פרוטוקול זה מתאר שיטת microfabrication התואם לדפוסי תא על SiO 2. עיצוב parylene-C מוגדר מראש מודפס photolithographically על SiO 2 הוופלים. תאים לאחר דגירה עם סרום (או פתרון הפעלה אחר) לדבוק במיוחד ל( ולגדול בהתאם להתאמה של) parylene-C שבבסיס, בעוד שנהדף על ידי SiO 2 אזורים.
פלטפורמות דפוסים תא לתמוך במטרות מחקר רחבות, כגון בניית רשתות עצביות במבחנה מוגדרת מראש והחקר של היבטים מרכזיים מסוימים של פיזיולוגיה הסלולר. כדי לשלב בקלות דפוסים תא עם Multi-אלקטרודה מערכים (MEAs) ושל "מעבדה על שבב" מבוסס סיליקון טכנולוגיות, נדרש פרוטוקול microfabrication התואם. אנו מתארים שיטה שמנצלת תצהיר של parylene-C פולימרים על SiO 2 הוופלים. Photolithography מאפשר דפוסים מדויקים ואמינים של parylene-C ברזולוציה ברמת מיקרון. הפעלה לאחר מכן על ידי טבילה בסרום שור העובר (או פתרון הפעלה ספציפי אחר) תוצאות במצע שבו תאים בתרבית לדבוק, או שנהדפו על ידי, parylene או SiO 2 אזורי בהתאמה. טכניקה זו אפשרה לדפוסים של מגוון רחב של סוגי תאים (כולל תאים ראשוניים עכבריים בהיפוקמפוס, שורת תאי HEK 293, teratocarcinoma כמו נוירון אדםשורת תאים, תאי גרגיר עיקריים עכבריים המוח הקטן, ותאי גזע דמוי אנושיים עיקריים הנגזר גליומה). מעניין לציין, עם זאת, הפלטפורמה היא לא אוניברסלית; המשקפת את החשיבות של מולקולות הדבקת תא ספציפי. תהליך הדפוסים תא זה חסכוני, אמין, וחשוב מכך ניתן לשלב microfabrication הסטנדרטי פרוטוקולים (ייצור שבבים), סולל את הדרך לשילוב של טכנולוגית המיקרואלקטרוניקה.
הבנת מנגנונים המכתיבים את הידבקות תא ודפוסים על חומרים סינטטיים היא חשובה עבור יישומים כגון הנדסת רקמות, גילוי תרופות, וייצור של biosensors 1-3. טכניקות רבות זמינות ומתפתח, כל ניצול של הגורמים ביולוגיים, כימיים ופיזיים עצום המשפיעים על הידבקות תא.
כאן אנו מתארים טכניקת תא דפוסים אשר מנצלת תהליכים פותחו בתחילה למטרות ייצור המיקרואלקטרוניקה. ככזה, הפלטפורמה היא ממוקם היטב על מנת לאפשר אינטגרציה במורד הזרם של טכנולוגיות מיקרואלקטרוניקה, כגון MEAs, לתוך פלטפורמת הדפוסים.
הממשק בין קרום תא וחומרים סמוכים הוא דו כיווני ומורכב. בvivo, חלבונים תאיים מטריקס יספק מבנה וכוח והשפעה על התנהגות תא באמצעות אינטראקציות עם רצפטורים הידבקות תא. בדומה לכך, תאים בvitro אינטראקציה עם מצעים סינטטיים באמצעות שכבות נספגו של חלבונים 4 תוך השפעות פיסיקלי כימיות גם לווסת את ההידבקות. לדוגמא, משטח פולימרים יכול להיות מוצג יותר "רטיבים" (הידרופילי) על ידי יונים או הקרנת אור אולטרה סגול, או תחריט על ידי טיפול עם 5 חומצה או הידרוקסיד. שיטות שהוקמו לדפוסי תא לנצל את אלה ומתווכי הידבקות תא אחרים. דוגמאות כוללות הזרקת דיו מדפיסה 6, microcontact ביול 7, חוסר תנועה פיזית 8, מיקרופלואידיקה 9, בזמן אמת מניפולציה 10, ודפוסים סלקטיבית מולקולריים הרכבה (SMAP) 11. לכל אחד יש יתרונות ומגבלות מסוימים. נהג מפתח בעבודה שלנו, לעומת זאת, הוא לשלב את הדפוסים תא עם מערכות מיקרו (MEMS).
MEMS מתייחס למכשירים מכאניים קטנים מאוד מונעים על ידי חשמל. זה חופף לשווה הערך בקנה מידה ננומטרי, nanoelectromechמערכות anical. מושג זה הפך למעשי רק כאשר אסטרטגיות של מוליכים למחצה אפשרו ייצור להתקיים במידה הזעירה. טכניקות microfabrication פותחו במקור עבור מוליכים למחצה ואלקטרוניקה בטעות נמצאו מועילות לשימושים אחרים כגון אלקטרופיזיולוגיה הסלולרית, למשל. מטרה במורד הזרם מרכזית היא לשלב טכנולוגיות מיקרואלקטרוניקה כזה עם תהליך באיכות גבוהה דפוסים תא (להרכיב מכשיר BIOMEMS). כמה טכניקות תא דפוסים קיימות ואחרת אמינות ומעשיות אינן מתיישבות עם הרעיון הזה. לדוגמא, יישור מדויק של כל המיקרואלקטרוניקה או biosensors מוטבעים הוא יסוד ליעילות שלהם, אבל קשה מאוד להשיג באמצעות טכניקה כמו רקיעת microcontact.
