Detta protokoll beskriver en mikro-kompatibel metod för cell mönstring på SiO 2. En fördefinierad parylen-C design fotolitografiskt tryckt på SiO 2 wafers. Efter inkubation med serum (eller annan aktiveringslösning) celler hålla sig specifikt till (och växa beroende på överensstämmelse) underliggande parylen-C, samtidigt som tillbaka av SiO 2-regioner.
Cell mönstring plattformar stödjer breda mål forskning, till exempel byggandet av fördefinierade in vitro neuronala nätverk och utforskandet av vissa centrala aspekter av cellulär fysiologi. För att enkelt kombinera cell mönstring med multielektrod Arrays (MEA) och kiselbaserade "labb på ett chip"-teknik, är en mikro-kompatibla protokoll krävs. Vi beskriver en metod som utnyttjar avsättningen av polymer parylen-C på SiO 2 wafers. Fotolitografi möjliggör korrekt och tillförlitlig mönstring av parylen-C på micron-nivå upplösning. Efterföljande aktivering genom nedsänkning i fetalt bovint serum (eller en annan specifik aktiveringslösning) resulterar i ett substrat där odlade celler ansluter sig till, eller tillbaka av, parylen eller SiO 2 regioner respektive. Denna teknik har gjort det möjligt mönstring av ett brett spektrum av celltyper (inklusive primära murina hippocampala celler, HEK 293-cellinje, mänsklig neuronliknande teratokarcinomcellercellinje, primära murina cerebellär granulat celler, och primära humana gliom-härledde stem-liknande celler). Intressant är dock att plattformen inte är universell, vilket visar vikten av cellspecifika adhesionsmolekyler. Denna cell mönstring process är kostnadseffektivt, tillförlitligt och viktigast kan införlivas i standardmikrofabrikation (chip tillverkning) protokoll, som banar väg för integration av mikroteknik.
Att förstå mekanismerna som styr cell adhesion och mönstring på syntetiska material är viktigt för applikationer såsom vävnadsteknik, läkemedelsutveckling, och tillverkningen av biosensorer 1-3. Många tekniker är tillgängliga och utvecklas, var och en att dra nytta av de otaliga biologiska, kemiska och fysikaliska faktorer som påverkar cell adhesion.
Här beskriver vi en cell-mönstring teknik som använder processer som ursprungligen utvecklats för mikrofabrikationsändamål. Som sådan är den plattform goda förutsättningar att göra det möjligt för nedströms integrera mikroelektronik teknik, såsom MEA, till mönstring plattform.
Gränssnittet mellan en cellmembran och en intilliggande material är dubbelriktad och komplex. In vivo, extracellulära matrixproteiner ger struktur och styrka och inverkan på cellens beteende via interaktioner med celladhesionsreceptorer. På samma sätt celler i vITRO interagera med syntetiska substrat via absorberade lager av proteiner 4 medan fysikalisk-kemisk påverkan modulera också vidhäftning. Till exempel kan en polymer yta göras mer "vätbara" (hydrofil) genom joner eller bestrålning med ultraviolett ljus, eller etsning genom behandling med syra eller hydroxid 5. Etablerade metoder för cell mönstring utnyttja dessa och andra cellvidhäftningsförmedlare. Exempel är bläckstråleutskrifter 6, microcontact stämpling 7, fysisk immobilisering 8, mikrofluidik 9, realtid manipulation 10, och selektiv molekylär monterings mönstring (SMAP) 11. Var och en har specifika fördelar och begränsningar. En viktig drivkraft i vårt arbete, dock, är att integrera cell mönstring med mikroelektromekaniska system (MEMS).
MEMS hänvisar till extremt små mekaniska anordningar som drivs av el. Detta överlappar med nanonivå motsvarande, nanoelectromechanical system. Konceptet blev praktiskt bara när halvledar strategier aktiverat tillverkning att ske i mikroskala. Mikrotillverkningstekniker utvecklades ursprungligen för halvledarelektronik har av misstag visat sig användbara för andra ändamål såsom cellulär elektrofysiologi, till exempel. En viktig nedströms mål är att kombinera sådana mikroelektroniska teknik med en hifi-cell mönstring process (som bildar en BioMEMS enhet). Flera befintliga och annars pålitliga och praktiska cell-mönstring tekniker är oförenliga med denna idé. Exempelvis är noggrann inriktning av några inbäddade mikroelektronik eller biosensorer grundläggande för deras effektivitet men är ytterst svårt att uppnå med användning av en teknik såsom microcontact stämpling.
