Denne protokol beskriver en microfabrication-kompatibel metode til celle mønster på SiO2. En foruddefineret parylen-C design fotolitografisk trykt på SiO 2 wafers. Efter inkubation med serum (eller anden aktivering løsning) celler overholder specifikt til (og vokse i henhold til overensstemmelse) underliggende parylen-C, mens bliver frastødt af SiO 2-regioner.
Cell patterning platforme understøtter brede forsknings-mål, såsom byggeri af foruddefinerede in vitro neuronale netværk og udforskning af visse centrale aspekter af cellulær fysiologi. For nemt at kombinere celle mønster med Multi-elektrode Arrays (MEA) og silicium-baserede »lab på en chip 'teknologier, er der en microfabrication-kompatibel protokol kræves. Vi beskriver en fremgangsmåde, der udnytter afsætning af den polymere parylen-C på SiO 2 wafers. Fotolitografi muliggør nøjagtig og pålidelig mønstret af parylen-C på micron-niveau opløsning. Efterfølgende aktivering ved nedsænkning i oksefosterserum (eller en anden specifik aktivering opløsning) resulterer i et substrat, hvor dyrkede celler overholde, eller frastødt af, parylen eller SiO 2-regioner hhv. Denne teknik har muliggjort mønstret af en bred vifte af celletyper (herunder primære murine hippocampus celler, HEK 293 cellelinje, human neuron-lignende teratocarcinomcellercellelinie, primære murine cerebellumgranulaceller og primære humane gliom-afledte stamceller-lignende celler). Men interessant platformen ikke er universel; afspejler vigtigheden af cellespecifikke adhæsionsmolekyler. Denne celle mønster proces er omkostningseffektiv, pålidelig og vigtigere kan indarbejdes i standard microfabrication (chipproduktion) protokoller, der baner vejen for integration af mikroelektronik.
Forståelse mekanismer, der dikterer celle vedhæftning og mønster på syntetiske materialer er vigtigt for applikationer såsom tissue engineering, lægemiddelforskning, og fremstillingen af biosensorer 1-3. Mange teknikker er til rådighed og under udvikling, hver drage fordel af de utallige biologiske, kemiske og fysiske faktorer, der påvirker celle adhæsion.
Her beskriver vi en celle-mønster teknik, der udnytter processer oprindeligt blev udviklet til mikroelektroniske fabrikation formål. Som sådan platform er godt rustet til at muliggøre downstream integration af mikroelektroniske teknologier, såsom multilaterale miljøaftaler, i mønstret platform.
Grænsefladen mellem en cellemembran og en tilstødende materiale er tovejs og kompleks. In vivo ekstracellulære matrixproteiner giver struktur og styrke og indflydelse på celle adfærd via interaktioner med celleadhæsionsreceptorer. Tilsvarende celler i vitro interagere med syntetiske substrater via absorberede lag af proteiner 4 mens fysisk-kemiske påvirkninger også modulere vedhæftning. For eksempel kan en polymer overflade gøres mere "befugtelig" (hydrofil) af ioner eller bestråling med ultraviolet lys eller ætsning ved behandling med syre eller hydroxid 5. Etablerede metoder til celle mønster drage fordel af disse og andre celleadhæsionsprocesser mediatorer. Eksempler inkluderer inkjet trykning 6, microcontact stempling 7, fysisk immobilisering 8, MicroFluidics 9, real-time manipulation 10 og selektiv molekylær samling mønster (SMAP) 11.. De har hver deres fordele og begrænsninger. En vigtig drivkraft i vores arbejde, er imidlertid at integrere celle mønster med microelectromechanical systemer (MEMS).
MEMS henvise til ekstremt små mekaniske anordninger drevet af elektricitet. Det overlapper med nanoskala tilsvarende nanoelectromechnisk systemer. Dette koncept blev praktisk, når halvleder strategier aktiveret fabrikation at finde sted på mikroskala. Microfabrication teknikker udviklet oprindeligt for halvleder elektronik uforvarende har fundet nyttige for andre anvendelser, såsom cellulær elektrofysiologi, for eksempel. Et centralt nedstrøms mål er at kombinere sådanne mikroelektroniske teknologier med en high fidelity celle mønster proces (danner en BioMEMS enhed). Adskillige eksisterende og ellers pålidelige og praktiske celle-mønster teknikker er uforenelige med denne idé. For eksempel nøjagtig justering af eventuelle indbyggede mikroelektronik eller biosensorer er grundlæggende for deres effektivitet, men er yderst vanskeligt at opnå ved hjælp af en teknik, såsom microcontact stempling.
