus courte de tubes par insertionment l'aiguille dans la lumière. L'aiguille doit être bien ajusté.
- Remplir une seringue de 1 ml avec du NaCl 1 M à servir de Faraday Moat.
- Connectez une aiguille de 27,5 G et fixez la seringue dans une pompe à seringue.
- Remplir un autre seringue de 1 ml avec support / entretoise huile, connectez une aiguille de 27,5 G, et le fixer dans une pompe à seringue.
6. Préparer le dispositif microfluidique pour Picoinjection
- Raccorder le tuyau de sortie (plus de longueur) à partir du conteneur de fluide d'injection à l'orifice d'entrée du fluide de picoinjection sur la puce microfluidique.
- Raccorder la seringue contenant la 1 M de NaCl à l'orifice d'entrée pour le Faraday Moat sur la puce microfluidique avec une longueur de tube PE.
- Raccorder la seringue contenant l'huile support à l'orifice d'entrée de la puce microfluidique avec une longueur de tube PE.
- Insérer un tube de PE dans l'orifice de sortie de l'émulsion sur la puce microfluidique. La tubulure doit se terminer par un récipient de collecte de l'émulsion, nilement un tube de centrifugation de 1,5 ml.
- Insérer un tube de PE dans l'orifice de sortie pour le Faraday Moat sur la puce microfluidique. La tubulure doit se terminer en un matériau non conducteur électrique et le récipient isolé électriquement pour éviter un court-circuit.
- Connectez la sortie de l'amplificateur haute tension (HT) par pince crocodile à l'électrode métallique immergée dans le liquide de picoinjection.
- Raccorder la chaîne de l'amplificateur de haute tension à la terre par l'intermédiaire d'une pince crocodile pour le métal de l'aiguille de la seringue contenant la 1 M de NaCl.
7. Infuse réactifs en microfluidique Chip
- Introduire le 1 M de NaCl (Faraday Moat) à l'appareil à une vitesse de 100 pi / h.
- Introduire l'émulsion de gouttelettes et de l'huile de support à des taux appropriés pour les dimensions de l'appareil. Pour notre dispositif de démonstration, nous présentons les gouttes et de l'huile à 200 et 400 l / h, respectivement. Les débits doivent permettre aux gouttelettes de passer à la picoinjector à des intervalles réguliers séparéspar un intervalle d'huile de support.
- Ajuster la pression appliquée sur le fluide de picoinjection telle que la pression de fluide à l'orifice de picoinjection est en équilibre mécanique avec le canal de gouttelettes.
Remarque: A cette pression (la pression de Laplace), le fluide d'injection devrait saillie dans le canal de gouttelettes sans bourgeonnement et former ses propres gouttes (Figure 2). A ces vitesses d'écoulement décrits ci-dessus, on applique une pression de 13 psi ~ au fluide d'injection d'atteindre l'équilibre au niveau du site d'injection.
8. Commencez Picoinjection
- Sous forme de gouttelettes passent l'orifice d'injection, appliquer un 0-10 V, 10 kHz, signal alternatif amplifié 1000 x par le HV-amplificateur (Figure 3).
- Moduler le volume d'injection en modifiant l'amplitude de la tension appliquée.
Remarque: Des tensions plus élevées devraient permettre plus fluide à introduire les gouttelettes. Lors de nos tests, nous observons injection stable et cohérente à des tensions êtreentre 100 et 3000 V en utilisant des solutions d'injection de NaCl allant de 10 à 500 mM (Figure 4).
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Representative Results
Les images microscopiques prises sur le site de picoinjection montrent que l'électrification du fluide picoinjection suffit à déclencher l'injection (figure 2). Le volume injecté peut être commandée par la modulation de l'amplitude de la tension appliquée, avec des tensions plus élevées permettant des volumes d'injection plus élevées. On trace le volume d'injection par rapport à l'amplitude de la tension appliquée pendant trois molarités représentatifs de fluide d'injection dans la (figure 3). Pour démontrer la vitesse de notre méthode, nous avons injecté sélectivement gouttelettes passant le site d'injection en fonction de la présence ou absence d'un colorant fluorescent (Film 1). Les gouttes passent l'injecteur à 200 Hz, bien que des taux aussi élevés que 10 kHz sont possibles, en fonction des capacités du mécanisme de détection de goutte 3.
