Bu protokol, SiO 2 hücre modelleme için bir mikroimalat uyumlu bir yöntemi tarif etmektedir. Önceden tanımlanmış bir parylene C dizayn photolithographically SiO 2 gofret yazdırılır. Serum (veya başka bir etkinleştirme solüsyonu) ile inkübasyondan sonra hücreler için özel olarak uygun (ve uygun göre gelişir) SiO 2 bölgeleri ile püskürtüldü olmak iken esas parylene,-C,.
Hücre desenlendirme platformlar gibi önceden tanımlanmış in vitro nöron ağlarının inşası ve hücresel fizyoloji bazı merkezi yönlerinin keşfi gibi geniş bir araştırma hedeflerini destekleyecek. Kolayca Multi-elektrot dizilerde (Taraflı) ile hücre modelli birleştirmek ve teknolojilere silikon esaslı 'bir çipin üzerinde laboratuvar', bir mikroimalat uyumlu protokol gereklidir. Biz SiO 2 Levhalarda polimer parylene C birikmesini kullanan bir yöntem tarif eder. Fotolitografi mikron düzeyinde çözünürlükte parylene C doğru ve güvenilir desenlendirme sağlar. Fetal sığır serumu (ya da başka bir özel aktivasyon çözeltisi) kültürlenmiş hücreler için uygun, ya da sırasıyla Parylene veya SiO 2 bölge ile püskürtüldü edildiği bir alt-tabaka içinde sonuç daldırılarak sonraki aktivasyonu. Bu teknik, birinci murin hipokampal hücreleri, HEK 293 hücre hattı, insan nöron gibi teratokarsinoma hücre tipleri de dahil olmak üzere (geniş bir yelpazede yapı model sağladıhücre soyu, ana murin serebellar granül hücrelerinde ve primer insan glioma türetilmiş kök-benzeri hücreler). İlginç bir şekilde, bununla birlikte, platform genel değil, hücreye özel yapışma moleküllerinin önemini yansıtmaktadır. Bu hücre desenlendirme süreç, güvenilir, maliyet etkin olduğunu, ve önemlisi mikroelektronik teknoloji entegrasyonu için önünü, standart Mikrofabrikasyona içine (çip üretim) protokolleri dahil edilebilir.
Sentetik malzemeler ile hücre yapışması ve model dikte mekanizmaların anlaşılması, doku mühendisliği, ilaç keşfi ve biyosensör 1-3 imalatı gibi uygulamalar için önemlidir. Birçok teknik mevcuttur ve gelişmekte olan hücre yapışmasını etkileyen sayısız, kimyasal, biyolojik ve fiziksel faktörlerin her yararlanarak.
Burada, biz başlangıçta mikroelektronik üretim amaçlı geliştirilen yöntemler kullanır, bir hücre-desenleme tekniği açıklar. Gibi, bir platform desenleme platformu içine, örneğin ÇÇA gibi mikroelektronik teknolojileri, mansap entegrasyonu sağlamak için iyi yerleştirilmiş.
, Bir hücre zarı ve bir bitişik malzeme arasında arayüz iki yönlü ve karmaşıktır. İn vivo olarak, hücre dışı matris proteinleri yapı ve mukavemet ve hücre adhezyon reseptörleri ile etkileşimleri yoluyla hücre davranışı üzerinde etkisi sağlar. V Benzer şekilde, hücrelerinFiziko-kimyasal etkiler de yapışma modüle ederken itro proteinler 4 emilir tabakaları ile sentetik alt-tabakalar ile etkileşim. Örneğin, bir polimer yüzeyi asit ya da hidroksit ile işlenerek 5 iyonu ya da mor ötesi ışık ışınlama ya da bir dağlama aracılığı ile (hidrofilik) devamı "ıslanabilir" hale getirilebilir. Hücre desenlendirme için kurulmuş yöntemler bu ve diğer hücre yapışması aracıların yararlanmak. Örnekler 6 baskı mürekkep püskürtmeli, microcontact 7 damgalama, fiziksel hareketsizlik 8, mikroflüidik 9, gerçek zamanlı manipülasyon 10, ve seçici moleküler montaj desenlendirme (SMAP) 11 içerir. Her özel yararları ve sınırlamaları vardır. Işimizde önemli bir sürücü, ancak, mikroelektromekanik sistemler (MEMS) ile hücre modelli entegre etmektir.
MEMS elektrik ile tahrik son derece küçük mekanik cihazlara bakın. Bu, nano ölçekli eşdeğer, nanoelectromech örtüşüranical sistemleri. Bu kavram yarıiletken stratejileri mikroölçeklerde gerçekleşecek imalat etkin yalnızca pratik oldu. Yarı iletken elektroniği için geliştirildi, imalat teknikleri farkında olmadan, örneğin hücresel elektrofizyoloji gibi diğer kullanımlar için yararlı olduğu bulunmuştur. A tuşu aşağı amacı (bir bioMEMS cihazı oluşturan) yüksek sadakat hücre desenleme süreci ile böyle mikroelektronik teknolojileri birleştirmektir. Birçok mevcut ve aksi güvenilir ve pratik hücre-desenleme teknikleri bu fikir ile uyumsuzdur. Örneğin, herhangi bir gömülü ya da mikro elektronik biyosensör doğru hizalama onların etkinliği için temel olduğunu ancak microcontact damgalama gibi bir teknik kullanılarak elde etmek için son derece zordur.