כדי לעקוף בעיה זו, אנו עובדים על פלטפורמת דפוסים מבוססת 2 SiO המשתמשת מודפס photolithographically parylene-C. Photolithography כרוך העברה של תכונות גיאומטריים שלמסכה למצע באמצעות תאורת UV. מסכה מיועדת באמצעות תכנית תכנון בעזרת מחשב מתאים. על צלחת זכוכית, שכבה דקה של כרום לא שקוף מייצגת את הדגם הגיאומטרי הרצוי (ברזולוציה תכונה של 1-2 מ"מ אפשרית). המצע להיות בדוגמת מצופה בשכבה דקה של photoresist (פולימר UV רגיש). מצופה הפולימר אז מיושר והביא במגע קרוב עם המסכה. מקור UV מיושם כך שאזורים לא מוגנים הם מוקרנים ולכן הופכים מסיסים ונשלפים בשלב ההתפתחות הבא, ומשאיר ייצוג parylene-C של דפוס המסכה שמאחורי. תהליך זה מקורו בפיתוח של התקני מוליכים למחצה. ככזה, פרוסות סיליקון משמשות לעתים קרובות כמצע. בתצהיר photolithographic של parylene-C ב SiO 2 הוא ומכאן תהליך פשוט ואמין כי באופן שיגרתי מתקיים במתקני חדר נקי המיקרואלקטרוניקה.
בעוד parylene ישכמה מאפייני bioengineering רצויים (אינרטי מבחינה כימית, שאינו פריק ביולוגי), גורם המגביל את שימושה הישיר בדפוסי תא הוא הדביקות שלה עני מולד התא, המיוחסת בחלקו להידרופוביות הקיצונית שלה. עם זאת, parylene-C כבר בעבר בשימוש באופן עקיף לדפוסי תא, למשל כתבנית סלולרית קליפה משם 12,13. גישה זו היא מוגבלת על ידי רזולוציה נמוכה ודורשת שלבים מרובים. התהליך שתואר כאן במקום מנצל צעד לחרוט חומצה, ואחריו דגירה בסרום, על מנת להבטיח שאזורי parylene-C הופכים לתא מודבק, באמצעות שילוב של ירידה בחלבון הידרופוביות וסרום מחייב.
התוצאה הסופית היא מבנה מורכב משני מצעים שונים אשר, לאחר הפעלה ביולוגית, להפגין מאפייני ציטומגלווירוס דבק או ציטומגלווירוס הדוחה בהתאמה וכך מייצג פלטפורמת תיפוף תא יעילה. חשוב לציין, שאין צורך להציג את AG הביולוגיתמציג לתוך מתקן החדר הנקי כניתן לאחסן מצעים בדוגמת הגבלת זמן לפני השימוש (ואז הם מופעלים באמצעות סרום שור העובר או פתרון הפעלה אחר).
פלטפורמת הדפוסים parylene-C/SiO 2 זהו אפוא מועמד טוב לקואליציה עם רכיבי MEMS, כמו תהליכי הייצור כל כך במראה באופן הדוק אלה המשמשים לייצור המיקרואלקטרוניקה.
טבילה של שבבים בחומצה פיראניה משמשת לא רק כדי להסיר כל חומר אורגני השיורי אלא גם חורטת משטחי המצע. זה הוא מפתח המאפשר הפעלה יעילה עם סרום שור העובר. אם לא יעשה כך מונע תא דפוסים ועמוקים משנה את התנהגות תא על שבב. אין דרישה לעקר שבבים לאחר ניקוי עם חומצת פיראניה. אכן עיקור על ידי חשיפה לקרינת UV הוכח לערער דפוסים תא באופן תלוי מינון 13. יש להקפיד לשטוף את כל photoresist הנותרת לאחר תהליך photolithographic. photoresist מתמיד יכול לשמש כשכבת ציטומגלווירוס דבק לא רצויה שעוקפת דפוסים מוכתבים על ידי parylene-C/SiO 2 גיאומטריה. אצטון הוא יעיל כאשר משתמשים בתהליך photolithographic שתואר לעיל ועם חומרים כימיים שצוינו. עם זאת, סוגים אחרים של photoresist עשויים לדרוש ממס שונה.