For at omgå dette problem, arbejder vi på en SiO 2-baserede mønster platform, der bruger fotolitografisk trykte parylen-C. Fotolitografi omfatter overførsel af geometriske træk fraen maske på et substrat via UV-belysning. En maske er designet ved hjælp af en passende computerstøttet design program. Ved en glasplade, et tyndt lag af uigennemsigtig chrom repræsenterer ønsket geometrisk mønster (en funktion opløsning på 1-2 mm er mulig). Det substrat, der skal mønstret er belagt med et tyndt lag af fotoresist (en UV-følsom polymer). Den overtrukne polymer derefter afstemt og bringes i tæt kontakt med masken. En UV-kilde er anvendt sådan, at ubeskyttede områder bestråles, og derfor bliver opløselige og aftagelig i næste udviklingstrin, hvilket efterlader et parylen-C repræsentation af masken mønster bag. Denne proces opstod under udviklingen af halvlederkomponenter. Som sådan er siliciumskiver ofte anvendes som substrat. Fotolitografisk aflejring af parylen-C på SiO 2 er derfor en enkel og pålidelig proces, der rutinemæssigt finder sted i mikroelektroniske renrumsfaciliteter.
Mens parylen harflere ønskelige bioteknik egenskaber (kemisk inert, ikke bio-nedbrydeligt), en faktor, der begrænser dens direkte brug i celle mønster er dens medfødt dårlig celle klæbeevne, dels tilskrives sin ekstreme hydrofobicitet. Alligevel har parylen-C tidligere blevet anvendt indirekte celle mønster, for eksempel som en afrivelig cellulære skabelon 12,13. Denne fremgangsmåde er begrænset af dårlig opløsning og kræver flere trin. Den her beskrevne fremgangsmåde i stedet anvender en syre etch trin, efterfulgt af serum inkubering at sikre, at parylen-C regioner bliver celle-klæbemiddel, gennem en kombination af reduktion i hydrofobicitet og serumproteiner.
Slutresultatet er en konstruktion, der består af to forskellige substrater, som efter biologisk aktivering, manifestere respektive cyto-klæbende eller cyto-frastødende egenskaber og så repræsenterer en effektiv celle pattering platform. Vigtigere er det, der er behov for at indføre den biologiske agforældre i Renrumsfaciliteterne som mønstrede substrater kan gemmes på ubestemt tid før brug (hvorefter de er aktiveret ved hjælp af føtalt bovint serum eller anden aktivering opløsning).
Denne parylene-C/SiO 2 mønster platform er derfor en god kandidat til en koalition med MEMS-komponenter, som fremstillingsprocesser så tæt afspejler dem, der anvendes til mikroelektroniske fabrikation.
Nedsænkning af chips i piranha syre tjener ikke kun for at fjerne eventuelle organisk materiale, men også ætser underlaget overflader. Dette er nøglen til at muliggøre effektiv aktivering med føtalt bovint serum. Undladelse heraf forhindrer celle-mønster og dybt ændrer celle adfærd on-chip. Der er ingen krav til at sterilisere chips efter rengøring med piratfisk syre. Faktisk har vist sterilisation ved UV-eksponering til at underminere celle mønster på en dosis-afhængig måde 13. Pleje skal tages for at vaske al resterende fotoresist efter fotolitografisk proces. Vedvarende fotoresist kan fungere som en uønsket cyto-klæbende lag, der tilsidesætter mønster dikteret af parylene-C/SiO 2 geometri. Acetone er effektiv, når anvendelse af fotolitografisk proces, der er beskrevet ovenfor, og de reagenser, der er specificeret. Andre typer af fotoresist kan imidlertid kræve en anden solvent.
At vurdere virkningen og succes Forskelnt fremstillingstrin, kan måles kontaktvinklen af de to modsatrettede substrater. Figur 2 illustrerer de ændringer, der opstår under chippen aktiveringsprocessen. Det er dog sandsynligt, at særlig lim og frastødende proteinkomponenter i serum i sidste ende gøre det muligt for parylen-mønstrede chip til at udøve deres respektive cyto-klæbende eller cyto-frastødende egenskaber.
