Picoinjection di Microfluidic Gocce senza elettrodi in metallo

Summary

Abbiamo sviluppato una tecnica per picoinjecting gocce microfluidici che non richiedono elettrodi metallici. Come tale, dispositivi che incorporano la nostra tecnica sono più semplici da fabbricare e da usare.

Abstract

Metodi esistenti per picoinjecting reagenti in gocce microfluidica richiedono elettrodi metallici integrati nel chip microfluidica. L'integrazione di questi elettrodi aggiunge passaggi ingombranti e soggetti a errori del processo di fabbricazione del dispositivo. Abbiamo sviluppato una tecnica che elimina le necessità di elettrodi metallici durante picoinjection. Invece, utilizza il fluido di iniezione stesso come un elettrodo, poiché la maggior parte reagenti biologici contengono elettroliti disciolti e sono conduttivi. Eliminando gli elettrodi, riduciamo dispositivo tempo di fabbricazione e la complessità, e rendere i dispositivi più robusti. Inoltre, con il nostro approccio, il volume di iniezione dipende dalla tensione applicata alla soluzione picoinjection; questo ci permette di regolare rapidamente il volume iniettato modulando la tensione applicata. Abbiamo dimostrato che la nostra tecnica è compatibile con i reagenti contenenti composti biologici comuni, tra tamponi, enzimi e acidi nucleici.

Introduction

In microfluidica basata gocciolina-, micron scala goccioline acquose sono usati come "provette" per reazioni biologiche. Il vantaggio di eseguire reazioni nelle minuscole goccioline è che ogni goccia utilizza solo qualche pl di reagente e, con microfluidica, le gocce può essere formato e trattati a tassi kilohertz ^1. La combinazione di queste proprietà consentono milioni di reazioni con cellule singole, molecole di acido nucleico, o composti da eseguire in pochi minuti con pl di materiale totale.

Per utilizzare gocce per applicazioni come queste, sono necessarie tecniche per l'aggiunta di volumi controllati di reagenti per le gocce; tali operazioni sono analoghi a pipettare nelle provette. Un metodo per risolvere questo problema consiste electrocoalescence, in cui una goccia di reagente è fusa con la goccia di destinazione applicando un campo elettrico. Il campo elettrico interrompe la disposizione delle molecole di tensioattivo sulle interfacce delle gocce, inducing una instabilità a film sottile e innescando coalescenza in emulsioni che sono altrimenti stabili ^2. Fusione elettricamente indotta viene sfruttata anche nel design del picoinjector, un dispositivo che inietta reagenti in gocce mentre fluiscono passato un canale in pressione ^3. Per applicare il campo elettrico, dispositivi picoinjector utilizzano elettrodi metallici, ma l'integrazione di elettrodi metallici in chip microfluidici è spesso un processo complesso e soggetto ad errori come i fili liquido-saldatura sono facilmente compromesse da bolle d'aria o polvere e altri detriti nel canale , così come fratture da stress o di flessione durante l'installazione del dispositivo.

Presentiamo qui un metodo per eseguire picoinjection senza l'uso di elettrodi metallici, rendendo la fabbricazione più semplice e più robusto. Per attivare picoinjection, noi invece utilizziamo il fluido di iniezione stesso come un elettrodo, poiché la maggior parte reagenti biologici contengono elettroliti disciolti e sono conduttivi. Aggiungiamo anche un "Faraday Moat "per schermare regioni sensibili del dispositivo e di agire come un terreno universale (Figura 1). Il fossato isola elettricamente le goccioline a monte del sito picoinjection fornendo un terreno, impedendo volute gocciolina fusione. Un ulteriore vantaggio della nostra tecnica è che l' volume iniettato nelle gocce dipende dalla grandezza della tensione applicata, consente di essere regolato sintonizzando il segnale applicato.

Noi costruiamo i nostri dispositivi in poli (dimetilsiloxano) (PDMS), utilizzando tecniche di fotolitografia morbide ^4,5. Il nostro approccio è compatibile con i dispositivi fabbricati in altri materiali, come resine, plastiche e resine epossidiche. I canali hanno altezze e larghezze di 30 micron, che sono ottimali per lavorare con goccioline 50 micron di diametro (65 pl). Introduciamo reagenti tramite tubazione in polietilene (diametro interno / esterno 0.3/1.09 mm) inserito nelle porte create durante la fabbricazione di dispositivi con 0,50 millimetri punzoni di biopsia, simili ai metodi described in precedenza ^5. La composizione esatta del fluido di iniezione dipende dall'applicazione specifica. Il fluido bisogno solo contiene elettroliti disciolti in concentrazioni sufficienti per produrre conduttività sufficiente per il segnale elettrico da trasmettere al picoinjector. In prove al banco, abbiamo trovato che le concentrazioni ioniche superiori a 10 mm dovrebbero essere sufficienti ^6, se questo valore e conducibilità del fluido dipendono dalle dimensioni dei dispositivi specifici e ampiezza della tensione applicata.