Nous attribuons la dépendance du volume d'injection de la tension appliquée sur le fait que lorsque les gouttelettes se rapprochent et passent le picoinjection orifice, l'épaisseur de la couche de séparation de l'huile à l'interface des gouttelettes à partir de la bosse au niveau du site d'injection diminue 8. La tension de seuil de l'instabilité d'une couche mince électro-induite est proportionnelle à l'épaisseur de cette couche 9,10. Par conséquent, lorsque les gouttelettes se rapprochent de la picoinjector, le moment de la coalescence dépend de l'amplitude du champ électrique. Tensions supérieures appliquées permettent de coalescence plus tôt entre la gouttelette et fluide d'injection, ce qui provoque de plus longues durées d'injection. Étant donné que le volume d'injection dépend de la durée d'injection, il dépend donc aussi de la tension appliquée.
Des solutions ioniques de molarité inférieurs atténuent plus facilement le signal appliqué et à réduire l'intensité du champ électrique au niveau du site d'injection par rapport à des solutions plus concentrées. Par conséquent, les fluides d'injection avec molarités inférieures des ions dissous nécessitent des tensions supérieures appliquées pour atteindre les mêmes volumes d'injection. Ce relationshanche est démontrée pour une gamme de molarités ioniques et des tensions appliquées à une carte thermique 2D (figure 4).
configuration de l'appareil de la figure 1. base. gouttelettes, transporteur de pétrole, et 1M de NaCl sont introduits dans le dispositif par des pompes à seringues. Les gouttelettes denses sont régulièrement espacés en utilisant la géométrie de base écoulement de mise au point. Comme les gouttelettes passent le site picoinjection, un champ électrique est généré en appliquant un signal en courant alternatif à une électrode insérée dans le réservoir de liquide de picoinjection (en rouge). Le champ électrique permet de coalescence entre les gouttelettes de passage et fluide picoinjection. Gouttelettes en amont du site d'injection sont protégés de champ électrique par Faraday Moat - un canal de 1 M de NaCl (une solution ionique à haute molarité devrait suffire) en contagir avec l'électrode de l'amplificateur haute tension (indiquée en noir) à la terre. Dimensions de l'appareil peuvent être redimensionnées en fonction des besoins; pour nos fins, nous avons conçu 30 x 30 um canaux (juste en amont du site d'injection) pour gouttelettes qui étaient de 50 m de diamètre.
Figure 2. Champ clair des images de microscopie du site picoinjection. En l'absence d'un champ électrique (A), les molécules tensioactives empêchent la coalescence au niveau du site d'injection et une frontière distincte est visible à l'interface de fluide de gouttelette / d'injection. Lors de l'application d'un signal de V AC 250 de 10 kHz, la limite disparaît et le réactif est injecté sous forme de gouttelettes les passages (B). Pour la visualisation, le liquide d'injection a été coloré avec 2 mg / ml de colorant bleu de bromophénol. Figure réédité from 6 avec la permission de la Royal Society of Chemistry (RSC)
Figure 3. Données démontrant la relation entre la tension appliquée et le volume de l'augmentation de la fraction (Vf) de gouttes après l'injection de (A) à 100 mM, (B) 50 mM, et (C) 25 mM (NaCl) de fluides d'injection. Champs électriques forts plus facilement se rompre les interfaces huile / eau et permettre l'injection sur une longueur plus importante des gouttelettes de passage - ce qui conduit à de plus grands volumes d'injection. Molarités plus élevés d'électrolytes dissous augmentent la conductivité de la solution d'injection, la production de forts champs électriques au niveau du site d'injection pour une tension donnée, ce qui conduit à une augmentation des volumes d'injection. Les barres d'erreur représentent 1 écart-type dans les deux sens pour> 1200 gouttes de l'échantillon à chaque point. Lignes reliant les points de données nene pas représenter une courbe en forme ou modèle théorique calculée. volume de la goutte est mesurée par un système de détection de fluorescence décrite dans 6. Figure re-publié de 6 avec la permission de la Royal Society of Chemistry (RSC). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
.. Figure 4 carte thermique indiquant le volume d'injection en fonction de la tension appliquée et de la molarité de NaCl dissous dans le fluide d'injection, le volume d'injection peut être réglée dans la plage de 0 à 36 pl avec une résolution de ~ 2,6 pl (4% Vf ) avec des incréments de 100 V du signal appliqué. Les plus grands volumes injectés ont été atteints à 3000 V et fluide 100 mM. Increasichamp électrique ng ci-dessus ce qui permet d'électromouillage, provoquant gouttes se forment spontanément à la picoinjector, nuire à l'efficacité de l'injection et de la cohérence. Flèches / tiques indiquent les points de données. Figure re-publié de 6 avec la permission de la Royal Society of Chemistry (RSC)
Le film 1. D'images à haute vitesse montrant la commutation sélective de la picoinjector. Gouttes contenant seulement IR-783 colorant fluorescent (2 mg / ml) sont injectés avec le réactif (NaCl 500 mM).