Bu sorunu aşmak için, biz photolithographically baskılı parylene C kullanan bir SiO 2-tabanlı desenleme platform üzerinde çalışıyoruz. Fotolitografi geometrik özellikler transferini içerirUV aydınlatma ile bir alt-tabaka ile bir maske. Bir maske uygun bir bilgisayar destekli tasarım programı kullanılarak tasarlanmıştır. Bir cam levha üzerine, saydam olmayan krom ince bir tabaka arzu edilen geometrik desen (1-2 mm'lik bir özelliği çözünürlük mümkündür) temsil eder. Desenli edilecek alt-tabaka çeliğin ince bir tabaka (bir UV-duyarlı bir polimer) ile kaplanır. Kaplanmış sonra polimer hizalanmış ve maske ile sıkı bir temas durumuna getirilir. Bir UV kaynağı korunmayan alanlar ışınlanır şekilde uygulanır ve bu yüzden, maske modeline arkasında bir parylene-C temsil bırakarak sonraki geliştirme aşamasında çözünür ve taşınabilir olmasıdır. Bu süreç yarı iletken cihazların gelişimi sırasında kökenli. Bu nedenle, silikon gofret sık sık bir alt-tabaka olarak kullanılmaktadır. SiO 2 parylene C fotolitografik birikimi dolayısıyla rutin mikroelektronik cleanroom tesislerinde yer alan bir basit ve güvenilir bir işlemdir.
Parilen var ikenBirçok arzu Biyomühendislik özellikleri (kimyasal etkisiz olmayan biyolojik olarak parçalanabilir), hücre dokusunda doğrudan kullanımını kısıtlayan bir faktör onun aşırı hidrofobisitelerine kısmen atfedilen doğuştan kötü hücre yapışkanlık vardır. Bununla birlikte, parilen-C, daha önce bir soyma-away hücresel 12,13 şablon olarak örneğin, hücre modelleme için dolaylı olarak kullanılmıştır. Bu yaklaşım, yoksul kararı ile sınırlıdır ve birden fazla adımlar gerektirir. Burada anlatılan işlem yerine bu parylene-C bölgesi bağlayıcı hidrofobikliği ve protein serum azalma bir kombinasyonu yoluyla, hücre yapışkan olmak sağlamak için, serum inkübasyon ve ardından bir asit aşındırma adımı kullanır.
Sonuçta biyolojik aktivasyon sonra, ilgili sito-yapıştırıcı veya sito-itici özelliklerini tezahür ve böylece etkili bir hücre pattering platformu temsil eder, iki farklı yüzeylerde oluşan bir yapıdır. Önemli bir şekilde, biyolojik ag tanıtmak için gerek yoktur(bunlar fetal sığır serumu ya da başka bir etkinleştirme solüsyonu kullanılarak aktive edilir ve bunun üzerine) veliler temiz oda tesis haline modelli alt-tabakalar kullanmak için belirsiz önce depolanabilir gibi.
Üretim süreçleri çok yakından mikroelektronik üretim için kullanılan ayna gibi bu parylene-C/SiO 2 desenleme platformu, bu nedenle MEMS bileşenleri ile bir koalisyon için iyi bir aday.
Pirana asit cips Daldırma sadece hizmet veren herhangi bir artık organik madde çıkarmak için değil, aynı zamanda alt-tabaka yüzeyleri çözünen bir madde. Bu fetal sığır serumu ile etkili aktivitesini sağlayan anahtarıdır. Aksi takdirde hücre modelli önler ve derinden on-chip hücre davranışını değiştirir. Piranha asit ile temizlendikten sonra fiş sterilize etmek için bir gereksinim yoktur. Gerçekten de UV maruz bırakılarak sterilizasyon doza bağımlı bir şekilde 13 hücre modelli zayıflatmak için gösterilmiştir. Bakım fotolitografik işleminden sonra kalan tüm photoresist'i yıkayın alınmalıdır. Kalıcı fotorezist parylene-C/SiO 2 geometrisi tarafından dikte model oluşturmanın geçersiz kılan istenmeyen bir sito-yapışkan tabaka olarak hareket edebilir. Belirtilen tepkin maddeler ve yukarıda tarif edilen fotolitografık işlem kullanılırken aseton etkilidir. Bununla birlikte, fotorezist diğer tür farklı bir çözücü gerektirebilir.
