Picoinjection de Microfluidic Drops sem metal Eletrodos

Summary

Desenvolvemos uma técnica para picoinjecting gotas de microfluidos que não necessitam de eléctrodos metálicos. Como tal, os dispositivos que incorporem a nossa técnica é mais simples de fabricar e de utilizar.

Abstract

Métodos para picoinjecting reagentes em gotas microfluídicos existentes requerem eletrodos metálicos integrados ao chip microfluídico. A integração destes eletrodos acrescenta passos pesados ​​e propensos a erros no processo de fabricação do dispositivo. Desenvolvemos uma técnica que elimina a necessidade de eléctrodos metálicos durante picoinjection. Em vez disso, ele usa o próprio fluido de injeção como um eletrodo, uma vez que a maioria dos reagentes biológicos contêm eletrólitos dissolvidos e são condutores. Ao eliminar os eletrodos, que reduzem o tempo de fabricação de dispositivos e complexidade, e tornar os dispositivos mais robustos. Além disso, com a nossa abordagem, o volume de injecção depende da tensão aplicada à solução picoinjection; isso permite ajustar rapidamente o volume injectado por modulação da voltagem aplicada. Nós demonstramos que a nossa técnica é compatível com os reagentes que incorporam compostos biológicos comuns, incluindo tampões, enzimas e ácidos nucleicos.

Introduction

Em microfluídica baseada em gotículas, gotículas aquosas escala mícron são usados ​​como "tubos de ensaio" para reações biológicas. A vantagem para a realização de reacções nas gotículas é que cada gota usa somente um poucos pl de reagente e, com a microfluidos, as gotas podem ser formadas e processadas em taxas kilohertz ^1. Em conjunto, estas propriedades permitem que milhões de reacções com células individuais, moléculas de ácidos nucleicos, ou compostos a serem realizadas numa questão de minutos, com ul de material total.

Para usar gotas para aplicações como estas, são necessárias técnicas para a adição de volumes controlados de reagentes para as gotas; tais operações são análogas às pipetando em tubos de ensaio. Um método para realizar isto é electrocoalescence, em que uma gota de reagente é fundida com a queda alvo através da aplicação de um campo eléctrico. O campo eléctrico perturba o arranjo de moléculas de surfactante sobre os interfaces das gotas, inducing uma instabilidade de película fina e provocando a coalescência em emulsões que são de outra maneira estável ^2. Fusão induzidos electricamente é igualmente explorada no design do picoinjector, um dispositivo que injecta os reagentes em gotas à medida que fluem através de um canal pressurizado ^3. Para aplicar o campo eléctrico, dispositivos picoinjector utilizar eléctrodos metálicos, mas a integração de eléctrodos metálicos em chips de microfluidos é geralmente um processo complexo e propenso a erros como os fios de líquido da solda são facilmente comprometidos por bolhas de ar ou poeira e outros detritos no canal , bem como fraturas de estresse ou flexão durante a configuração do dispositivo.

Aqui é apresentado um método para realizar picoinjection sem a utilização de eléctrodos de metal, tornando o fabrico mais simples e mais robusto. Para acionar picoinjection, nós em vez usar o próprio fluido de injeção como um eletrodo, uma vez que a maioria dos reagentes biológicos contêm eletrólitos dissolvidos e são condutores. Nós também adicionar um "Faraday Moat "para proteger as regiões sensíveis do dispositivo e actuam como uma base universal (Figura 1). O fosso isola electricamente as gotículas a montante do local picoinjection proporcionando um solo, impedindo fusão gotícula não intencional. Um benefício adicional da nossa técnica é que o volume injectado nas gotas depende da magnitude da tensão aplicada, permitindo-lhe ser ajustado por meio do ajuste do sinal aplicado.

Nós fabricamos os nossos dispositivos de poli (dimetilsiloxano) (PDMS), utilizando técnicas de fotolitografia suave ^4,5. Nossa abordagem é compatível com dispositivos fabricados em outros materiais, como resinas, plásticos e epóxis. Os canais têm alturas e larguras de 30 mm, que são óptimas para o trabalho com gotas de 50 mm de diâmetro (65 pl). Nós introduzimos reagentes através de tubos polietileno (0.3/1.09 mm de diâmetro interno / externo) inserido portos criados durante fabricação de dispositivos com 0,50 milímetros socos biópsia, semelhantes aos métodos described anteriormente ^5. A composição exacta do fluido de injecção, depende da aplicação específica. O fluido só necessita conter electrólitos dissolvidos em concentrações suficientemente elevadas para produzir condutividade suficiente para o sinal eléctrico a ser transmitido para o picoinjector. No teste de bancada, verificou-se que as concentrações iónicas superiores a 10 mm deve ser suficiente ^6, embora este valor e condutividades fluido dependem das dimensões dos dispositivos específicos e magnitude da tensão aplicada.