כדי להעריך את ההשפעה והצלחה של differeצעדי ייצור NT, זווית המגע של שני מצעים מנוגדים ניתן למדוד. איור 2 ממחיש את השינויים המתרחשים במהלך תהליך הפעלת שבב. סביר להניח, עם זאת, כי דבק ספציפי ורכיבי חלבון דוחים בסרום סופו של דבר לאפשר את השבב בדוגמת parylene להפעיל מאפייני ציטומגלווירוס דבק או ציטומגלווירוס הדוחה שלו בהתאמה.
כל תוצאות הנציג משמשות שבבים בעובי parylene של 100 ננומטר, למרות שיש לנו בהצלחה בדוגמת באמצעות שכבות parylene גם עבות יותר ודקות יותר. חשוב לציין, טכניקת תחריט photolithographic זו מאפשרת שליטה תלת ממדים גדולות הרבה יותר של תצורת parylene מזה מודגם כאן. לדוגמא, באמצעות שילוב של photomasks, ניתן ליצור אזורי parylene מעורב עובי. זו פותחת את הדרך ליצירת תרביות תאים עם טופוגרפיה תלת ממדית מוגדרת, הולכת מעבר לאזורים פשוט מכתיבים של הידבקות תא / repulשיאון, באופן פוטנציאלי מציע אמצעי לשילוב ערוצי microfluidic לתוך המבנה.
כפי שניתן לראות, עם זאת, פלטפורמת דפוסים זה לא אוניברסלי יעילה על פני סוגי תאים. שורות תאים שונות, עם פרופילי המולקולה שלהם המגוונים הידבקות תא, באופן לא מפתיע מתנהגות בצורה שונה כאשר בתרבית בפלטפורמה זו. עדיין לא זיהינו את המרכיבים העיקריים בסרום, ולא את הקולטנים בתא קרום הטיפוח, אשר ביסודה של פלטפורמה סלולארי דפוסים זה. ותעשה זאת בעתיד מבטיח להרחיב את השירות ואת הספציפיות שלה. לדוגמא, שורת תאים "אינם דפוסים 'יכולה להיות מהונדס גנטית כדי לבטא את מולקולת ההידבקות הנדרשת וכך לקדם את הדפוסים.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מענק קרן Wellcome דוקטורט קליני (ECAT).
Layout editor software package | e.g. CleWin 5.0 from WieWeb, http://www.wieweb.com/ns6/index.html | Capable of reading/writing CIF or GDS-II files. Used to create parylene design for photo mask manufacture | |
Bespoke photo mask | e.g. Compugraphics International Ltd, Glenrothes, Scotland, www.compugraphics-photomasks.com | Either fabricate in-house of facilities exist or commision | |
3" Silicon wafers | e.g. Siltronix, Archamps, France, http://www.siltronix.com | ||
Atmospheric horizontal furnace | e.g. Sandvik, http://www.mrlind.com | For oxidising silicon wafer | |
Small spot spectroscopic reflectometer | e.g. Nanometrics NanoSpec 3000 reflectometer, www.nanometrics.com/ | To measure depth of silicon dioxide layer | |
Silane adhesion promoter | e.g. Merck Silane A174 adhesion promoter. Merck Chemicals, www.merck-chemicals.de/ | 1076730050 | Pre-applied to wafer to encourage parylene deposition |
Parylene-C | e.g. Ultra Electronics, www.ultra-cems.com | ||
SCS Labcoter 2 deposition Unit, Model PDS2010 | SCS equipment, Surrye, UK, www.scscoatings.com/ | Model PDS2010 | |
Hexamethyldisilazane (HMDS) adhesion promoter | e.g. SpiChem, www.2spi.com | ||
Automated track system for dispensing photoresist on wafers. | e.g SVG (silicon Valley Group) 3 inch photo-resist track, | Automated track system for dispensing photoresist on wafers. A prime oven bakes the wafer and dispenses the adhesion promoter, HMDS. A combination spinner dispenses photoresist. Pre-bake oven cures the resist. | |
Photo-resist: Rohm & Haas | Rohm & Haas, www.rohmhaas.com/ | SPR350-1.2 positive photo-resist | |
Phot-mask aligner | e.g. Suss Microtech MA/BA8 mask aligner, www.suss.com | ||
Microchem MF-26A developer | Microchem MF-26A developer, www.microchem.com | Removes exposed reogions of photoresist | |
Plasma etch system | e.g. JLS RIE80 etch system, JLS Designs, www.jlsdesigns.co.uk | Removes exposed regions of parylene | |
Wafer dicing saw | e.g. DISCO DAD 680 Dicing Saw, DISCO Corporation, Japan, www.disco.co.jp | ||
Acetone | e.g. Fisher Scientific, www.fishersci.com/ | A929-4 | To wash off residual photoresist |
30% Hydrogen Peroxide | e.g. Sigma-Aldrich, www.sigmaaldrich.com | H1009 | |
98% Sulphuric Acid | e.g. Sigma-Aldrich, www.sigmaaldrich.com | 435589 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco-Invitrogen, www.invitrogen.com | 10437 | Standard chip activation. |
Hank's Balanced Salt Solution | Gibco-Invitrogen, www.invitrogen.com | 14170 |