För att kringgå detta problem, arbetar vi på en SiO 2-baserade mönstrings plattform som använder fotolitografiskt tryckta parylen-C. Fotolitografi innebär överföring av geometriska egenskaper frånen mask på ett substrat via UV-belysning. En mask är konstruerad med hjälp av en lämplig datorstödd design program. Vid en glasplatta, ett tunt lager av icke-transparent krom representerar den önskade geometriska mönster (en funktion upplösning på 1-2 mm är möjligt). Substratet som skall mönstras är belagd med ett tunt skikt av fotoresist (en UV-känslig polymer). Den belagda polymeren inriktas sedan och bringas i nära kontakt med masken. En UV-källa tillämpas så att oskyddade områden bestrålas och därmed blir lösliga och avtagbar i nästa utvecklingssteg, som lämnar en parylen-C-representation av maskmönstret bakom. Denna process har sitt ursprung under utvecklingen av halvledarkomponenter. Som sådana är kiselskivor används ofta som ett substrat. Fotolitografisk deposition av parylen-C på SiO 2 är därför en enkel och tillförlitlig process som rutinmässigt sker i mikroelektroniska renrumsanläggningar.
Medan parylen harflera önskvärda bioteknik egenskaper (kemiskt inert, icke biologiskt nedbrytbara), är en faktor som begränsar dess direkt användning i cell mönstring dess medfött dåliga cellvidhäftningsförmåga, delvis tillskrivas dess extrema hydrofobicitet. Icke desto mindre har parylen-C tidigare använts indirekt för cell mönstring, till exempel som en avskalningsbar cellulär mall 12,13. Detta tillvägagångssätt begränsas av dålig upplösning och kräver flera steg. Processen som beskrivs här utnyttjar istället en syraetsning steg, följt av serum inkubation, för att säkerställa att parylen-C-regionerna blir cell-lim, genom en kombination av minskad hydrofobicitet och serumproteinbindning.
Slutresultatet är en konstruktion som består av två olika substrat som, efter biologisk aktivering, manifesterar respektive cyto-adhesiva eller cyto-repellerande egenskaper och därför är ett effektivt cell smattrande plattform. Viktigt, det finns inget behov av att införa biologisk agföräldrar i renrumsanläggningen som de mönstrade substrat kan lagras på obestämd tid före användning (varefter de aktiveras med fetalt bovint serum eller annan aktiveringslösning).
Denna parylene-C/SiO 2 mönstring plattform är därför en bra kandidat för en koalition med MEMS-komponenter, eftersom de tillverkningsprocesser så nära spegla de som används för mikrotillverkning.
Nedsänkning av flis i Piranha syra tjänar inte bara för att ta bort eventuellt kvarvarande organiskt material utan även etsar substratytorna. Detta är nyckeln till att möjliggöra en effektiv aktivering med fetalt bovint serum. Underlåtenhet att göra detta förhindrar cell-mönstring och djupt förändrar cellens beteende on-chip. Det finns inget krav att sterilisera chips efter rengöring med Piranha syra. Faktum sterilisering med UV-exponering har visat sig underminera cell mönstring på ett dosberoende sätt 13. Man måste vara försiktig för att tvätta bort all resterande fotoresist efter fotolitografiska processen. Bestående fotoresist kan fungera som en oönskad cyto-klisterskikt som åsidosätter mönstring dikterad av parylene-C/SiO 2 geometri. Aceton är effektiv vid användning av fotolitografisk process som beskrivs ovan och med de reagenser anges. Emellertid kan andra typer av fotoresist kräva ett annat lösningsmedel.
För att bedöma effekten och framgång different tillverkningssteg, kan kontaktvinkeln för de två kontrasterande substrat skall mätas. Figur 2 åskådliggör de förändringar som inträffar under den spånaktiveringsprocessen. Det är dock troligt att specifika lim och motbjudande proteinkomponenter i serum i slutändan möjliggöra för parylen mönstrade chip för att utöva sina respektive cyto-lim eller cyto-frånstötande egenskaper.