Protocol

1. Projeto do dispositivo Dimensões e Topologias Baseado Experimental necessidades usando Computer Aided Design (CAD) Software

Nota: Selecção diâmetros dos canais de emulsão mais pequenas do que as das gotículas esféricas. Isso força as gotículas para um cilíndrico ou "salsicha" forma e permite picoinjection mais eficaz. Para os nossos propósitos, nós projetamos 30 x 30 mm canais de gotículas que eram de 50 m de diâmetro.

1. Local picoinjection Modelo (s) depois de os descritos por Abate et al. ³ com a excepção de que os canais para os eléctrodos de metal são removidas, como eles são desnecessários.
2. Adicionar canais para servir como o fosso de Faraday (Figura 1), que funcionam entre o local picoinjection (s) e a emulsão a montante de tal forma que eles protegem as gotículas do campo eléctrico.
   Nota: Este impede fusão não intencional.

2. Dispositivos Fabricar com SOFT fotolitoTécnicas ographic

1. Gerar uma máscara de transparência fotolitografia com base no arquivo CAD usando serviços comerciais existentes.
2. Com a foto-mascara, curar fotorresistente em bolachas de silício para produzir um dispositivo mestre, tal como descrito anteriormente ^4.
3. Despeje PDMS misturado com agente de cura (proporção 11:1) sobre o mestre dispositivo contido em um cinco centímetros de poliestireno placa de Petri.
4. Colocar o mestre com PDMS em um exsicador de vácuo durante cerca de 15 minutos para remover quaisquer bolhas de ar.
5. Curar o dispositivo de PDMS, colocando-o num forno de 95 ° C durante 1 hora. Em alternativa, o PDMS irá curar à RT após 24 horas.
6. Remova o dispositivo, cortando todo o perímetro com uma lâmina cirúrgica e descascando cuidadosamente o dispositivo com o mestre.
7. Soco entrada e saída buracos nas PDMS usando uma biópsia de 0,5 mm.
8. Ligar o dispositivo a uma lâmina de vidro usando um bonder plasma ^4.

3. Prepare uma pressão de arPump Control para pressurizar um reservatório contendo o Fluido

1. Modificar a saída da bomba de tal modo que as saídas de ar comprimido através de um comprimento de tubo de polietileno de 2,7 milímetros de diâmetro interno.
2. Construí-la de modo a que a tubagem termina numa seringa de ponta luer-lock ajustando a luz sobre o mamilo na parte traseira do luer.
3. Selar preenchendo o espaço entre os fios de luer-lock e a tubagem com epóxi.
4. Coloque uma agulha 27,5 G.

4. Preparar uma Monodisperse emulsão aquosa de Gotículas (água-em-óleo) em suspensão em um portador inerte fluorado óleo com 2% (p / p) dissolvido biocompatível Surfactante ⁷

Os reagentes específicos contidos nestas gotas dependem da aplicação

1. Em preparação para a reinjecção, carregar a emulsão para uma seringa de 1 ml com uma agulha G 27,5.
2. Fixe a seringa em uma bomba de seringa e orientar a bomba vertical (agulha para cima).
   NotaEsta orientação faz com que as gotículas de embalar numa camada acima do óleo veicular. Quando a bomba está a funcionar, as gotículas irá ser empurrado para fora da seringa na fracção de elevado volume da camada de óleo por baixo deles.

