Ce protocole décrit un procédé de microfabrication compatible pour un patron de cellules de SiO 2. Une conception prédéfinie parylène-C par photolithographie est imprimé à la SiO 2 gaufrettes. Après incubation des cellules avec du sérum (ou une autre solution d'activation) adhèrent spécifiquement (et se développent en fonction de la conformité des) sous-jacent parylène-C, tout en étant repoussé par SiO 2 régions.
Plates-formes cellule de motifs d'appuyer les objectifs de recherche généraux, tels que la construction de réseaux de neurones prédéfinis in vitro et l'exploration de certains aspects centraux de la physiologie cellulaire. Pour combiner facilement un patron de cellules avec Multi-Electrode Arrays (AME) et à base de silicium «laboratoire sur puce» technologies, un protocole de microfabrication-compatible est nécessaire. Nous décrivons un procédé qui utilise le dépôt du polymère de parylène-C sur SiO 2 gaufrettes. Photolithographie permet de motifs précis et fiable de parylène-C à une résolution au niveau du micron. Après activation par immersion dans du sérum de veau fœtal (ou d'une autre solution d'activation spécifique) conduit à un substrat dans lequel les cellules cultivées adhèrent à, ou sont repoussés par, le parylène ou de SiO 2, respectivement les régions. Cette technique a permis la structuration d'une large gamme de types de cellules (y compris les cellules murines hippocampiques primaires, des cellules HEK 293, une lignée cellulaire de tératocarcinome humain neurone-likelignée cellulaire, les cellules granulaires du cervelet primaires murins, et cellules humaines primaires en forme de tige gliome-dérivée). Il est intéressant, cependant, la plate-forme n'est pas universel; reflétant l'importance des molécules d'adhésion cellulaires spécifiques. Ce processus de structuration de la cellule est rentable, fiable, et surtout peut être incorporé dans la microfabrication norme (fabrication de la puce) les protocoles, ouvrant la voie à l'intégration de la technologie microélectronique.
Mécanismes qui dictent l'adhésion cellulaire et la structuration de matériaux synthétiques Comprendre est important pour des applications telles que l'ingénierie tissulaire, la découverte de médicaments, et la fabrication de biocapteurs 1-3. De nombreuses techniques sont disponibles et en évolution, chaque profitant des facteurs biologiques, chimiques et physiques qui influent sur une myriade de l'adhésion cellulaire.
Ici, nous décrivons une technique de cellule de motif, qui utilise les procédés développés initialement à des fins de fabrication microélectroniques. En tant que tel, la plate-forme est bien placé pour permettre une intégration en aval de technologies microélectroniques, tels que les AEM, dans la plate-forme de structuration.
L'interface entre la membrane cellulaire et un matériau adjacent est bidirectionnel et complexe. In vivo, les protéines de la matrice extracellulaire fournissent la structure et la force et l'impact sur le comportement des cellules par l'intermédiaire d'interactions avec des récepteurs d'adhésion cellulaire. De même, les cellules de vITRO interagir avec des substrats synthétiques par des couches de protéines absorbées 4 tandis que les influences physico-chimiques modulent également l'adhérence. Par exemple, une surface de polymère peut être rendu plus "mouillable" (hydrophile) par irradiation par des ions ou des rayons ultraviolets, ou la gravure par traitement avec de l'acide ou de l'hydroxyde 5. Méthodes établies pour un patron de cellules de profiter de ces et d'autres médiateurs d'adhésion cellulaire. Les exemples incluent impression jet d'encre 6, 7 microcontact estampage, l'immobilisation physique 8, 9 microfluidique, la manipulation en temps réel de 10, et la structuration sélective moléculaire de montage (SMAP) 11. Chacun a des avantages et des limites spécifiques. Un facteur clé dans notre travail, cependant, est d'intégrer un patron de cellules avec les systèmes micro-électromécaniques (MEMS).
MEMS se réfèrent à très petits dispositifs mécaniques d'entraînement par l'électricité. Cette chevauche l'échelle nanométrique équivalent, nanoelectromechsystèmes anical. Ce concept est devenu pratique uniquement lorsque les stratégies de semi-conducteurs ont permis la fabrication aura lieu à l'échelle microscopique. techniques de microfabrication développées à l'origine pour des produits électroniques de semi-conducteurs ont été trouvés par inadvertance utile pour d'autres utilisations telles que l'électrophysiologie cellulaire, par exemple. Un but en aval clé est de combiner ces technologies microélectroniques avec un processus de structuration de la cellule de haute fidélité (formation d'un dispositif bioMEMS). Plusieurs techniques cellules structuration existantes et autrement fiables et pratiques sont incompatibles avec cette idée. Par exemple, un alignement précis des biocapteurs ou des micro-électronique embarqué est essentielle à leur efficacité, mais il est extrêmement difficile à réaliser en utilisant une technique telle que l'estampage microcontact.