Protocol

1. Progettazione di dispositivi Dimensioni e topologie Basato su Experimental esigenze, utilizzando Computer Aided Design (CAD) Software

Nota: Selezione diametri dei canali emulsione inferiori a quelle delle goccioline sferiche. Questo costringe le goccioline in una forma cilindrica o "salsiccia" e permette picoinjection più efficace. Per i nostri scopi, abbiamo progettato di 30 x 30 micron canali di goccioline che erano 50 micron di diametro.

1. Sito picoinjection modello (s) dopo quelli descritti da Abate et al. ³ con l'eccezione che i canali per gli elettrodi metallici vengono rimossi, come sono inutili.
2. Aggiungere canali per servire come Faraday Moat (Figura 1) che corrono tra sito picoinjection (s) e l'emulsione monte tale che schermano le goccioline dal campo elettrico.
   Nota: Questo impedisce fusione non volute.

2. Dispositivi fabbricare Uso molle FotolitoTecniche radiografico

1. Generare una maschera di trasparenza fotolitografia in base al file CAD utilizzando i servizi commerciali esistenti.
2. Con la fotomaschera, curare photoresist su wafer di silicio per produrre un GSD, come descritto in precedenza ^4.
3. Pour PDMS miscelato con il catalizzatore (11:01 ratio) il master del dispositivo contenuto in una capsula di Petri 5 centimetri di polistirolo.
4. Posizionare il maestro con PDMS in un essiccatore a vuoto per circa 15 minuti per eliminare eventuali bolle d'aria.
5. Curare il dispositivo PDMS ponendolo in un forno a 95 ° C per 1 ora. In alternativa, il PDMS curerà a temperatura ambiente dopo 24 ore.
6. Rimuovere il dispositivo tagliando lungo il perimetro con una lama chirurgica e peeling accuratamente il dispositivo dal master.
7. Punch di ingresso e uscita fori nelle PDMS utilizzando una biopsia di 0,5 mm.
8. Fissare il dispositivo su un vetrino da microscopio vetro con un bonder plasma ^4.

3. Preparare una pressione d'ariaControllo pompa per pressurizzare un serbatoio contenente il fluido

1. Modificare le prestazioni della pompa in modo tale che le uscite d'aria in pressione attraverso una lunghezza di 2,7 millimetri tubo in polietilene diametro interno.
2. Costruirlo tale che il tubo termina in una siringa luer-lock montando il lume sopra l'ugello sul retro del luer-lock.
3. Sigillare riempiendo lo spazio tra i fili luer-lock e il tubo con resina epossidica.
4. Attaccare un ago 27.5 G.

4. Preparare una Monodisperse emulsione acquosa di goccioline (acqua in olio) sospesi in un inerte Fluorinated Carrier olio con 2% (peso / peso) disciolto biocompatibili tensioattivo ⁷

I reagenti specifici contenuti in queste goccioline dipendono dall'applicazione

1. In preparazione per la reiniezione, caricare l'emulsione in una siringa da 1 ml con un ago G 27.5.
2. Fissare la siringa in una pompa a siringa e orientare verticalmente la pompa (ago verso l'alto).
   Appunto: Questo orientamento provoca le goccioline di confezionare in un livello sopra il olio vettore. Quando si avvia la pompa, le goccioline saranno spinti dalla siringa a frazione ad alto volume lo strato di olio sotto di loro.

