Summary
Мы разработали методику для picoinjecting микрофлюидных капли, которые не требуют металлические электроды. Таким образом, устройства, содержащие наш метод проще в изготовлении и в использовании.
Abstract
Существующие методы picoinjecting реагенты в микрофлюидных капель требуют металлические электроды, интегрированные в микрофлюидный чип. Интеграция этих электродов добавляет громоздких и подверженных ошибкам шаги для процесса изготовления устройства. Мы разработали метод, который устраняет потребности в металлических электродов во picoinjection. Вместо этого он использует саму нагнетательной текучей среды в качестве электрода, так как большинство биологические реагенты содержат растворенные электролиты и являются токопроводящими. Устраняя электроды, мы уменьшаем устройства время изготовления и сложность, и сделать эти устройства более надежными. Кроме того, нашему подходу, объем впрыска зависит от напряжения, приложенного к picoinjection раствора; это позволяет нам быстро отрегулировать громкость вводят путем модуляции приложенное напряжение. Показано, что наш метод совместим с реагентов, включающих общие биологические соединения, в том числе буферы, ферментов и нуклеиновых кислот.
Introduction
В капель на основе микрофлюидики, микронных водные капельки используются в качестве «пробирки» для биологических реакций. Преимущество выполнения реакции в мельчайших капелек, что каждая капля использует только несколько пл реагента и, с микрофлюидики, капли могут образовываться и обрабатываются на килогерц ставок 1. В совокупности эти свойства позволяют миллионы реакций с отдельных клеток, молекул нуклеиновых кислот, или соединений, выполненных в течение нескольких минут с мкл общего объема материала.
Для использования капель для приложений, таких как эти, методы необходимы для добавления контролируемых объемы реагентов для капель; такие операции аналогичны пипетки в пробирки. Одним из способов достижения этого является электрокоагуляции, в котором капли реагента объединены с целью снижения на приложения электрического поля. Электрическое поле разрушает расположение молекул ПАВ на границах раздела капель, индucing на нестабильность тонкопленочной и запуск слияния в эмульсии, которые в противном случае стабильная 2. Электрически-индуцированного слияния также использованы в конструкции picoinjector, устройство, которое впрыскивает реагентов в капли, как они текут мимо под давлением канала 3. Чтобы применить электрическое поле, picoinjector устройства используют металлические электроды, но интеграция металлических электродов в микрожидкостных чипов часто сложный и подверженный ошибкам процесс, как в жидкой провода припоя легко скомпрометированы воздушных пузырьков или пыли и другого мусора в канале , а также переломы от стресса или изгиба во время установки устройства.
Здесь мы представляем метод для выполнения picoinjection без использования металлических электродов, что делает изготовление проще и надежнее. Для запуска picoinjection, мы вместо этого использовать саму впрыска жидкости в качестве электрода, так как большинство биологических реагенты содержат растворенные электролиты и являются токопроводящими. Мы также добавить "Фарадея Моат ", чтобы оградить чувствительные регионы устройства и выступать в качестве универсального грунта (рис. 1). Ров электрически изолирует капли вверх по течению от picoinjection сайте, предоставляя землю, предотвращения случайного слияние капель. Дополнительным преимуществом нашей техники является то, что объем вводят в капель зависит от величины приложенного напряжения, что позволяет регулировать путем настройки применен сигнал.
Мы изготовления наши устройства в поли (диметилсилоксан) (PDMS) с использованием мягких методов фотолитографии 4,5. Наш подход совместим с устройствами, изготовленных из других материалов, например, смол, пластмасс и эпоксидных смол. Каналы имеют высоту и ширину 30 мкм, которые являются оптимальными для работы с капель 50 мкм в диаметре (65 PL). Введем реагентов через полиэтиленовой трубки (0.3/1.09 мм внутренний / наружный диаметр), вставленной в портах, созданных в процессе изготовления устройства с 0,50 мм биопсии ударов руками, похожими на методы DescrIBED ранее 5. Точное состав впрыска жидкости зависит от конкретного применения. Жидкость нужно только содержать растворенные электролиты в концентрации, достаточно высоких, чтобы получить достаточную проводимость для электрического сигнала, передаваемого на picoinjector. В стендовых испытаний, мы обнаружили, что ионные концентрации превышает 10 мм должно хватить 6, хотя это значение и жидкости проводимости зависит от конкретных размеров устройств и величины приложенного напряжения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Дизайн Размеры устройства и топологии на основе экспериментальных потребностей Использование системы автоматизированного проектирования (САПР)
Примечание: Выбор диаметра эмульсии канала меньше, чем у сферических капелек. Это заставляет капли в цилиндрической или "колбасы" формы и позволяет более эффективно picoinjection. Для наших целей, мы разработали 30 х 30 мкм каналы для капель, которые были 50 мкм в диаметре.
