このプロトコルは、SiO 2のセルパターニングのための微細加工と互換性のある方法を記載している。事前に定義されたパリレン-Cの設計は、フォトリソグラフィによってSiO 2のウェハ上に印刷されています。血清(または他の活性化溶液)とのインキュベーション後の細胞を特異的に接着し(との適合性に応じて成長する)はSiO 2領域によって撃退されながら、基礎となるパリレン-C、。
セルパターニングプラットフォームは、このような事前定義されたin vitroでの神経細胞のネットワークの構築および細胞生理学の一定の中央側面の探査など幅広い研究目標をサポートしています。簡単に多電極アレイ(MEAの)との細胞のパターニングを組み合わせることや技術のシリコンベースの「チップ上の実験室」は、微細加工と互換性のあるプロトコルが必要となります。我々は、SiO 2ウエハ上のポリマーパリレン-Cの堆積を利用する方法を記載している。フォトリソグラフィは、ミクロンレベルの解像度でパリレン-Cの正確で信頼性の高いパターン形成を可能にします。ウシ胎児血清(または他の特異的活性化溶液)に浸漬することによりその後の活性化培養細胞に付着するか、またはそれぞれパリレンまたはSiO 2領域によって反発された基板が得られる。この技術は、初代マウス海馬細胞、HEK 293細胞株、ヒト神経様奇形癌を含む細胞型(広い範囲のパターニング可能にした細胞株、初代マウス小脳顆粒細胞、および初代ヒト神経膠腫由来の幹細胞様の細胞)。しかしながら、興味深いことに、プラットフォームは、普遍的ではないであり;細胞特異的接着分子の重要性を反映している。この細胞パターニング工程は、信頼できる費用効果的であり、重要なマイクロエレクトロニクス技術の統合のための道を開き、標準的な微細加工(チップ製造)プロトコルに組み込むことができる。
合成材料に細胞接着やパターニングを決定メカニズムを理解することは、組織工学、創薬、およびバイオセンサー1-3の製作などのアプリケーションのために重要である。多くの技術が利用可能であり、進化している、細胞接着に影響を与える無数の生物化学的、および物理的因子の各々を活かし。
ここでは、最初にマイクロエレクトロニクス製造のために開発されたプロセスを利用した細胞パターニング技術を記載している。このように、プラットフォームは、パターン化プラットフォームに、このような多国間環境協定のような超小型電子技術の下流の統合を可能にするためによく置かれている。
細胞膜と隣接する材料との間のインターフェースは、双方向かつ複雑である。 インビボにおいて 、細胞外マトリックスタンパク質は、構造及び強度と細胞接着受容体との相互作用を介して細胞挙動に影響を与える。 Vにおいても同様に、細胞物理化学的な影響にも接着力を調節しながらitroタンパク質4の吸収された層を介して合成基質と相互作用します。例えば、ポリマー表面は、イオンや紫外線照射、または酸もしくは水酸化5での処理によるエッチングによって(親水性)以上の「湿潤性」にすることができる。細胞パターニングのための確立された方法は、これらおよび他の細胞接着メディエーターを利用する。例としては、インクジェット6を印刷、マイクロ7スタンピング 、物理的な固定化8、マイクロフルイディクス9、リアルタイムの操作10、および選択的な分子集合体のパターニング(SMAP)11が含まれています。それぞれが特定の利点と制限があります。我々の仕事で重要なドライバは、しかし、微小電気機械システム(MEMS)を用いて細胞のパターン化を統合することです。
MEMSは、電気で駆動さ非常に小さい機械装置を参照してください。これは、ナノスケールの当量nanoelectromechに重なっanicalシステム。この概念は、半導体戦略はマイクロスケールで行われるように製作を可能にした場合にのみ実用的になりました。半導体エレクトロニクスのために独自に開発した微細加工技術が誤って、例えば、セルラ電気生理学など、他の用途に有用であることが見出された。重要な下流の目的は、(バイオMEMSデバイスを形成する)高忠実度セルパターニングプロセスでそのようなマイクロエレクトロニクス技術を組み合わせることである。いくつかの既存の、そうでなければ、信頼性の高い実用的な細胞パターニング技術は、この考え方と互換性がありません。例えば、任意の埋め込まれたマイクロエレクトロニクスやバイオセンサーの正確な位置合わせは、それらの有効性の基本であるが、このようなマイクロスタンピングのような技術を用いて達成することは極めて困難である。
この問題を回避するために、我々はフォトリソグラフィで印刷されたパリレン-Cを使用していますSiO 2系のパターン形成のプラットフォームに取り組んでいます。フォトリソグラフィは、からの幾何学的特徴の移動を含むUV照射を介して基板にマスク。マスクは、適切なコンピュータ支援設計プログラムを用いて設計される。ガラス板の際に、不透明なクロムの薄層は、所望の幾何学的パターンを(1-2程度の特徴の解像度が可能である)を表す。パターン形成される基板は、フォトレジストの薄層(UV感受性ポリマー)でコーティングされている。コーティングされたポリマーは、その後、位置合わせされたマスクに密着する。 UV源は、非保護領域が照射されるように適用され、従って背後にマスクパターンのパリレン-C表現を残して、次の現像工程で可溶性およびリムーバブルなっている。このプロセスは、半導体デバイスの開発時に始まった。このように、シリコンウェーハは、しばしば、基板として使用される。 SiO 2上パリレン-Cのフォトリソグラフィ堆積は、それゆえ、日常のマイクロエレクトロニクスクリーンルーム施設内で 行われる簡単で信頼性の高いプロセスである。