5. Prepare Reagentes para Introdução ao chip microfluídico

1. Perfurador três furos 0,5 milímetros para dentro da tampa de um tubo de centrífuga de 15 ml (um recipiente com uma tampa de rosca é suficiente) utilizando um perfurador de biópsia de agulha, ou broca.
2. Inserir um eléctrodo de arame de diâmetro de 0,5 mm e um cm de comprimento de tubagem de PE-2 ~ 20 através de dois dos furos de modo a que eles cheguem ao fundo do tubo.
3. No buraco restante, passe um ~ 2,5 centímetros de comprimento cm de tubos PE ~ 20 de tal forma que ele vai descansar acima do nível do fluido.
4. Vede todas as aberturas na parte superior da tampa com epóxi UV-curado.
5. Encha o tubo com o fluido picoinjection e parafuso na tampa.
6. Ligue a saída a partir da bomba de controle de pressão de ar com o comprimento mais curto de tubagem por inserçãoção da agulha para dentro do lúmen. A agulha deve caber confortavelmente.
7. Encher uma seringa de 1 ml com 1 M de NaCl para servir como o fosso de Faraday.
8. Conecte um G agulha 27,5 e segura a seringa em uma bomba de seringa.
9. Encha uma outra seringa de 1 ml com óleo do portador / espaçador, conecte uma agulha G 27,5, e fixá-lo em uma bomba de seringa.

6. Prepare o dispositivo micro para Picoinjection

1. Ligar o tubo de saída (mais de comprimento) a partir do recipiente de fluido de injecção para a porta de entrada do fluido picoinjection no chip de microfluidos.
2. Ligar a seringa contendo a 1 M de NaCl para a porta de entrada para o fosso de Faraday no chip de microfluidos com um comprimento de tubagem de PE.
3. Ligar a seringa contendo o óleo do portador para a porta de entrada do chip de microfluidos com um comprimento de tubagem de PE.
4. Inserir tubos PE na porta de saída de emulsão sobre o chip de microfluidos. A tubulação deve terminar em um reservatório de recolha de emulsão, nemmalmente um tubo de centrífuga de 1,5 ml.
5. Insira o tubo PE na porta de saída para o Faraday Moat no chip microfluídico. A tubulação deve terminar em um não-condutor e recipiente isolado eletricamente para evitar um curto-circuito.
6. Ligue a saída do amplificador de alta voltagem (HV) através de jacaré ao eléctrodo de metal submergido no fluido picoinjection.
7. Conecte o eletrodo de aterramento do amplificador HV via jacaré para o metal da agulha da seringa contendo o 1 M NaCl.

7. Infundir Reagentes para Microfluidic Chip

1. Introduzir a 1 M de NaCl (Moat Faraday) para o dispositivo, a uma taxa de 100 il / hr.
2. Introduzir a emulsão de gotas e transportadora de petróleo a preços adequados para as dimensões do dispositivo. Para o nosso dispositivo de demonstração, apresentamos as gotas de óleo e de 200 e 400 mL / h, respectivamente. As taxas de fluxo deve permitir que as gotas para passar o picoinjector em intervalos regulares separadaspor um intervalo de óleo do portador.
3. Ajustar a pressão aplicada ao fluido picoinjection tal que a pressão do fluido no orifício picoinjection está em equilíbrio mecânico com o canal de gotícula.
   Nota: A esta pressão (a pressão de Laplace), o fluido de injecção deve inchar dentro do canal de gotículas sem brotando e formando as suas gotas (Figura 2). A estas taxas de fluxo acima descritas, que se aplica uma pressão de ~ 13 psi para o fluido de injecção para atingir o equilíbrio no local da injecção.

8. Comece Picoinjection

1. Como as gotas passam pelo orifício de injecção, aplica um 0-10 V, 10 kHz, o sinal AC amplificada 1000 x por HV-amplificador (Figura 3).
2. Modular o volume de injecção, alterando a amplitude da tensão aplicada.
   Nota: As tensões mais elevadas deve permitir mais fluido a ser introduzido para as gotículas. Em nossos testes, observamos injeção estável e consistente com tensões serentre 100 e 3000 V usando soluções de injecção de NaCl variando 10-500 mM (Figura 4).

Representative Results

As imagens microscópicas feita no local picoinjection mostram que a electrificação do fluido picoinjection é suficiente para desencadear a injecção (Figura 2). O volume injectado pode ser controlada por meio da modulação da amplitude da voltagem aplicada, com tensões mais elevadas que permitam a volumes de injecção mais elevadas. Marcamos o volume de injecção contra a magnitude da voltagem aplicada durante três molaridades representativos de fluido de injecção na (Figura 3). Para demonstrar o nosso método, a velocidade, que injectado selectivamente gotículas que passam no local da injecção, dependendo da presença ou ausência de um corante fluorescente (Filme 1). Drops passar o injetor a 200 Hz, embora sejam possíveis taxas tão elevadas quanto 10 kHz, dependendo das capacidades do mecanismo de detecção de gota ^3.