- Модель picoinjection сайт (ы) после те, которые описаны Абате и соавт. 3 за исключением того, каналы для металлических электродов удаляются, так как они не нужны.
- Добавить каналы в качестве Фарадея Рву (рис. 1), которые выполняются между picoinjection сайт (ы) и вышестоящим эмульсии, так что они оградить капли от электрического поля.
Примечание: Это предотвращает непреднамеренное слияние.
2. Изготовления устройства, использующие Soft Photolithographic методы
- Создать маску прозрачности фотолитографии на основе файла CAD с использованием существующих коммерческих услуг.
- С фотошаблона, лечение фоторезиста на кремниевых пластинах, чтобы произвести ведущее устройство, как описано выше 4.
- Налейте PDMS смешивается с отвердителя (соотношение 11:01) над ведущее устройство, содержащейся в 5 см полистирола чашки Петри.
- Поместите мастер с PDMS в вакуумном эксикаторе в течение примерно 15 минут, чтобы удалить пузырьки воздуха.
- Лечение устройство PDMS, поместив его в печь 95 ° C в течение 1 часа. Альтернативно, PDMS будут лечить при комнатной температуре через 24 часа.
- Извлеките устройство путем разрезания по периметру с хирургическим скальпелем и тщательно пилинг устройство от мастера.
- Удар входе и выходе отверстия в PDMS с помощью 0,5 мм биопсии удар.
- Бонд устройство к предметное стекло микроскопа с использованием плазмы связующие вещества 4.
3. Подготовьте давлении воздухаУправление насосом для создания давления резервуар, содержащий жидкость
- Изменение производительности насоса, такие, что сжатый воздух выходит через длиной 2,7 мм внутренний диаметр полиэтиленовой трубы.
- Построить его так, чтобы трубка заканчивается в шприц наконечником Luer-Lock путем установки просвет над соском на задней части Luer-Lock.
- Уплотнение путем заполнения пространства между Luer-Lock нитей и трубки с эпоксидной смолой.
- Прикрепите 27,5 г иглу.
4. Подготовка монодисперсных эмульсии водной (вода-в-масле) капелек суспендируют в инертном Фторсодержащая Carrier масло с 2% (вес / вес), растворенную биосовместимые поверхностно-7
Конкретные реагенты, содержащиеся в этих капель зависит от применения
- В рамках подготовки к обратной закачки, загрузите эмульсии в 1 мл шприц с 27,5 г иглы.
- Закрепите шприц в шприцевой насос и ориентировать насос вертикально (игла вверх).
Примечание: Эта ориентация вызывает капельки, чтобы упаковать в слое над перевозчиком нефти. Когда насос запущен, капли будут вытеснены из шприца при высоких объемной доли в нефтяной слой под ними.
5. Подготовка реагентов для Введение в микрофлюидный чип
- Удар три отверстия 0,5 мм в крышке 15 мл трубки центрифуги (любой контейнер с завинчивающейся крышкой хватит) с помощью биопсии удар, иглы или дрель.
- Вставьте 0,5 мм Диаметр проволочного электрода и ~ 20 см длины ПЭ-2 трубки через два отверстия так, чтобы они достигнут дна трубки.
- В остальных отверстие, поток А ~ 2,5 см в ~ 20 см длины PE труб такова, что она будет отдыхать выше уровня жидкости.
- Уплотнение отверстия на верхней части крышки с УФ-отвержденной эпоксидной смолой.
- Заполните трубку с picoinjection жидкости и винта на крышке.
- Подключите выход из управления воздушным давлением насоса к меньшей длины насосно-компрессорных труб по вставкойING иглу в просвет. Игла должна плотно прилегать.
- Заполните 1 мл шприц с 1 М NaCl в качестве Фарадея Рву.
- Подключите 27,5 г иглу и закрепите шприц в шприцевой насос.
- Заполните другой 1 мл шприц с носителем / спейсерной масла, подключить 27,5 г иглу, и закрепите его в шприцевой насос.
6. Подготовка микрожидкостных устройств для Picoinjection
- Подключение выходной трубопровод (больше длина) из контейнера впрыска жидкости к впускному отверстию picoinjection жидкости на микрофлюидный чип.
- Подключение шприц, содержащий 1 М NaCl с впускным отверстием для Фарадея ров на микрофлюидный чип с длиной PE труб.
