Summary
Designer nukleaser som sink finger nukleaser (ZFNs) og transkripsjons aktivator lignende effektor nukleaser (Talens) kan brukes til å endre genomet muse preimplantation embryoer ved å utløse både ikkehomologe ende bli (NHEJ) og homolog rekombinasjon (HR) trasé. Disse fremskrittene muliggjøre rask generasjon av mus med presise genetiske modifikasjoner.
Abstract
Transgene mus som bærer stedsspesifikke genom modifikasjoner (knockout, knock-in) er av avgjørende betydning for å dissekere komplekse biologiske systemer, så vel som for å modellere menneskelige sykdommer og teste terapeutiske strategier. Nylige fremskritt i bruk av designer nukleaser som sink finger nukleaser (ZFNs), transkripsjons aktivator lignende effektor nukleaser (Talens), og de gruppert regelmessig interspaced korte palindromic repetisjoner (CRISPR) / CRISPR-forbundet (Cas) 9 system for område- spesifikke genom ingeniør åpne muligheten til å utføre raske målrettede genomet modifisering i praktisk talt alle laboratorie arter uten å måtte stole på embryonale stamceller (ES) celleteknologi. Et genom redigering eksperiment starter vanligvis med identifisering av designer nuklease målnettsteder innenfor et gen av interesse etterfulgt av bygging av tilpassede DNA-bindende domener til direkte nukleaseaktivitet til etterforsker definerte genomisk locus. Designer nuklease plasmider er in vitro </ Em> transkribert for å generere mRNA for mikroinjeksjon av befruktede mus eggceller. Her gir vi en protokoll for å oppnå målrettet genomet modifisering ved direkte injeksjon av TALEN mRNA inn befruktede mus eggceller.
Introduction
Mus er langt den mest populære plattformen for generering av transgene dyremodeller. Den allsidige verktøykasse for genteknologi av musen embryo 1-3 har nylig blitt utvidet ved genom redigering tilnærminger basert på designer nukleaser som sink finger nukleaser (ZFN) 4-6, transkripsjons aktivator lignende effektor nukleaser (Talen) 7,8, og gruppert regelmessig interspaced korte palindromic repetisjoner (CRISPR) / CRISPR-forbundet (Cas) 9 system ni. ZFN og TALEN funksjon som par med to spesialdesignede protein-baserte DNA-bindende domener (arrays av sink finger proteiner og gjenta-variabel di-rester (rvds), henholdsvis) som hver er koblet til Foki endonuclease 10-12. Omvendt, er det spesielle ved Cas9-mediert DNA-spalting leveres av transactivating CRISPR RNA (crRNA og tracrRNA, som også kan bli kombinert i en enkelt chimerisk RNA molekyl betegnet guide RNA) 11 som opptrer i et kompleks med denCRISPR protein.
Talens med en definert sekvens av rvds kan raskt konstruert av individuelle forskere med et mangfold av monterings strategier for å velge 13-17. CRISPR/Cas9 lover enda mindre arbeidskrevende generasjon av designer nukleaser, men spesifisiteten av guiden RNA-DNA-binding er fortsatt ikke helt løst 18,19. Generering av tilpassede ZFNs har så langt vært begrenset til spesialiserte akademiske laboratorier og til kommersielle leverandører som Sangamo biovitenskap og Sigma CompoZr tjenesten.
Generelt genom redigering med designer nukleaser tar sikte på å innføre doble trådbrudd (DSB) på definerte genomisk loci, som senere tiltrekke ikkehomologe ende bli (NHEJ) eller homolog rekombinasjon (HR) DNA-reparasjons machineries 10,12. NHEJ-mediert reparasjon av et DSB ofte resulterer i innføring av innsettinger og delesjoner i nær tilknytning til området for reparasjon. Dermed NHEJ reparasjon cen utnyttes for å slå ut funksjonen av et mål-genet ved å innføre en ramme-skiftmutasjon innenfor genene protein-kodende sekvens 4,7,9. Alternativt kan defineres tillegg eller utskifting av genetisk informasjon kan oppnås ved å gi en DNA-donor sammen med designer nukleaser. En DNA-donor består etterforsker-designet DNA-sekvenser flankert av regioner av homologi med målet locus, og dermed tjene som en mal for DSB reparasjon av HR. Begge plasmidene 5,6,20 og single-strandet oligonukleotider 8,9,21 har blitt brukt som donorer. Hverken NHEJ-nor HR-mediert genom redigering krever innføring av en selekterbar markør inn i genomet av mus embryo, noe som gjør disse strategiene spesielt godt egnet for å lage små endringer i nukleotidsekvensen uten å forstyrre den totale genetiske arkitektur.