Atribuímos a dependência do volume de injecção sobre a tensão aplicada ao facto de que à medida que as gotículas se aproximam e passam a picoinjectorifício de iões, a espessura da camada de óleo que separa a interface de gotículas a partir da protuberância no local da injecção diminui ^8. A tensão de limiar de uma instabilidade de película fina electricamente induzido é proporcional à espessura desta camada de ^9,10. Portanto, como as gotas de abordar o picoinjector, o momento de coalescência depende da magnitude do campo eléctrico. Voltagens aplicadas mais elevada para permitir a coalescência anteriormente entre a gota e a injecção de fluido, fazendo com que as durações mais longas de injecção. Uma vez que o volume de injecção depende da duração da injecção, é, portanto, também depende da tensão aplicada.

Soluções iónicas Molarity inferiores mais prontamente atenuar o sinal aplicado e reduzir a intensidade do campo eléctrico no local da injecção em comparação com as soluções mais concentradas. Consequentemente, os fluidos de injeção com molaridades mais baixos de íons dissolvidos exigem tensões superiores aplicados para atingir os mesmos volumes de injeção. Este relaçõesquadril é demonstrado por um intervalo de molaridades iónicos e aplicadas tensões num heatmap 2D (Figura 4).

Figura 1. Básico de configuração do dispositivo. Gotas, transportadora de petróleo e 1M NaCl são introduzidos para o dispositivo via bombas de seringa. As gotículas densamente são uniformemente espaçados usando geometria básica fluxo foco. À medida que as gotículas de passar o local picoinjection, um campo eléctrico gerado pela aplicação de um sinal AC a um eléctrodo inserido no recipiente de fluido picoinjection (indicados a vermelho). O campo elétrico permite a coalescência entre as gotas de passagem e fluido picoinjection. Gotas a montante do local de injecção são protegidos a partir do campo eléctrico pela Faraday Moat - um canal de NaCl 1 M (uma solução iónica de alta molaridade deve bastar) em contagir com o eletrodo de aterramento do amplificador HV (indicado em preto). Dimensões do dispositivo pode ser dimensionada conforme a necessidade; para os nossos propósitos, nós projetamos 30 x 30 mm canais (apenas a montante do local da injecção) de gotículas que eram de 50 m de diâmetro.

Figura 2. Imagens de microscopia de campo brilhante do local picoinjection. Na ausência de um campo eléctrico (A), as moléculas do surfactante evitar a coalescência no local da injecção e um limite distinto é visível na interface fluido gotícula / injecção. Após a aplicação de um sinal de CA de 250 V a 10 kHz, o limite desaparece e reagente é injectado como as passagens de gotículas (B). Para a visualização, o fluido de injecção ter sido colorido com 2 mg / ml de corante azul de bromofenol. Figura re-publicado from ^6, com a permissão da The Royal Society of Chemistry (RSC)

Figura 3. Dados demonstrando a relação entre a tensão aplicada e aumento de volume fracção (Vf) de gotas após a injecção para (A) de 100 mM, (B) 50 mM, e (C) a 25 mM (NaCl), fluidos de injecção. Campos eléctricos mais fortes facilmente romper nas interfaces óleo / água e permite que a injecção ao longo de um comprimento maior de gotículas de passagem - o que leva a maiores volumes de injecção. Molaridades mais elevados de eletrólitos dissolvidos aumentar a condutividade da solução injectável, produzindo campos elétricos fortes no local da injeção para uma dada tensão, levando ao aumento do volume de injeção. As barras de erro representam um desvio padrão em qualquer direção para> 1.200 gotas amostrados em cada ponto. Linhas que ligam os pontos de dados fazernão representar qualquer curva-fit ou modelo teórico calculado. O volume da gota é medido por um sistema de detecção de fluorescência descrito no ^6. Forma re-publicado de ⁶ com a permissão da The Royal Society of Chemistry (RSC). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