Alle repræsentative resultater anvendte chips med en parylen tykkelse på 100 nm, selvom vi med succes har mønstrede ved hjælp af både tykkere og tyndere parylen lag. Vigtigere er det, denne fotolitografisk ætsning teknik tillader meget større tredimensionale styring af parylen konfiguration end den, der er illustreret her. For eksempel ved hjælp af en kombination af fotomasker, er det muligt at skabe parylen regioner blandet tykkelse. Dette baner vejen til at skabe cellekulturer med defineret tre-dimensionelle topografi, der går videre end blot at diktere regioner celle adhæsion / repulsionen potentielt giver et middel til at integrere mikrofluidkanaler i konstruktionen.
Som vist, men dette mønster platformen ikke er universelt effektive i hele celletyper. Forskellige cellelinjer, med deres varierede celleadhæsionsmolekyle profiler, ikke overraskende opfører sig anderledes, når de dyrkes på denne platform. Vi har endnu ikke identificeret de vigtigste komponenter i serum, eller de gratis celle-membran receptorer, der ligger til grund denne celle-mønster platform. At gøre det i fremtiden lover at udvide dens anvendelighed og specificitet. For eksempel kunne en »ikke-mønster 'cellelinje være genetisk modificeret til at udtrykke den fornødne adhæsionsmolekyle og derved fremme mønster.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af en Wellcome Trust Klinisk ph.d.-stipendium (ECAT).
Layout editor software package | e.g. CleWin 5.0 from WieWeb, http://www.wieweb.com/ns6/index.html | Capable of reading/writing CIF or GDS-II files. Used to create parylene design for photo mask manufacture | |
Bespoke photo mask | e.g. Compugraphics International Ltd, Glenrothes, Scotland, www.compugraphics-photomasks.com | Either fabricate in-house of facilities exist or commision | |
3" Silicon wafers | e.g. Siltronix, Archamps, France, http://www.siltronix.com | ||
Atmospheric horizontal furnace | e.g. Sandvik, http://www.mrlind.com | For oxidising silicon wafer | |
Small spot spectroscopic reflectometer | e.g. Nanometrics NanoSpec 3000 reflectometer, www.nanometrics.com/ | To measure depth of silicon dioxide layer | |
Silane adhesion promoter | e.g. Merck Silane A174 adhesion promoter. Merck Chemicals, www.merck-chemicals.de/ | 1076730050 | Pre-applied to wafer to encourage parylene deposition |
Parylene-C | e.g. Ultra Electronics, www.ultra-cems.com | ||
SCS Labcoter 2 deposition Unit, Model PDS2010 | SCS equipment, Surrye, UK, www.scscoatings.com/ | Model PDS2010 | |
Hexamethyldisilazane (HMDS) adhesion promoter | e.g. SpiChem, www.2spi.com | ||
Automated track system for dispensing photoresist on wafers. | e.g SVG (silicon Valley Group) 3 inch photo-resist track, | Automated track system for dispensing photoresist on wafers. A prime oven bakes the wafer and dispenses the adhesion promoter, HMDS. A combination spinner dispenses photoresist. Pre-bake oven cures the resist. | |
Photo-resist: Rohm & Haas | Rohm & Haas, www.rohmhaas.com/ | SPR350-1.2 positive photo-resist | |
Phot-mask aligner | e.g. Suss Microtech MA/BA8 mask aligner, www.suss.com | ||
Microchem MF-26A developer | Microchem MF-26A developer, www.microchem.com | Removes exposed reogions of photoresist | |
Plasma etch system | e.g. JLS RIE80 etch system, JLS Designs, www.jlsdesigns.co.uk | Removes exposed regions of parylene | |
Wafer dicing saw | e.g. DISCO DAD 680 Dicing Saw, DISCO Corporation, Japan, www.disco.co.jp | ||
Acetone | e.g. Fisher Scientific, www.fishersci.com/ | A929-4 | To wash off residual photoresist |
30% Hydrogen Peroxide | e.g. Sigma-Aldrich, www.sigmaaldrich.com | H1009 | |
98% Sulphuric Acid | e.g. Sigma-Aldrich, www.sigmaaldrich.com | 435589 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco-Invitrogen, www.invitrogen.com | 10437 | Standard chip activation. |
Hank's Balanced Salt Solution | Gibco-Invitrogen, www.invitrogen.com | 14170 |