Alla representativa resultat som används marker med en parylen tjocklek på 100 nm, även om vi har lyckats mönstrade med både tjockare och tunnare Parylene lager. Viktigt här fotolitografisk etsning teknik gör mycket större tredimensionell kontroll av parylen konfiguration än den som visas här. Till exempel, genom att använda en kombination av fotomasker, är det möjligt att skapa Parylene regioner i blandad tjocklek. Detta öppnar vägen för att skapa cellkulturer med definierad tredimensionell topografi, som går utöver att bara diktera regioner celladhesion / repulsionen, med potentiellt ett sätt att integrera mikrofluidikkanaler in i konstruktionen.
Som framgår är dock denna mönstring plattform inte universellt effektiva över celltyper. Olika cellinjer, med sina varierande celladhesionsmolekyl profiler, föga förvånande beter sig annorlunda när de odlas på denna plattform. Vi har ännu inte identifierat de viktigaste komponenterna i serum, eller de gratis cellmembranreceptorer, som ligger till grund för denna cell-mönstring plattform. Om du gör det i framtiden lovar att bredda dess användbarhet och specificitet. Till exempel kan en "icke-mönstring 'cellinjen modifieras genetiskt för att uttrycka den nödvändiga vidhäftningsmolekyl och så främja mönstring.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av en Wellcome Trust Klinisk PhD stipendium (ECAT).
Layout editor software package | e.g. CleWin 5.0 from WieWeb, http://www.wieweb.com/ns6/index.html | Capable of reading/writing CIF or GDS-II files. Used to create parylene design for photo mask manufacture | |
Bespoke photo mask | e.g. Compugraphics International Ltd, Glenrothes, Scotland, www.compugraphics-photomasks.com | Either fabricate in-house of facilities exist or commision | |
3" Silicon wafers | e.g. Siltronix, Archamps, France, http://www.siltronix.com | ||
Atmospheric horizontal furnace | e.g. Sandvik, http://www.mrlind.com | For oxidising silicon wafer | |
Small spot spectroscopic reflectometer | e.g. Nanometrics NanoSpec 3000 reflectometer, www.nanometrics.com/ | To measure depth of silicon dioxide layer | |
Silane adhesion promoter | e.g. Merck Silane A174 adhesion promoter. Merck Chemicals, www.merck-chemicals.de/ | 1076730050 | Pre-applied to wafer to encourage parylene deposition |
Parylene-C | e.g. Ultra Electronics, www.ultra-cems.com | ||
SCS Labcoter 2 deposition Unit, Model PDS2010 | SCS equipment, Surrye, UK, www.scscoatings.com/ | Model PDS2010 | |
Hexamethyldisilazane (HMDS) adhesion promoter | e.g. SpiChem, www.2spi.com | ||
Automated track system for dispensing photoresist on wafers. | e.g SVG (silicon Valley Group) 3 inch photo-resist track, | Automated track system for dispensing photoresist on wafers. A prime oven bakes the wafer and dispenses the adhesion promoter, HMDS. A combination spinner dispenses photoresist. Pre-bake oven cures the resist. | |
Photo-resist: Rohm & Haas | Rohm & Haas, www.rohmhaas.com/ | SPR350-1.2 positive photo-resist | |
Phot-mask aligner | e.g. Suss Microtech MA/BA8 mask aligner, www.suss.com | ||
Microchem MF-26A developer | Microchem MF-26A developer, www.microchem.com | Removes exposed reogions of photoresist | |
Plasma etch system | e.g. JLS RIE80 etch system, JLS Designs, www.jlsdesigns.co.uk | Removes exposed regions of parylene | |
Wafer dicing saw | e.g. DISCO DAD 680 Dicing Saw, DISCO Corporation, Japan, www.disco.co.jp | ||
Acetone | e.g. Fisher Scientific, www.fishersci.com/ | A929-4 | To wash off residual photoresist |
30% Hydrogen Peroxide | e.g. Sigma-Aldrich, www.sigmaaldrich.com | H1009 | |
98% Sulphuric Acid | e.g. Sigma-Aldrich, www.sigmaaldrich.com | 435589 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco-Invitrogen, www.invitrogen.com | 10437 | Standard chip activation. |
Hank's Balanced Salt Solution | Gibco-Invitrogen, www.invitrogen.com | 14170 |