Этот протокол описывает способ микротехнологий-совместимый для клеток паттерна на SiO 2. Предопределенный дизайн парилен-С фотолитографически напечатаны на SiO 2 пластин. После инкубации с сывороткой (или другого решения активации) клетки придерживаться специально для (и расти в соответствии с соответствием), лежащей в основе Parylene-C, в то время как отбиваясь от SiO 2 регионах.
Сотовый паттерна платформы поддерживают широкие исследовательские цели, такие, как строительство предопределенных нейронных сетей в пробирке и изучения некоторых центральных аспектов клеточной физиологии. Чтобы легко комбинировать клеток паттерна с многоэлектродной массивов (МПС) и на основе кремния "лаборатории на чипе» технологий, протокол микротехнологий-совместимая требуется. Мы опишем метод, который использует осаждение полимера Parylene-C на SiO 2 пластин. Фотолитография позволяет точную и достоверную паттерна Parylene-C с разрешением микронного уровня. После активации путем погружения в эмбриональной телячьей сыворотки (или другого конкретного активирующего раствора) приводит к подложке, в котором культивируемые клетки придерживаться, или отталкивает, парилена или SiO 2 областей соответственно. Эта методика позволила паттерна в широком диапазоне типов клеток (в том числе первичных мышиных клеток гиппокампа, HEK 293 клеточной линии, человеческий нейрон-подобных тератокарциномыклеточная линия, первичные мышиные гранулярных клеток мозжечка, и первичные человека глиомы стволовые-подобные клетки). Интересно, однако, платформа не является универсальным; отражает важность клеточных конкретных молекул адгезии. Этот процесс клеточной рисунка является экономически эффективным, надежным и, что важно, могут быть включены в стандартный микротехнологий (производственные чип) протоколы, прокладывая путь для интеграции микроэлектронной технологии.
Понимание механизмов, которые диктуют клеточную адгезию и формирование паттерна на синтетических материалов имеет важное значение для приложений, таких как тканевой инженерии, лекарственных препаратов, а также изготовления биосенсоров 1-3. Многие методы доступны и развивается, каждый из которых принимает преимущество из множества биологических, химических и физических факторов, которые влияют на клеточную адгезию.
Здесь мы описываем технику клеток-паттерна, который использует процессы изначально разработанные для микроэлектронных целей изготовления. Таким образом, платформа занимает хорошее положение для того, чтобы вниз по течению интеграции микроэлектронных технологий, таких как МПС, в паттерна платформы.
Интерфейс между мембраной клетки и смежной материала является двунаправленным и сложным. В естественных условиях, белки внеклеточного матрикса обеспечивают структуру и прочность и воздействие на поведение клеток через взаимодействие с рецепторами клеточной адгезии. Аналогичным образом, клетки в VИтро взаимодействовать с синтетических субстратов через поглощенных слоев белков 4 в то время как физико-химические влияет также модулировать адгезию. Например, полимер поверхность может быть оказана более "смачиваемые" (гидрофильные) ионами или ультрафиолетового облучения светом, или травлением путем обработки кислотой или гидроксида 5. Штатные методы клеточной паттерна воспользоваться этим и другим клеточной адгезии посредников. Примеры включают струйной печати 6, микроконтактная штамповки 7, физической иммобилизации 8, микрофлюидики 9, в режиме реального времени управлять 10 и селективного молекулярного кучность сборки (SMAP) 11. Каждый из них имеет специфические преимущества и недостатки. Ключевым фактором в нашей работе, однако, заключается в интеграции клеток паттерна с микроэлектромеханических систем (MEMS).
MEMS см. чрезвычайно малых механических устройств, управляемых электроэнергии. Это пересекается с наноразмерных эквивалентной, nanoelectromechветствующий квантовомеханический системы. Эта концепция стала практическая только тогда, когда полупроводниковые стратегии включен изготовление пройдет на микроуровне. Методы микротехнологий, разработанные первоначально для полупроводниковой электроники непреднамеренно оказалась полезной для других целей, таких как сотовые электрофизиологических, например. Ключевым вниз целью является объединить такие микроэлектронных технологий с процессом клеточного паттерна высокой точностью (формирование устройство bioMEMS). Несколько существующих и иным надежные и практические методы клеточной паттерна несовместимы с этой идеей. Например, точное выравнивание ни встроенных микроэлектроники или биосенсоров лежит в основе их эффективности, но чрезвычайно трудно достичь с использованием методики, такие как микроконтактной тиснения.