パリレンはきたが(非生分解性、化学的に不活性な)いくつかの望ましい生体工学特性、細胞のパターニングでの直接の使用を制限する要因は、その極度の疎水性に一部起因し、その本質的に貧弱な細胞接着性である。それにもかかわらず、パリレン-Cは、以前に剥ぎ取りセルラ鋳型12,13として、例えば、細胞パターン形成のために間接的に使用されている。このアプローチは、貧しい人々の解像度によって制限され、複数の手順を必要としている。代わりに、ここで説明する処理は、そのパリレン-Cの領域を確保するために、血清のインキュベーションに続いて、酸エッチングステップを利用する疎水性の減少および血清タンパク質結合の組み合わせを介して、細胞接着になる。
最終結果は、生物学的活性化後に、それぞれのインサイト、接着剤またはインサイト反発特性を発揮し、従って有効な細胞パターニングプラットフォームを表し、二つの異なる基材からなる構築物である。重要なことに、生物学的AGを導入する必要はない(これらは、ウシ胎児血清または他の活性化溶液を用いて活性化されるところ)パターン化された基質としてクリーンルーム設備にエントは、使用前に無期限に保存することができる。
製造プロセスは、非常に密接に超小型電子製造に使用されているものを鏡として、このparylene-C/SiO 2パターン化プラットフォームは、そのためのMEMS構成要素との連立のための良い候補である。
ピラニア酸中のチップの浸漬は、任意の残留有機材料を除去するだけでなく機能するだけでなく、基板表面をエッチングする。これはウシ胎児血清で効果的な活性化を可能にするための鍵となります。これを怠ると、細胞のパターニングを防ぎ、深く、オンチップ細胞の挙動を変更します。ピラニア酸で洗浄後にチップを滅菌する必要はない。実際、UV照射による滅菌は、用量依存様式で細胞13のパターニングを弱体化させることが示されている。ケアは、フォトリソグラフィ工程の後に、すべての残留フォトレジストを洗い流すように注意しなければならない。持続フォトレジストはparylene-C/SiO 2形状によって決まるパターン化を優先します不要なCYTO接着層として機能することができます。指定された試薬を用いて説明した上記およびフォトリソグラフィプロセスを使用するとき、アセトンは有効である。しかし、フォトレジストの他のタイプの異なる溶媒が必要な場合があります。
のdiffereの影響と成功を評価するために、ntの製造工程、対照的な二つの基板の接触角を測定することができる。 図2は、チップの活性化プロセス中に発生する変化を示す。これは、血清中の特定の接着剤と反発タンパク質成分は、最終的にそれぞれのCYTO-接着剤またはインサイト·反発特性を発揮するためにパリレンパターン化されたチップを有効にすることを、しかし、可能性があります。
我々は正常に厚く、より薄いパリレン層の両方を使用してパターン化しているものの、すべての代表的な結果は、100nmのパリレン厚でチップを用いる。重要なことに、このフォトリソグラフィエッチング技術は、ここに示されるものとはパリレン構成のはるかに大きな三次元の制御を可能にする。例えば、フォトマスクの組み合わせを用いて、混合の厚さのパリレン領域を作成することが可能である。これは、細胞接着/ repul単に口述領域を越えて行く、定義された三次元地形で細胞培養物を作成するための道を開くシオンは、潜在的に構築物にマイクロ流体チャネルを統合する手段を提供しています。
図示のように、しかしながら、このパターニングプラットフォームは、細胞タイプにわたって普遍的に有効ではない。ときは、このプラットフォーム上で培養した種々の細胞株は、彼らの様々な細胞接着分子のプロファイルと、当然異なる動作をします。私たちは、まだこの細胞パターニングプラットフォームを支える血清中の主要コンポーネント、また無料の細胞膜受容体を、確認されていません。将来的にこれを行うと、その有用性と特異性を広げることを約束。例えば、「非パターニング '細胞株は遺伝的に必要な接着分子を発現するので、パターニングを促進するために変更することができる。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、ウェルカムトラスト臨床博士フェローシップ(ECAT)によってサポートされていました。
Layout editor software package | e.g. CleWin 5.0 from WieWeb, http://www.wieweb.com/ns6/index.html | Capable of reading/writing CIF or GDS-II files. Used to create parylene design for photo mask manufacture | |