I denne protokollen beskriver vi alle nødvendige prosedyrer for genom redigering imus embryo ved hjelp Talens. Disse omfatter 1) identifikasjon av en TALEN målområde 22, 2) konstruksjon av Talens med Golden Gate klon 13, 3) in vitro syntese av TALEN mRNA, 4) mikroinjeksjon av TALEN mRNA inn i befruktede oocytter mus, 5) kirurgiske prosedyrer for embryo og 6) analyse av TALEN-indusert mutagenese in stifter dyr. Vi fokuserer på TALEN mRNA mikroinjeksjon og screening av grunnleggerne for NHEJ-indusert innsett / slettinger. For dette formål har vi generert bifunksjonelle Talen konstruksjoner som tillater både ekspresjon i pattedyrceller når transfektert som plasmider og in vitro syntese av TALEN mRNA for mikroinjeksjon i mus embryo. Disse konstruksjoner omfatter en avkortet TALE ryggrad 23 smeltet til heterodimert foki domener 24,25 for optimal genomet redigering i pattedyrceller. Denne protokollen kan også tas i bruk for mikroinjeksjon av andre designer nukleaser eller for kombinerte injeksjoner av designer nukleaserog donor-konstruksjoner (utforming av DNA-givere er blitt beskrevet i gode tekniske publikasjoner fra Wefers et al. 26,27).
Etisk Erklæring
Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med de retningslinjer og regler i Cantonal Veterinary Office of Canton Zürich.
Protocol
En. Identifisering av Talen Target nettsteder
- Besøk TAL Effector Nucleotide Targeter 2,0 hjemmeside (http://tale-nt.cac.cornell.edu) og velg "TALEN Targeter".
- Angi sekvens av målgenet. Hvis pCAG-T7-TALEN uttrykk konstruerer blir brukt (figur 1C) velg "Miller et al., 2011" under "Bruk en Preset Architecture" for å forutsi målområder som kan være målrettet med den optimale spacer lengde (15-20 bp) og antall Tale rvds (15-20) for denne TALEN arkitektur.
- Velg "NN" under "G Substitute" (Guanosine spesifikke NH rvds er også tilgjengelig, men ennå ikke grundig testet for TALEN montering).
- Valgfritt: for andre innstillinger og alternativer kan du følge instruksjonene på nettsiden og de linkene der.
- En tekstfil med potensielt mål-steder genereres, som kan væreimporteres til et regnearkprogram for mer praktisk visning. Velg TALEN pair (s) for Golden Gate montering.
- Valgfritt: Sequence genomisk region av interesse i musen belastningen som skal brukes til mikroinjeksjon for å oppdage mulige single nukleotid polymorfismer (SNPs) som ikke kan gjøres rede for i offentlige databaser og kan potensielt hindre nuclease bindende.
- Valgfritt: Se tabell 3 for ytterligere designer nukleaser-relaterte nettressurser.
- De fleste plasmider som kreves for ZFN og TALEN konstruksjon kan fås fra Addgene:
http://www.addgene.org/special-collections/
Addgene IDer for Golden Gate TALEN kit og pattedyr Talen ekspresjonskonstruksjoner er gitt i tabell 2.
Alternativt kan spesielle funksjonelle moduler som sink finger domener bestilles fra et gen syntese tjenesteleverandør.
Denne delen beskriver montering av Talens ved hjelp av en protokoll utgitt av Cermak et al. 13 Full-lengde Talens er konstruert ved hjelp av to påfølgende Golden Gate kloning trinn (figur 1). Denne tilnærmingen gjør det mulig inkorporering av en rekke rvds mellom 12 og 31 i den endelige ekspresjonskonstruksjoner. Forsamlingen protokollen har blitt tilpasset til destinasjon vektorer utviklet for å generere mRNA (figur 1C) som uttrykker svært aktive Talens følgende eggcelle mikroinjeksjon. Det vises for øvrig til den elektroniske protokollen av Golden Gate TALEN kit for å etablere og opprettholde plasmid-biblioteket ( http://www.addgene.org/TALeffector/goldengateV2/ ).
- Dag 1 - Golden Gate Reaction # 1 - Montering av RVD Arrays inn pFUS vektorer
- Valgfritt: For hver TALEN par designet i Protocol 1, gå inn i DNA-sekvensen av de to mål-områder (inkludert den første T, 5 'til 3') inn i TALEN_Voytas_Pipetting arket for å generere en pipettering ordning for hver Golden Gate reaksjon (også angi konsentrasjoner av alle plasmider som brukes for anordningene ). Den arket gir også den forventede DNA-sekvensen til alle rvds som kan brukes for innretting av sekvenseringsresultater i avsnitt 2.5.2.
- For hver unike TALEN designet i protokoll 1:
Hvis TALEN lengde er 12-21 (standard), velger du Gjenta variable di-rester (rvds) 1-10 sted vektor pFUS_A. Velg værende rvds og en pFUS_B destinasjon vektor, for eksempel for en TALEN med 15 rvds (inkludert den siste gjenta, som vil bli lagt til den endelige monteringen i avsnitt 2.3.3, velger rvds 11-14 og bestemmelses vektor pFUS_B4 (figur 1A).