Farkıyla etkisini ve başarısını değerlendirmek içinnt üretim adımları, iki zıt substratların temas açısı ölçülebilir. Şekil 2, bu çip etkinleştirme işlemi sırasında ortaya çıkan değişiklikleri göstermektedir. Bu, serum içinde özel yapışkan ve itici protein bileşenleri sonuç olarak ilgili sito-yapışkan ya da sito-itici özelliklerini uygulamak için parylene desenli çarpmalarına ki, muhtemeldir.
Başarılı bir şekilde daha kalın ve hem de ince parylene katmanları kullanarak model verilmiş olsa tüm temsili sonuçlar, 100 nm kalınlığında bir parylene fiş kullanılır. Daha da önemlisi, bu gravür tekniği fotolitografik burada gösterilenden daha parylene konfigürasyonunun daha büyük bir üç boyutlu bir kontrol sağlar. Örneğin, fotoğraf maskeleri bir arada kullanarak, bu karışık kalınlığı parylene bölgeleri oluşturmak mümkündür. Bu hücre yapışması / repul basitçe dikte bölgelerinde ötesinde, tanımlanan üç boyutlu topoğrafya ile hücre kültürleri oluşturmak için yolunu açarsion, potansiyel olarak yapı içine mikroakışkan kanal entegre bir araç sunar.
Gösterildiği gibi, ancak, bu model verme platformu evrensel hücre tipleri üzerinde etkili değildir. Bu platform üzerinde kültürlenmiş farklı hücre hatları, onların çeşitli hücre yapışma molekülü profilleri ile, şaşırtıcı farklı davranır. Biz henüz bu hücre-desenleme platformunu destekleyen serumdaki anahtar bileşenleri, ne de ücretsiz hücre zarı reseptörleri tespit değil. Gelecekte bunu yaparken kendi programını ve özgüllüğünü genişletmek vaat ediyor. Örneğin, 'non-yapıya model verme "hücre soyu genetik olarak gerekli yapışma molekülü eksprese etmek için değiştirilmiş ve bu model oluşturmanın teşvik edilebilir.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Wellcome Trust Klinik Doktora bursu (ECAT) tarafından desteklenmiştir.
Layout editor software package | e.g. CleWin 5.0 from WieWeb, http://www.wieweb.com/ns6/index.html | Capable of reading/writing CIF or GDS-II files. Used to create parylene design for photo mask manufacture | |
Bespoke photo mask | e.g. Compugraphics International Ltd, Glenrothes, Scotland, www.compugraphics-photomasks.com | Either fabricate in-house of facilities exist or commision | |
3" Silicon wafers | e.g. Siltronix, Archamps, France, http://www.siltronix.com | ||
Atmospheric horizontal furnace | e.g. Sandvik, http://www.mrlind.com | For oxidising silicon wafer | |
Small spot spectroscopic reflectometer | e.g. Nanometrics NanoSpec 3000 reflectometer, www.nanometrics.com/ | To measure depth of silicon dioxide layer | |
Silane adhesion promoter | e.g. Merck Silane A174 adhesion promoter. Merck Chemicals, www.merck-chemicals.de/ | 1076730050 | Pre-applied to wafer to encourage parylene deposition |
Parylene-C | e.g. Ultra Electronics, www.ultra-cems.com | ||
SCS Labcoter 2 deposition Unit, Model PDS2010 | SCS equipment, Surrye, UK, www.scscoatings.com/ | Model PDS2010 | |
Hexamethyldisilazane (HMDS) adhesion promoter | e.g. SpiChem, www.2spi.com | ||
Automated track system for dispensing photoresist on wafers. | e.g SVG (silicon Valley Group) 3 inch photo-resist track, | Automated track system for dispensing photoresist on wafers. A prime oven bakes the wafer and dispenses the adhesion promoter, HMDS. A combination spinner dispenses photoresist. Pre-bake oven cures the resist. | |
Photo-resist: Rohm & Haas | Rohm & Haas, www.rohmhaas.com/ | SPR350-1.2 positive photo-resist | |
Phot-mask aligner | e.g. Suss Microtech MA/BA8 mask aligner, www.suss.com | ||
Microchem MF-26A developer | Microchem MF-26A developer, www.microchem.com | Removes exposed reogions of photoresist | |
Plasma etch system | e.g. JLS RIE80 etch system, JLS Designs, www.jlsdesigns.co.uk | Removes exposed regions of parylene | |
Wafer dicing saw | e.g. DISCO DAD 680 Dicing Saw, DISCO Corporation, Japan, www.disco.co.jp | ||
Acetone | e.g. Fisher Scientific, www.fishersci.com/ | A929-4 | To wash off residual photoresist |
30% Hydrogen Peroxide | e.g. Sigma-Aldrich, www.sigmaaldrich.com | H1009 | |
98% Sulphuric Acid | e.g. Sigma-Aldrich, www.sigmaaldrich.com | 435589 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco-Invitrogen, www.invitrogen.com | 10437 | Standard chip activation. |
Hank's Balanced Salt Solution | Gibco-Invitrogen, www.invitrogen.com | 14170 |