5. Preparare Reagenti per Introduzione alla Microfluidic Chip

1. Punch tre fori di 0,5 millimetri nel tappo di un tubo da centrifuga da 15 ml (qualsiasi contenitore con tappo a vite sarà sufficiente) con una biopsia, ago, o trapano.
2. Inserire un filo elettrodo 0,5 mm di diametro e lunghezza cm ~ 20 di PE-2 tubo attraverso due dei fori in modo che raggiungano il fondo della provetta.
3. Nella rimanente foro, infilare un ~ 2,5 cm lunghezza cm ~ 20 di tubo PE tale che riposerà sopra del livello del liquido.
4. Sigillare eventuali lacune sulla parte superiore del tappo con resina epossidica UV-cured.
5. Riempire il tubo con il fluido picoinjection e vite sul tappo.
6. Collegare l'uscita dalla pompa di aria di controllo della pressione per la minore lunghezza dei tubi da insertozione l'ago nel lume. L'ago dovrebbe adattarsi comodamente.
7. Riempire una siringa da 1 ml con 1 M NaCl per servire come Faraday fossato.
8. Collegare un ago G 27.5 e fissare la siringa in una pompa a siringa.
9. Riempire un'altra siringa da 1 ml con olio vettore / distanziatore, collegare un ago G 27.5, e fissarlo in una pompa a siringa.

6. Preparare il dispositivo Microfluidic per Picoinjection

1. Collegare il tubo di uscita (lunghezza più lunga) dal contenitore di fluido di iniezione alla porta di entrata del fluido picoinjection sul chip microfluidica.
2. Collegare la siringa contenente il 1 M NaCl alla porta di ingresso per il Faraday fossato sul chip microfluidica con un pezzo di tubo in PE.
3. Collegare la siringa contenente il vettore di petrolio alla porta di ingresso del chip microfluidica con un pezzo di tubo in PE.
4. Inserire tubo PE nella porta di uscita dell'emulsione sul chip microfluidica. Il tubo deve terminare in un vaso di raccolta emulsione, némalmente una provetta da centrifuga da 1,5 ml.
5. Inserire tubo PE nella porta di uscita per il Faraday fossato sul chip microfluidica. Il tubo deve terminare in un non-conduttore e il contenitore isolato elettricamente per evitare un corto circuito.
6. Collegare l'uscita dell'amplificatore ad alta tensione (HV) tramite pinze alla elettrodo metallico immerso nel liquido picoinjection.
7. Collegare l'elettrodo di massa dell'amplificatore HV via coccodrillo al metallo dell'ago della siringa contenente 1 M NaCl.

7. Infondere reagenti in Microfluidic Chip

1. Introdurre il 1 M NaCl (Faraday Moat) al dispositivo a una velocità di 100 pl / h.
2. Introdurre l'emulsione goccia e olio vettore a tassi adeguati per le dimensioni del dispositivo. Per il nostro dispositivo di demo, vi presentiamo le gocce e l'olio a 200 e 400 ml / h, rispettivamente. Le portate dovrebbero consentire le goccioline di superare l'picoinjector ad intervalli regolari separatida un gap di olio vettore.
3. Regolare la pressione applicata al fluido picoinjection tale che la pressione del fluido in corrispondenza dell'orifizio picoinjection è in equilibrio meccanico con il canale gocciolina.
   Nota: A questa pressione (pressione di Laplace), il fluido di iniezione deve sporgere nel canale gocciolina senza erba off e formando i propri gocce (Figura 2). A queste portate sopra descritte, si applica una pressione di ~ 13 psi al fluido di iniezione a raggiungere l'equilibrio nel sito di iniezione.

8. Inizia Picoinjection

1. Come goccioline passano il foro di iniezione, applicare un 0-10 V, 10 kHz, segnale AC amplificato 1.000 x nel HV-amplificatore (Figura 3).
2. Modulare il volume di iniezione modificando l'ampiezza della tensione applicata.
   Nota: Tensioni superiori dovrebbero consentire più fluido per essere introdotto per le goccioline. Nel nostro test, osserviamo iniezione stabile e coerente a tensioni esseretra 100 e 3000 V utilizzando soluzioni di iniezione di NaCl che vanno 10-500 mM (Figura 4).

Representative Results

Immagini microscopiche portati al sito picoinjection mostra che l'elettrificazione del fluido picoinjection è sufficiente a provocare l'iniezione (Figura 2). Il volume iniettato può essere controllata modulando l'ampiezza della tensione applicata, con tensioni superiori che consentono elevati volumi di iniezione. Noi tracciamo il volume di iniezione rispetto l'ampiezza della tensione applicata per tre molarità rappresentativi di liquido iniettabile in (Figura 3). Per dimostrare il nostro metodo la velocità, abbiamo selettivamente iniettato goccioline passano il sito di iniezione in funzione della presenza o assenza di un colorante fluorescente (Film 1). Gocce passano l'iniettore a 200 Hz, se i tassi fino al 10 kHz sono possibili, a seconda delle capacità del meccanismo di rilevamento gocciolina ^3.