- Подключение шприц, содержащий масло-носитель с впускным отверстием микрофлюидный чип с длиной PE труб.
- Вставка PE труб в выходной порт эмульсии на микрофлюидный чип. Трубопроводы должны прекратить в коллекции эмульсия судна, ниФормально 1,5 мл центрифужные пробирки.
- Вставьте PE труб в выходной порт для Фарадея Рву на микрофлюидный чип. Трубопроводы должны прекратить в непроводящих и электрически изолированного контейнера, чтобы предотвратить короткое замыкание.
- Соедините выход высокого напряжения (ВН) усилителя через крокодил к металлическим электродом погруженной в picoinjection жидкости.
- Подключение заземленного электрода усилителя HV через крокодил с металлом иглы шприца, содержащего 1 М NaCl.
7. Infuse Реагенты в микрофлюидный чип
- Введем 1 М NaCl (Фарадея) Moat к устройству со скоростью 100 мкл / час.
- Введем капель эмульсии и масла-носителя по ставкам, пригодных для размеров устройств. Для нашего демо-устройства, введем капли и масло на 200 и 400 мкл / час, соответственно. Скорости потока должны позволить капли пройти picoinjector через регулярные промежутки времени, разделенныхщелью несущего масла.
- Регулировка давление, приложенное к жидкости picoinjection такой, что давление жидкости в picoinjection отверстие находится в механическом равновесии с каплями канала.
Примечание: При таком давлении (давление Лапласа), инъекции жидкости должен выпирать в капли канал без бутонизации прочь и формирования собственных капель (рис. 2). На этих скоростях потока, описанных выше, применим давление ~ 13 фунтов на квадратный дюйм в нагнетательной жидкости для достижения равновесия в месте инъекции.
8. Начните Picoinjection
- Как капли пройти впрыска отверстие, нанесите 0-10 В, 10 кГц, сигнал переменного тока усиливается 1000 х от ВЛ-усилителя (рис. 3).
- Модулируйте объем впрыска, изменяя амплитуду приложенного напряжения.
Примечание: Более высокое напряжение должно позволить получить дополнительные жидкости, которые вносятся в каплях. В нашем тестировании мы наблюдаем стабильную и последовательную инъекции при напряжениях бытьмежду 100 и 3000 В с использованием инъекционные растворы NaCl, начиная от 10-500 мм (рис. 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Микроскопические изображения принято на picoinjection сайте показывают, что электрификация picoinjection жидкости достаточно, чтобы вызвать инъекции (рис. 2). Вводимый объем можно управлять с помощью модуляции амплитуды приложенного напряжения, с более высоких напряжениях, позволяющих более высоких объемов закачки. Мы построить объем впрыска по сравнению с величиной приложенного напряжения в течение трех представительных молярности инжекционного жидкости в (рис. 3). Чтобы продемонстрировать наш метод скорость, мы избирательно вводят капли проходящие место инъекции в зависимости от наличия или отсутствия флуоресцентного красителя (Movie 1). Капли пройти инжектор на 200 Гц, хотя ставки выше, чем 10 кГц возможны, в зависимости от возможностей механизма обнаружения капель 3.
Мы отнести зависимость объема впрыска от приложенного напряжения с тем, что в качестве капельки подходить и передать picoinjectион отверстие, толщина слоя масла разделяющей поверхности раздела капли от выпуклость в месте инъекции уменьшается 8. Пороговое напряжение для электрически индуцированной нестабильности тонкопленочной пропорциональна толщине этого слоя 9,10. Поэтому, как капли подойти к picoinjector, момент слияния зависит от величины электрического поля. Высшее приложенных напряжений позволяют ранее слияния между каплей и впрыска жидкости, в результате чего более длительные инъекции. Поскольку объем впрыска зависит от длительности впрыска, поэтому оно также зависит от приложенного напряжения.
Нижние молярность ионных растворов более легко ослабить приложенного сигнала и уменьшить напряженность электрического поля в месте инъекции по сравнению с более концентрированными растворами. Следовательно, инъекции жидкости с более низкими молярности растворенных ионов требуют выше приложенных напряжений для достижения тех же объемов закачки. Это отношенияхип демонстрируется для ряда ионных молярности и приложенных напряжений в 2D Тепловая карта (рис. 4).