Чтобы обойти эту проблему, мы работаем на SiO 2 на основе паттерна платформы, которая использует фотолитографически печатную Parylene-C. Фотолитография включает передачу геометрических характеристик отМаска на подложку через УФ-освещении. Маска разработан с использованием соответствующей программы автоматизированного проектирования. После стеклянную пластину, тонкий слой непрозрачной хрома представляет желаемый геометрический рисунок (разрешение особенностью 1-2 мм возможно). Подложка быть с узором покрыта тонким слоем фоторезиста (УФ-чувствительного полимера). Полимерным покрытием затем выровнена и приведены в тесном контакте с маской. Источник УФ наносят таким образом, что незащищенные участки облучают и, следовательно, становится растворимым и съемный на следующей стадии развития, оставляя парилен-C представление шаблоне маски позади. Этот процесс возник в процессе разработки полупроводниковых приборов. Таким образом, кремниевые пластины часто используют в качестве субстрата. Фотолитографическое отложение Parylene-C на SiO 2, следовательно, простой и надежный процесс, который обычно происходит в микроэлектронных объектов чистых помещений.
В то время как парилен имеетнесколько желательные характеристики биоинженерии (химически инертен, не к биологическому разложению), фактором, ограничивающим ее непосредственное использование в клеточной паттерна является его врожденно бедных адгезия клеток, частично отнести на его крайней гидрофобность. Тем не менее, парилен-С ранее использовалось косвенно для сотового паттерна, например, в виде корки на выезде сотовой шаблона 12,13. Этот подход ограничивается низким разрешением и требует нескольких шагов. Способ, описанный здесь, а не использует кислота Стадия травления, а затем в сыворотке инкубации, чтобы гарантировать, что парилен C-области становятся клеток клей, с помощью комбинации снижением гидрофобности и сывороточного белка привязки.
Конечный результат представляет собой конструкцию, состоит из двух различных подложках, которые после биологической активации, проявляются соответствующие цито-клеевые или цито-отталкивающим характеристики и так представляет эффективную платформу клеток стучит. Важно отметить, что нет необходимости вводить биологическую AGЭнты в чистых помещениях объекта, как узорчатые субстраты можно хранить неопределенно долго до использования (после чего они активированы с помощью фетальной бычьей сыворотки или другое решение активации).
Это parylene-C/SiO 2 рисунка платформа поэтому является хорошим кандидатом для коалиции с компонентов МЭМС, так как процессы изготовления так тесно зеркало тех, которые используются для микроэлектронной изготовления.
Погружение чипов в пираньи кислоты служит не только для удаления остатков органических материалов, но и вытравливает поверхностей подложек. Это ключ к создания условий для эффективного активацию с эмбриональной телячьей сыворотки. Невыполнение этого требования предотвращает клеточную кучность и глубоко изменяет поведение клеток на чипе. Там нет требования, чтобы стерилизовать фишки после очистки пираньи кислоты. Действительно стерилизация ультрафиолетового облучения было показано подорвать клеток паттерна в зависимости от дозы 13. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы смыть все остатки фоторезиста после процесса фотолитографии. Сохранение фоторезиста может выступать в качестве нежелательного цито-клей слоя, который переопределяет кучность продиктованный parylene-C/SiO 2 геометрии. Ацетон является эффективным при использовании процесса фотолитографии описанное выше и с реагентами, указанными. Тем не менее, другие типы фоторезиста может потребовать иного растворителя.
Для оценки влияния и успех DiffereNT шаги изготовления, угол контакта из двух контрастных субстратов могут быть измерены. Рисунок 2 иллюстрирует изменения, которые происходят в процессе активации чип. Вполне вероятно, однако, что конкретные клей и отталкивания белковые компоненты в сыворотке в конечном счете, позволит Parylene узором чип, чтобы приложить соответствующие цито-клеевые или цито-отталкивающим характеристики.