Bespoke photo mask | e.g. Compugraphics International Ltd, Glenrothes, Scotland, www.compugraphics-photomasks.com | Either fabricate in-house of facilities exist or commision | |
3" Silicon wafers | e.g. Siltronix, Archamps, France, http://www.siltronix.com | ||
Atmospheric horizontal furnace | e.g. Sandvik, http://www.mrlind.com | For oxidising silicon wafer | |
Small spot spectroscopic reflectometer | e.g. Nanometrics NanoSpec 3000 reflectometer, www.nanometrics.com/ | To measure depth of silicon dioxide layer | |
Silane adhesion promoter | e.g. Merck Silane A174 adhesion promoter. Merck Chemicals, www.merck-chemicals.de/ | 1076730050 | Pre-applied to wafer to encourage parylene deposition |
Parylene-C | e.g. Ultra Electronics, www.ultra-cems.com | ||
SCS Labcoter 2 deposition Unit, Model PDS2010 | SCS equipment, Surrye, UK, www.scscoatings.com/ | Model PDS2010 | |
Hexamethyldisilazane (HMDS) adhesion promoter | e.g. SpiChem, www.2spi.com | ||
Automated track system for dispensing photoresist on wafers. | e.g SVG (silicon Valley Group) 3 inch photo-resist track, | Automated track system for dispensing photoresist on wafers. A prime oven bakes the wafer and dispenses the adhesion promoter, HMDS. A combination spinner dispenses photoresist. Pre-bake oven cures the resist. | |
Photo-resist: Rohm & Haas | Rohm & Haas, www.rohmhaas.com/ | SPR350-1.2 positive photo-resist | |
Phot-mask aligner | e.g. Suss Microtech MA/BA8 mask aligner, www.suss.com | ||
Microchem MF-26A developer | Microchem MF-26A developer, www.microchem.com | Removes exposed reogions of photoresist | |
Plasma etch system | e.g. JLS RIE80 etch system, JLS Designs, www.jlsdesigns.co.uk | Removes exposed regions of parylene | |
Wafer dicing saw | e.g. DISCO DAD 680 Dicing Saw, DISCO Corporation, Japan, www.disco.co.jp | ||
Acetone | e.g. Fisher Scientific, www.fishersci.com/ | A929-4 | To wash off residual photoresist |
30% Hydrogen Peroxide | e.g. Sigma-Aldrich, www.sigmaaldrich.com | H1009 | |
98% Sulphuric Acid | e.g. Sigma-Aldrich, www.sigmaaldrich.com | 435589 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco-Invitrogen, www.invitrogen.com | 10437 | Standard chip activation. |
Hank's Balanced Salt Solution | Gibco-Invitrogen, www.invitrogen.com | 14170 |