Рисунок 1. Основные настройки устройства. Капельки, масло-носитель, и 1М NaCl вводятся в устройство через шприцевые насосы. Тесные капли распределены равномерно, используя базовую геометрию потока фокусировки. Как капельки пройти picoinjection сайт, электрическое поле, применяя сигнала переменного тока на электрод вставляется в контейнере picoinjection жидкости (указано красным цветом). Электрическое поле позволяет сращивания проходящих капель и picoinjection жидкости. Капельки вверх по течению от места инъекции защищены от электрического поля на Фарадея Рву - канал 1 М NaCl (любой высокой молярность ионный раствор должно хватить) в контдействовать с заземляющим электродом усилителя HV (указанной в черный). Размеры устройства можно масштабировать по мере необходимости; для наших целей, мы разработали 30 х 30 мкм каналов (чуть выше по течению месте инъекции) для капель, которые были 50 мкм в диаметре.
Рисунок 2. Яркие микроскопии изображений поле picoinjection сайта. При отсутствии электрического поля (A), молекулы ПАВ предотвратить слипание в месте инъекции и четкая граница видна на границе капли / впрыска жидкости. При приложении V 10 кГц сигнала переменного тока 250, граница исчезает, и реагент инжектируют как капли проходов (B). Для визуализации, нагнетаемая жидкость была окрашена 2 мг / мл бромфенолового синего красителя. Рисунок переизданы птом 6 с разрешения Королевского химического общества (RSC)
Рисунок 3. Данные демонстрируют соотношение между приложенным напряжением и объемной увеличение фракции (VF) капель после инъекции для (А) 100 мм, (B) 50 мМ, и (C) 25 мМ (NaCl) инъекции жидкостей. Более сильные электрические поля более легко привести к разрыву масло / вода интерфейсы и позволяют инъекции по большей длины проходящих капель - это приводит к большим объемам инъекций. Более высокие молярности растворенных электролитов увеличить проводимость раствора для инъекций, производя сильные электрические поля в месте инъекции для данного напряжения, что приводит к увеличению объемов закачки. Планки погрешностей представляют 1 стандартное отклонение в ту или иную сторону для> 1200 капель отобранных в каждой точке. Линии, соединяющие точки данных делатьне представляют никакой кривой-FIT или рассчитанное теоретическую модель. Объем капли измеряется с помощью системы обнаружения флуоресценции, описанной в 6. Фигура повторно опубликована с 6 с разрешения Королевского химического общества (RSC). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
.. Рисунок 4 тепла карта, показывающая объем впрыска в зависимости от приложенного напряжения и молярности растворенного NaCl в нагнетательной жидкости Объем впрыска может регулироваться в диапазоне от 0 - 36 мкл с разрешением ~ 2,6 мкл (4% Vf ) с шагом 100В приложенного сигнала. Крупнейшие введенные объемы были достигнуты в 3000 V и 100 мм жидкости. Increasiнг электрического поля выше это позволяет электросмачивания, в результате чего капли спонтанно образуют на picoinjector, что отрицательно сказывается впрыска эффективность и согласованность. Стрелки / клещей указывают точки данных. Рисунок повторно опубликована с 6 с разрешения Королевского химического общества (RSC)
Фильм 1. Высокая скорость кадры демонстрируют селективное переключение picoinjector. Только капли, содержащие IR-783 флуоресцентный краситель (2 мг / мл) вводили с реагентом (500 мМ NaCl).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Отношения между объемом впрыска и приложенного напряжения зависит от многих факторов, включая размеры устройств, длине трубки, несущей picoinjection жидкость на устройство, молярности picoinjection жидкости и скорости капель, поскольку они проходят они инжектор. По этой причине мы рекомендуем, что отношения объем / напряжение охарактеризовать перед каждым тиражом picoinjection путем измерения объемов закачки по краям рабочих диапазонов напряжения и молярностью. Кроме того, при более высоких напряжениях и нагнетательных молярности жидкости мы наблюдаем явление, в котором picoinjection жидкость больше не удерживается в равновесии в месте инъекции отверстие, но вместо почки прочь и образует небольшие капли в проточном канале. Мы объясняем это поведение электросмачивания, в котором водную фазу частично смачивает гидрофобные каналы, заставляя его выползти из отверстия и в проточном канале 11. Если эта неустойчивость возникает до желаемогоОбъем впрыска достигается, рассмотреть вопрос о сокращении темпов потока капель, поскольку они проходят инжектор и сужения капель канал, чтобы увеличить время впрыска.