Attribuiamo la dipendenza di volume di iniezione della tensione applicata al fatto che le goccioline si avvicinano e passano il picoinjectione orifizio, lo spessore dello strato di olio che separa l'interfaccia gocciolina dal rigonfiamento nel sito di iniezione diminuisce ^8. La tensione di soglia di una instabilità film sottile elettroindotta è proporzionale allo spessore di questo strato ^9,10. Pertanto, come le goccioline avvicinano alla picoinjector, il momento di coalescenza dipende dalla grandezza del campo elettrico. Tensioni più elevate applicate consentono precedente coalescenza tra la goccia e il fluido di iniezione, causando durate iniezione più lunghi. Poiché il volume di iniezione dipende dalla durata dell'iniezione, pertanto, esso dipende anche tensione applicata.

Soluzioni ioniche inferiori molarità più facilmente attenuare il segnale applicato e ridurre l'intensità di campo elettrico al sito di iniezione rispetto a soluzioni più concentrate. Di conseguenza, fluidi iniezione con bassi molarità di ioni disciolti richiedono tensioni superiori applicate per raggiungere gli stessi volumi di iniezione. Questo relazionianca è dimostrata per una serie di molarità ionici e applicato tensioni in un heatmap 2D (Figura 4).

Figura 1. Base configurazione del dispositivo. Goccioline, olio vettore e 1M NaCl vengono introdotti al dispositivo tramite pompe a siringa. Le goccioline densamente sono spaziate in modo uniforme con base geometria del flusso-fuoco. Poiché le goccioline passano sito picoinjection, un campo elettrico viene generato applicando un segnale AC ad un elettrodo inserito nel contenitore fluido picoinjection (indicata in rosso). Il campo elettrico permette di coalescenza tra le goccioline di passaggio e fluido picoinjection. Goccioline a monte del sito di iniezione sono schermati dal campo elettrico dal Faraday Fossato - un canale di 1 M NaCl (qualsiasi soluzione ionica alta molarità dovrebbe essere sufficiente) in contagire con l'elettrodo di massa dell'amplificatore HV (indicato in nero). Dimensioni dell'apparecchio possono essere scalati a seconda delle necessità; per i nostri scopi, abbiamo progettato di 30 x 30 micron canali (appena a monte del sito di iniezione) per goccioline che erano 50 micron di diametro.

Figura 2. Campo chiaro microscopia del sito picoinjection. In assenza di un campo elettrico (A), molecole di tensioattivo impediscono la coalescenza al sito di iniezione e un contorno distinto è visibile all'interfaccia fluido gocciolina / iniezione. In seguito all'applicazione di un segnale AC 250 V 10 kHz, il confine scompare e reagente viene iniettato come i passi di gocce (B). Per visualizzare, fluido di iniezione è stato colorato con 2 mg / ml di blu di bromofenolo colorante. Figura ripubblicato from ⁶ con il permesso di The Royal Society of Chemistry (RSC)

Figura 3. Dati che dimostrano la relazione tra tensione applicata e aumenta il volume frazione (Vf) di gocce dopo l'iniezione per (A) 100 mM, (B) 50 mM, e (C) 25 mM (NaCl) liquidi iniettabili. Campi elettrici forti più facilmente rompersi le interfacce olio / acqua e permettere l'iniezione su una lunghezza maggiore delle goccioline di passaggio - questo porta a grandi volumi di iniezione. Molarità elevati di elettroliti disciolti aumentano la conducibilità della soluzione iniettabile, producendo campi elettrici forti al sito di iniezione per una data tensione con conseguente aumento dei volumi di iniezione. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard 1 in entrambe le direzioni per> 1.200 gocce del campione in ogni punto. Linee che collegano i punti dati fannonon rappresentano alcuna curva-fit o il modello teorico calcolato. Volumi di inchiostro viene misurato da un sistema di rivelazione di fluorescenza descritto in ^6. Figura ri-pubblicata da ⁶ con il consenso di The Royal Society of Chemistry (RSC). cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