Все представительные результаты используются чипы с толщиной Parylene 100 нм, хотя мы успешно рисунком с использованием как более толстые и более тонкие слои Parylene. Важно, что это фотолитографии травление методика позволяет значительно больший трехмерный контроль конфигурации Parylene, чем показано здесь. Например, используя комбинацию фотошаблонов, можно создать Parylene области смешанного толщины. Это открывает путь к созданию клеточных культур с определенной трехмерной топографии, выходящие за рамки просто диктуют регионах клеточной адгезии / отталкиванияСион, потенциально предлагая средства интеграции микрофлюидных каналов в конструкции.
Как показано, однако, это рисунка платформа не универсально эффективны для разных типов клеток. Различные клеточные линии, с их разнообразными клеточной адгезии профилей молекулы, что неудивительно себя по-разному при культивировании на этой платформе. Мы еще не определили ключевые компоненты в сыворотке, ни бесплатные клеточную мембрану рецепторы, которые лежат в основе этой клеточной паттерна платформу. Это в будущем обещает расширить его полезность и специфичность. Например, "не-паттерна 'клеточная линия может быть генетически модифицированы, чтобы выразить необходимой адгезии и таким образом способствовать паттерна.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Доверия Wellcome клинической PhD общения (ECAT).
Layout editor software package | e.g. CleWin 5.0 from WieWeb, http://www.wieweb.com/ns6/index.html | Capable of reading/writing CIF or GDS-II files. Used to create parylene design for photo mask manufacture | |
Bespoke photo mask | e.g. Compugraphics International Ltd, Glenrothes, Scotland, www.compugraphics-photomasks.com | Either fabricate in-house of facilities exist or commision | |
3" Silicon wafers | e.g. Siltronix, Archamps, France, http://www.siltronix.com | ||
Atmospheric horizontal furnace | e.g. Sandvik, http://www.mrlind.com | For oxidising silicon wafer | |
Small spot spectroscopic reflectometer | e.g. Nanometrics NanoSpec 3000 reflectometer, www.nanometrics.com/ | To measure depth of silicon dioxide layer | |
Silane adhesion promoter | e.g. Merck Silane A174 adhesion promoter. Merck Chemicals, www.merck-chemicals.de/ | 1076730050 | Pre-applied to wafer to encourage parylene deposition |
Parylene-C | e.g. Ultra Electronics, www.ultra-cems.com | ||
SCS Labcoter 2 deposition Unit, Model PDS2010 | SCS equipment, Surrye, UK, www.scscoatings.com/ | Model PDS2010 | |
Hexamethyldisilazane (HMDS) adhesion promoter | e.g. SpiChem, www.2spi.com | ||
Automated track system for dispensing photoresist on wafers. | e.g SVG (silicon Valley Group) 3 inch photo-resist track, | Automated track system for dispensing photoresist on wafers. A prime oven bakes the wafer and dispenses the adhesion promoter, HMDS. A combination spinner dispenses photoresist. Pre-bake oven cures the resist. | |
Photo-resist: Rohm & Haas | Rohm & Haas, www.rohmhaas.com/ | SPR350-1.2 positive photo-resist | |
Phot-mask aligner | e.g. Suss Microtech MA/BA8 mask aligner, www.suss.com | ||
Microchem MF-26A developer | Microchem MF-26A developer, www.microchem.com | Removes exposed reogions of photoresist | |
Plasma etch system | e.g. JLS RIE80 etch system, JLS Designs, www.jlsdesigns.co.uk | Removes exposed regions of parylene | |
Wafer dicing saw | e.g. DISCO DAD 680 Dicing Saw, DISCO Corporation, Japan, www.disco.co.jp | ||
Acetone | e.g. Fisher Scientific, www.fishersci.com/ | A929-4 | To wash off residual photoresist |
30% Hydrogen Peroxide | e.g. Sigma-Aldrich, www.sigmaaldrich.com | H1009 | |
98% Sulphuric Acid | e.g. Sigma-Aldrich, www.sigmaaldrich.com | 435589 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco-Invitrogen, www.invitrogen.com | 10437 | Standard chip activation. |
Hank's Balanced Salt Solution | Gibco-Invitrogen, www.invitrogen.com | 14170 |