.. Mapa Calor Figura 4, que mostra o volume de injecção como uma função da tensão aplicada e a molaridade de NaCl dissolvido no fluido de injecção O volume de injecção pode ser ajustado na gama de 0-36 pl com uma resolução de 2,6 pl ~ (4% Vf ) com incrementos de 100 V do sinal aplicado. Os maiores volumes injectados foram realizados a 3000 V e fluido 100 mM. Increasing campo elétrico acima desta permite electrowetting, fazendo com que gotas para formar espontaneamente no picoinjector, afetando negativamente a eficácia da injeção e consistência. Setas / carrapatos indicam pontos de dados. Figura re-publicado de ⁶ com a permissão da The Royal Society of Chemistry (RSC)

Filme 1. Alta velocidade metragem demonstrando comutação selectiva do picoinjector. Apenas gotas contendo IR-783 corante fluorescente (2 mg / ml) foram injectados com o reagente (500 mM de NaCl).

Discussion

A relação entre o volume de injecção e a tensão aplicada dependem de muitos factores, incluindo as dimensões do dispositivo, o comprimento do tubo que transporta o fluido picoinjection para o dispositivo, a molaridade de fluido picoinjection, e a velocidade das gotas, quando passam eles injector. Por este motivo, recomendamos que a relação de volume / tensão ser caracterizado antes de cada execução de picoinjection medindo volumes de injecção nas bordas das faixas de trabalho da tensão e molaridade. Além disso, com tensões mais elevadas e de injeção de fluidos molaridades observamos um fenômeno no qual o fluido picoinjection não é mais realizada em equilíbrio no orifício de injeção, mas em vez disso gomos fora e forma pequenas gotas no canal de fluxo. Atribuímos este comportamento de Electrowetting, em que a fase aquosa molha parcialmente os canais hidrofóbicos, fazendo com que ele se arrastar para fora do orifício e para dentro do canal de escoamento ^11. Se esta instabilidade ocorre antes do desejadovolume de injeção é alcançado, pense em reduzir a taxa de fluxo de gotas que passam o injetor e estreitando o canal de gota para aumentar a duração da injeção.

Em adição a simplificação marcadamente a fabricação de dispositivos, esta técnica também deve simplificar a execução dos regimes de reacção mais complexos e combinatórios. Por exemplo, a execução de vários picoinjections com a nossa técnica requer apenas a adição de canais picoinjection nos locais desejados de injeção. Por contraste, os métodos anteriores requerem canais picoinjection e eléctrodos metálicos de acompanhamento para ser incluído em todos os locais. Além disso, as abordagens anteriores regular o volume de injecção de forma relativamente lenta, variando a pressão de injecção ou a velocidade da gota. Com a nossa abordagem, o volume de injeção pode ser ajustado eletronicamente a taxas mais rápido do que as mais altas taxas de queda relatados (ver divulgação). Isso permite a execução de ensaios mais complexos, com volume de injeção adaptados à condição específicações de cada microgotas. Normalização e injeção de reagentes em populações de gotas polidispersas, por exemplo, exigiria determinação on-the-fly de volumes de injeção.

Esta técnica tem sido desenvolvida e demonstrou funcionar em dispositivos que utilizam picoinjection para multi-passo reacções biológicas, tais como a PCR digital e genotipagem ^12. No entanto, com pouca ou nenhuma alteração no protocolo, a técnica deve ser de uso para qualquer adição experimentador necessitando de reagentes para as gotas para quaisquer aplicações biológicas, químicas ou industriais - desde que o fluido de injeção conter espécies iônicas dissolvidas.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Luer-Lok™ syringes	BD Medical	309628
LocTite UV-cured adhesive	Henkel	35241
PE-2 tubing	Scientific Commodities	BB31695-PE/2
Novec HFE-7500	3M	98-0212-2928-5
NaCl	Sigma Aldrich	S9888
1.5 ml centrifuge tubes	Eppendorf	22363531
BD Falcon 15 ml tube	BD Biosciences	352097
Air pressure control pump	Control Air Inc.		We recommend one under the control of DAQ and control software
Syringe pumps	New Era		Must be capable of holding 1 ml syringes and flowing at rates as low as 100 μl/hr
HV-amplfier			Must be capable of 1,000x amplification of signals between 0.01 and 10 V
Plasma bonder/cleaner	Harrick Plasma
3” silicon wafers	Sigma Aldrich	647535
PDMS	Dow Corning		Sylgard 184 with curing agent should be included
SU-8 photoresist	MicroChem		Viscocity depends on device dimensions