.. Figura 4 Mappa termica mostrando volume di iniezione in funzione della tensione applicata e la molarità di NaCl disciolto nel fluido di iniezione Il volume di iniezione può essere regolato nell'intervallo 0-36 pl con una risoluzione di ~ 2,6 pl (4% Vf ) con incrementi 100V del segnale applicato. I maggiori volumi iniettati sono stati raggiunti a 3.000 V e fluido 100 mm. Increasicampo elettrico ng sopra questo permette di elettrowetting, causando gocce per formare spontaneamente al picoinjector, lesivo efficacia dell'iniezione e coerenza. Frecce / zecche indicano i punti dati. Figura ri-pubblicata da ⁶ con il consenso di The Royal Society of Chemistry (RSC)

Film 1. Repertorio alta velocità dimostrando commutazione selettiva del picoinjector. Solo collirio contenente IR-783 colorante fluorescente (2 mg / ml) sono iniettati con reagente (NaCl 500 mM).

Discussion

Il rapporto tra volume di iniezione e la tensione applicata dipende da molti fattori tra cui le dimensioni del dispositivo, la lunghezza del tubo che trasporta il fluido picoinjection al dispositivo, molarità di fluido picoinjection, e la velocità delle gocce che passano essi iniettore. Per questo motivo si consiglia che il rapporto volume / Tensione essere caratterizzato prima di ogni corsa di picoinjection misurando volumi di iniezione ai bordi dei campi di lavoro di tensione e molarità. Inoltre, a tensioni superiori e iniezione molarità fluidi osserviamo un fenomeno in cui il fluido picoinjection non è più tenuto in equilibrio al foro di iniezione, ma invece boccioli off e forma piccole gocce nel canale di flusso. Attribuiamo questo comportamento elettrowetting, in cui la fase acquosa parzialmente bagna i canali idrofobici, facendolo strisciare fuori dell'orifizio e nel canale di flusso ^11. Se questa instabilità si verifica prima della desideratavolume di iniezione si ottiene, ridurre la portata gocciolina mentre passano l'iniettore e restringendo il canale gocciolina di aumentare la durata dell'iniezione.

Oltre a razionalizzare notevolmente la fabbricazione di dispositivi, questa tecnica dovrebbe anche semplificare l'esecuzione dei regimi di reazione più complesse e combinatorie. Ad esempio, eseguire più picoinjections con la nostra tecnica richiede solo l'aggiunta di canali picoinjection nei siti desiderati di iniezione. Al contrario, i metodi precedenti richiedono canali picoinjection e gli elettrodi di metallo che accompagna da includere in tutti i siti. Inoltre, gli approcci precedenti regolano volume di iniezione relativamente lento variando la pressione di iniezione o velocità gocciolina. Con il nostro approccio, volume di iniezione può essere regolata elettronicamente a tassi più veloci rispetto ai tassi di abbandono più elevati riportati (vedi informativa). Ciò consente l'esecuzione di saggi più complessi, con volumi di iniezione su misura per le condizioni specifichezioni all'interno di ogni microdrop. Normalizzazione e iniezione di reagenti in popolazioni gocciolina polidispersi, per esempio, richiederebbe determinazione on-the-fly di volumi di iniezione.

Questa tecnica è stata sviluppata e dimostrata di lavorare in dispositivi che impiegano picoinjection per multi-step reazioni biologiche come la PCR digitale e saggi di genotipizzazione ^12. Tuttavia, con poco o nessun cambiamento al protocollo, la tecnica dovrebbe essere utile per qualsiasi sperimentatore richiede l'aggiunta di reagenti di goccioline per eventuali applicazioni biologiche, chimiche, industriali o - finché il liquido iniettabile contiene specie ioniche disciolte.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Luer-Lok™ syringes	BD Medical	309628
LocTite UV-cured adhesive	Henkel	35241
PE-2 tubing	Scientific Commodities	BB31695-PE/2
Novec HFE-7500	3M	98-0212-2928-5
NaCl	Sigma Aldrich	S9888
1.5 ml centrifuge tubes	Eppendorf	22363531
BD Falcon 15 ml tube	BD Biosciences	352097
Air pressure control pump	Control Air Inc.		We recommend one under the control of DAQ and control software
Syringe pumps	New Era		Must be capable of holding 1 ml syringes and flowing at rates as low as 100 μl/hr
HV-amplfier			Must be capable of 1,000x amplification of signals between 0.01 and 10 V
Plasma bonder/cleaner	Harrick Plasma
3” silicon wafers	Sigma Aldrich	647535
PDMS	Dow Corning		Sylgard 184 with curing agent should be included
SU-8 photoresist	MicroChem		Viscocity depends on device dimensions