Pour contourner ce problème, nous travaillons sur une plate-forme de motifs de base de SiO 2 qui utilise photolithographie imprimé parylène-C. Photolithographie implique le transfert de caractéristiques géométriques deun masque sur un substrat par l'intermédiaire d'une illumination UV. Un masque est conçu en utilisant un programme de conception assistée par ordinateur approprié. Sur une plaque de verre, une mince couche de chrome opaque représente la configuration géométrique souhaitée (une résolution de caractéristique de 1-2 mm est possible). Le substrat à motif est revêtue d'une mince couche de résine photosensible (un polymère sensible à l'UV). Le polymère est ensuite revêtu aligné et mis en contact étroit avec le masque. Une source de rayons UV est appliquée de telle sorte que les zones non protégées sont irradiés et donc devenir soluble et amovible dans l'étape de développement suivante, en laissant une représentation du parylène-C de la configuration de masque derrière. Ce processus a commencé pendant le développement de dispositifs semi-conducteurs. En tant que tel, des tranches de silicium sont fréquemment utilisés en tant que substrat. Dépôt de photolithographie de parylène C sur SiO 2 est donc un processus simple et fiable qui a lieu régulièrement en salle blanche microélectronique.
Alors que parylène aplusieurs caractéristiques souhaitables de bio-ingénierie (chimiquement inerte, non bio-dégradables), un facteur limitant son utilisation directe dans la structuration de la cellule est son adhérence cellulaire innée pauvres, attribué en partie à l'extrême hydrophobie. Néanmoins, le parylène-C a déjà été utilisé indirectement pour produire un patron de cellules, par exemple en tant que matrice cellulaire pelable 12,13. Cette approche est limitée par la faible résolution et nécessite plusieurs étapes. Le procédé décrit ici utilise à la place d'une étape d'attaque acide, suivie d'une incubation de sérum, de sorte que les régions du parylène-C deviennent cellule-adhésif, à travers une combinaison de la réduction du caractère hydrophobe et la protéine de liaison sérum.
Le résultat final est une construction composée de deux substrats différents qui, après activation biologique, manifestent des caractéristiques cyto-adhésives ou cyto-répulsion respectifs et représente une plate-forme efficace de crépitement de cellule ainsi. Fait important, il n'est pas nécessaire d'introduire ag biologiqueents dans l'installation de salle blanche selon les substrats à motifs peuvent être stockées indéfiniment avant utilisation (la suite de quoi ils sont activés à l'aide de sérum bovin fœtal ou d'une autre solution d'activation).
Cette parylene-C/SiO 2 plate-forme de structuration est donc un bon candidat pour une coalition avec des composants MEMS, comme les procédés de fabrication afin reflètent étroitement celles utilisées pour la fabrication microélectronique.
Immersion dans de l'acide de puces de piranha sert non seulement de supprimer toute matière organique résiduelle, mais aussi attaque chimiquement les surfaces du substrat. Cela est essentiel pour permettre l'activation efficace avec du sérum de veau fœtal. Ne pas le faire empêche la cellule de motifs et modifie le comportement des cellules sur puce profondément. Il n'est pas nécessaire de stériliser les puces après le nettoyage avec de l'acide de piranha. En effet, la stérilisation par exposition aux UV a été montré pour miner un patron de cellules dans un mode dépendant de la dose 13. Il faut veiller à enlever toute résine photosensible résiduelle après le processus de photolithographie. Résine photosensible persistant peut agir comme une couche de cyto-adhésif indésirables qui remplace motifs dictés par parylene-C/SiO 2 géométrie. L'acétone est efficace lors de l'utilisation du procédé décrit ci-dessus de photolithographie et avec les réactifs spécifiques. Cependant, d'autres types de résine photosensible peuvent nécessiter un solvant différent.
Pour évaluer l'impact et le succès de la différent étapes de fabrication, l'angle des deux substrats contrastées de contact peuvent être mesurés. figure 2 illustre les modifications qui se produisent au cours du processus d'activation de la puce. Il est probable, cependant, que l'adhésif spécifique et les composants protéiques dans le sérum de répulsion permettent finalement la puce de parylène à motifs pour exercer ses caractéristiques cyto-adhésives ou cyto-répulsive respectifs.