Кроме того, заметно упорядочения изготовление устройств, этот метод должен также упростить выполнение более сложных и комбинаторных реакции режимов. Например, выполнение нескольких picoinjections с нашей техникой требуется только добавление picoinjection каналов в нужных местах инъекций. В противоположность этому, предыдущие методы требуют picoinjection каналы и сопровождающий металлические электроды, которые будут включены на всех сайтах. Кроме того, прежние подходы регулировать объем впрыска относительно медленно, изменяя давление впрыска или скорости капель. С нашего подхода, объем впрыска можно регулировать в электронном виде по ставкам быстрее, чем самые высокие показатели падения сообщили (см. раскрытие). Это позволяет выполнение более сложных анализов, с объемов закачки с учетом конкретных услоTIONS внутри каждого микрокапле. Нормализация и впрыска реагентов в полидисперсных капель популяций, например, потребует на лету определение объемов инъекций.
Эта техника была разработана и продемонстрирована на работу в устройствах, использующих picoinjection для многоступенчатых биологических реакций, таких как цифровой ПЦР и генотипирования анализов 12. Тем не менее, практически без изменений к протоколу, техника должна быть полезной для любого экспериментатора требуя добавления реагентов в каплях для любых биологических, химических или промышленных приложений - при условии, что инъекции жидкости содержат растворенные ионные разновидности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Мы не до конца понимают точную физическую механизм за отношений между приложенным напряжением и объемом впрыска наблюдается в наших экспериментах. Интересы этой лаборатории и соответствующие области знаний не очень хорошо подходит для реализации этой затяжной вопрос. Мы призываем тех, с более физики и инженерных сообразительности, чтобы исследовать это явление.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Департаментом биоинженерии и терапевтических наук в UCSF, института Калифорнии для количественного Biosciences (QB3), а также преодоление премию Gap от Роджерс Семейства.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml Luer-Lok™ syringes | BD Medical | 309628 | |
| LocTite UV-cured adhesive | Henkel | 35241 | |
| PE-2 tubing | Scientific Commodities | BB31695-PE/2 | |
| Novec HFE-7500 | 3M | 98-0212-2928-5 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | |
| 1.5 ml centrifuge tubes | Eppendorf | 22363531 | |
| BD Falcon 15 ml tube | BD Biosciences | 352097 | |
| Air pressure control pump | Control Air Inc. | We recommend one under the control of DAQ and control software | |
| Syringe pumps | New Era | Must be capable of holding 1 ml syringes and flowing at rates as low as 100 μl/hr | |
| HV-amplfier | Must be capable of 1,000x amplification of signals between 0.01 and 10 V | ||
| Plasma bonder/cleaner | Harrick Plasma | ||
| 3” silicon wafers | Sigma Aldrich | 647535 | |
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 with curing agent should be included | |
| SU-8 photoresist | MicroChem | Viscocity depends on device dimensions |
References
- Kritikou, E. It's cheaper in the Picolab. Nat. Rev. Genet. 6 (9), (2005).
- Ahn, K., Agresti, J., Chong, H., Marquez, M., Weitz, D. A. Electrocoalescence of drops synchronized by size-dependent flow in microfluidic channels. Appl. Phys. Lett. 88 (26), (2006).
- Abate, A. R., Hung, T., Mary, P., Agresti, J. J., Weitz, D. A. High-throughput injection with microfluidics using picoinjectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 107, 19163-19166 (2010).
- Harris, J., et al. Fabrication of a microfluidic device for the compartmentalization of neuron soma and axons. J. Vis. Exp. (7), (2007).
- Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J., Whitesides, G. M. Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Anal. Chem. 70 (23), 4974-4984 (1998).
- O'Donovan, B., Eastburn, D. J., Abate, A. R. Electrode-free picoinjection of microfluidic drops. Lab on a Chip. 12 (20), 4029-4032 (2012).
- Holtze, C., et al. Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions. Lab on a Chip. 8 (10), 1632-1639 (2008).
- Chung, C., Lee, M., Char, K., Ahn, K., Lee, S. Droplet dynamics passing through obstructions in confined microchannel flow. Microfluid. Nanofluid. 9, 1151-1163 (2010).
- Herminghaus, S. Dynamical instability of thin liquid films between conducting media. Phys. Rev. Lett. 83 (12), 2359-2361 (1999).
- Priest, C., Herminghaus, S., Seemann, R. Controlled electrocoalescence in microfluidics: Targeting a single lamella. Appl. Phys. Lett. 89 (13), 134101-134103 (2006).
- Florent, M., Siva, A. V., Hao, G., Dirk, E., Frieder, M. Electrowetting-controlled droplet generation in a microfluidic flow-focusing device. J. Phys: Condens. Matter. 19 (46), (2007).
- Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Picoinjection enables digital detection of RNA with droplet rt-PCR. PLoS ONE. 8 (4), (2013).