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Discussion
La relation entre le volume d'injection et la tension appliquée dépend de nombreux facteurs, notamment des dimensions de l'appareil, la longueur de la tuyauterie transportant le fluide de picoinjection au dispositif, la molarité de fluide de picoinjection, et la vitesse des gouttelettes lors de leur passage, ils injecteur. Pour cette raison, nous recommandons que la relation entre le volume / tension se caractérise avant chaque exécution de picoinjection en mesurant les volumes d'injection sur les bords des plages de travail de tension et de molarité. En outre, à des tensions plus élevées et injection de fluide molarités nous observons un phénomène dans lequel le fluide de picoinjection n'est plus maintenu en équilibre à l'orifice d'injection, mais les bourgeons hors et forme de petites gouttes dans le canal d'écoulement. Nous attribuons ce comportement à électromouillage, dans lequel la phase aqueuse mouille partiellement les canaux hydrophobes, l'amenant à ramper hors de l'orifice et dans le canal d'écoulement 11. Si cette instabilité se produit avant le choixvolume d'injection est obtenue, envisager de réduire le débit d'écoulement de gouttelettes lors de leur passage de l'injecteur et le rétrécissement du canal de gouttelettes pour augmenter la durée d'injection.
En plus de simplifier considérablement la fabrication de dispositifs, cette technique devrait également simplifier l'exécution des régimes de réaction plus complexes et combinatoires. Par exemple, l'exécution de plusieurs picoinjections avec notre technique ne nécessite que l'ajout de canaux de picoinjection sur les sites souhaités de l'injection. En revanche, les méthodes précédentes nécessitent des canaux de picoinjection et des électrodes métalliques d'accompagnement doivent être inclus dans tous les sites. En outre, les approches précédentes réguler le volume d'injection relativement lentement en faisant varier la pression d'injection ou de la vitesse de la gouttelette. Avec notre approche, le volume d'injection peut être réglée par voie électronique à des taux plus rapidement que les taux d'abandon les plus élevés rapportés (s'il vous plaît voir la divulgation). Cela permet l'exécution de tests plus complexes, avec des volumes d'injection adaptés à la condition spécifiquetions au sein de chaque micro-goutte. La normalisation et l'injection de réactifs dans les populations de gouttelettes polydispersées, par exemple, il faudrait détermination sur la volée de volumes d'injection.
Cette technique a été développée et démontrée à travailler dans les dispositifs utilisant picoinjection pour les réactions biologiques multi-étapes telles que numérique PCR et tests de génotypage 12. Cependant, avec peu ou pas de changement au protocole, la technique devrait être utile à tout ajout de l'expérimentateur nécessitant des réactifs de gouttelettes pour les applications biologiques, chimiques ou industriels - tant que le fluide d'injection contient espèces ioniques dissoutes.
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Disclosures
Nous ne comprenons pas pleinement le mécanisme exact derrière la relation entre la tension appliquée et le volume d'injection observé dans nos expériences. Les intérêts du laboratoire et domaines d'expertise sont pas bien adaptés pour la poursuite de cette question persistante. Nous encourageons ceux qui ont plus de physique et un sens aigu des techniques pour explorer ce phénomène.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le ministère de bioingénierie et Sciences thérapeutiques à l'UCSF, le California Institute for Quantitative Biosciences (QB3), et Bridging the Gap Prix de la Fondation de la famille Rogers.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml Luer-Lok™ syringes | BD Medical | 309628 | |
| LocTite UV-cured adhesive | Henkel | 35241 | |
| PE-2 tubing | Scientific Commodities | BB31695-PE/2 | |
| Novec HFE-7500 | 3M | 98-0212-2928-5 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | |
| 1.5 ml centrifuge tubes | Eppendorf | 22363531 | |
| BD Falcon 15 ml tube | BD Biosciences | 352097 | |
| Air pressure control pump | Control Air Inc. | We recommend one under the control of DAQ and control software | |
| Syringe pumps | New Era | Must be capable of holding 1 ml syringes and flowing at rates as low as 100 μl/hr | |
| HV-amplfier | Must be capable of 1,000x amplification of signals between 0.01 and 10 V | ||
| Plasma bonder/cleaner | Harrick Plasma | ||
| 3” silicon wafers | Sigma Aldrich | 647535 | |
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 with curing agent should be included | |
| SU-8 photoresist | MicroChem | Viscocity depends on device dimensions |
References
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