Tous les résultats représentatifs utilisés puces avec une épaisseur de parylène de 100 nm, que nous avons modelé avec succès en utilisant des couches à la fois plus épaisses et plus minces de parylène. Fait important, cette technique photolithogravure permet un plus grand contrôle tridimensionnel de configuration de parylène à celle illustrée ici. Par exemple, en utilisant une combinaison de masques photographiques, il est possible de créer des zones de parylène d'épaisseur mixte. Cela ouvre la voie à la création de cultures cellulaires avec défini topographie tridimensionnelle, allant au-delà des régions tout simplement dicter de l'adhésion cellulaire / répulsionsion, offrant potentiellement un moyen d'intégrer les canaux microfluidiques dans la construction.
Comme le montre, cependant, cette plate-forme de structuration n'est pas universellement efficace dans tous les types cellulaires. Des lignées cellulaires différentes, avec leurs profils variés de molécules d'adhésion cellulaire, se comportent différemment lorsqu'ils sont cultivés sans surprise sur cette plate-forme. Nous n'avons pas encore identifié les éléments clés dans le sérum, ni les récepteurs de la membrane cellulaire gratuits, qui sous-tendent cette plate-forme cellulaire de motifs. Faire à l'avenir promet d'élargir son utilité et spécificité. Par exemple, une lignée de cellules "non-patterning" pourrait être génétiquement modifié pour exprimer la molécule d'adhésion requis et ainsi de promouvoir la structuration.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par un Wellcome Trust doctorat clinique bourse (ECAT).
Layout editor software package | e.g. CleWin 5.0 from WieWeb, http://www.wieweb.com/ns6/index.html | Capable of reading/writing CIF or GDS-II files. Used to create parylene design for photo mask manufacture | |
Bespoke photo mask | e.g. Compugraphics International Ltd, Glenrothes, Scotland, www.compugraphics-photomasks.com | Either fabricate in-house of facilities exist or commision | |
3" Silicon wafers | e.g. Siltronix, Archamps, France, http://www.siltronix.com | ||
Atmospheric horizontal furnace | e.g. Sandvik, http://www.mrlind.com | For oxidising silicon wafer | |
Small spot spectroscopic reflectometer | e.g. Nanometrics NanoSpec 3000 reflectometer, www.nanometrics.com/ | To measure depth of silicon dioxide layer | |
Silane adhesion promoter | e.g. Merck Silane A174 adhesion promoter. Merck Chemicals, www.merck-chemicals.de/ | 1076730050 | Pre-applied to wafer to encourage parylene deposition |
Parylene-C | e.g. Ultra Electronics, www.ultra-cems.com | ||
SCS Labcoter 2 deposition Unit, Model PDS2010 | SCS equipment, Surrye, UK, www.scscoatings.com/ | Model PDS2010 | |
Hexamethyldisilazane (HMDS) adhesion promoter | e.g. SpiChem, www.2spi.com | ||
Automated track system for dispensing photoresist on wafers. | e.g SVG (silicon Valley Group) 3 inch photo-resist track, | Automated track system for dispensing photoresist on wafers. A prime oven bakes the wafer and dispenses the adhesion promoter, HMDS. A combination spinner dispenses photoresist. Pre-bake oven cures the resist. | |
Photo-resist: Rohm & Haas | Rohm & Haas, www.rohmhaas.com/ | SPR350-1.2 positive photo-resist | |
Phot-mask aligner | e.g. Suss Microtech MA/BA8 mask aligner, www.suss.com | ||
Microchem MF-26A developer | Microchem MF-26A developer, www.microchem.com | Removes exposed reogions of photoresist | |
Plasma etch system | e.g. JLS RIE80 etch system, JLS Designs, www.jlsdesigns.co.uk | Removes exposed regions of parylene | |
Wafer dicing saw | e.g. DISCO DAD 680 Dicing Saw, DISCO Corporation, Japan, www.disco.co.jp | ||
Acetone | e.g. Fisher Scientific, www.fishersci.com/ | A929-4 | To wash off residual photoresist |
30% Hydrogen Peroxide | e.g. Sigma-Aldrich, www.sigmaaldrich.com | H1009 | |
98% Sulphuric Acid | e.g. Sigma-Aldrich, www.sigmaaldrich.com | 435589 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco-Invitrogen, www.invitrogen.com | 10437 | Standard chip activation. |
Hank's Balanced Salt Solution | Gibco-Invitrogen, www.invitrogen.com | 14170 |