Hvis TALEN lengde er 22-31, bruk rvds 1-10 og destinasjon vector pFUS_A30A. Plukk rvds 11-20 sted vektor pFUS_A30B. Velg værende rvds og en pFUS_Bdestination vektor, f.eks for TALEN med 24 rvds plukke rvds 21-23 sted vektor pFUS_B3. - Sett opp Golden Gate reaksjon # 1 for hver pFUS + RVD kombinasjon separat, dvs. 1-10 + pFUS_A og øvrige rvds + respektive pFUS_B vektor eller for TALEN lenger enn 21 rvds, 1-10 + pFUS_A30A, 11-20 pFUS_A30B, og gjenværende rvds + respektive pFUS_B vektor. Bruk 150 ng av hver RVD vektor, 150 ng av pFUS vektor, 1 pl BsaI, 1 pl T4-DNA-ligase, 2 pl 10 x T4 DNA-ligasebuffer, og H 2 O til 20 pl totalt reaksjonsvolum. (Ved hjelp av ferske prøver av T4 ligasebuffer for hver runde av Golden Gate forsamlinger anbefales siden gjentatt tining / frysing av T4 ligasebuffer kan redusere effektiviteten av reaksjonene.)
- Plasser Golden Gate reaksjoner i en termosykler.
Program:
37 ° C 5 min
16 ° C 10 min
50 ° C 5 min
80 ° C 5 min - Til 1 pl 10 mM ATP og 1 pl Plasmid-Safe nuklease til hver blanding, og inkuber ved 37 ° C i 1 time. Denne behandlingen fjerner lineære ufullstendige ligation produkter som kan bli klonet inn i destinasjons vektorer ved in vivo homolog rekombinasjon i transformerte bakterier.
- Transform E. coli med individuelle ligation reaksjoner (electrocompetent eller kjemisk kompetent E. coli som letter α-complementation som XL1-Blue eller DH5α kan brukes her og i etterfølgende transformasjoner).
- Plate bakterier på spektinomycin (50 ug / ml) plater med X-Gal og IPTG (40 ug / ml hver) for blå / hvit valg koloni.
- Dag 2 - Bekreftelse på Riktig pFUS-rvds Assembly
- Ved å bruke koloni PCR med primere pCR8_F1 og pCR8_R1 (Se tabell 1 for primersekvenser) skjerm 1-3 hvitkolonier fra hver plate. Riktig pFUS-rvds forsamlinger vanligvis viser et band som tilsvarer den samlede lengden på alle rvds klonet (f.eks rundt 1,1 kb for 10 rvds) og en "stigen" av mindre mindre fremtredende band (Figur 1b).
PCR-programmet:
95 ° C 3 min
95 ° C 30 sek
55 ° C 30 sek
72 ° C 1 min 45 sek
30-35 sykluser
72 ° C 10 min - Bruk bekreftet kloner å starte natten kultur (2-5 ml LB med 50 mikrogram / ml spectinomycin).
- Ved å bruke koloni PCR med primere pCR8_F1 og pCR8_R1 (Se tabell 1 for primersekvenser) skjerm 1-3 hvitkolonier fra hver plate. Riktig pFUS-rvds forsamlinger vanligvis viser et band som tilsvarer den samlede lengden på alle rvds klonet (f.eks rundt 1,1 kb for 10 rvds) og en "stigen" av mindre mindre fremtredende band (Figur 1b).
- Dag 3 - Golden Gate Reaction # 2 - RVD Arrays i TALEN ekspresjonsvektorene
- Utfør "minipreps" å isolere pFUS-RVD forsamlinger (avhengig av antall rvds enten pFUS_A og pFUS_B eller pFUS_A30A, pFUS_A30B, og pFUS_B).
- Valgfritt: Sequence individuelle pFUS vektorer som bruker primere pCR8_F1, pCR8_R1 (se tabell 1 for primersekvenser). Sekvensering kan også utføres på final TALEN konstruerer (avsnitt 2.5.2); Men for lengre Talens komplett leser av alle rvds kanskje ikke mulig med Sanger-sekvensering.
- Sett opp Golden Gate reaksjon # 2 for hver enkelt TALEN. 150 ng av hver pFUS vektor, 150 ng av PLR-HD, PLR-NG, PLR-NI, PLR-NN (siste "halv-repeat") i henhold til utformingen av RVD sekvensen og for l eft TALEN bruke 75 ng av pCAG-T7-TALEN-ELD-Destination og for retten TALEN bruke 75 ng pCAG-T7-TALEN-KKR-Destination (eller vice versa). Legg en ul Esp3I, 1 mL T4 DNA ligase, 2 mL 10x T4 DNA ligase buffer, H 2 O til 20 mL totalt reaksjonsvolum.
- Plasser Golden Gate reaksjoner i en termosykler.
Program:
37 ° C 5 min
16 ° C 10 min
10 sykluser
37 ° C 15 min
80 ° C 5 min - Bruk reaksjoner fra avsnitt 2.3.4 for å transformere E. coli.
- <strong> Dag 4 - Bekreftelse av Riktig TALEN Assembly
- Screen 1-3 hvite kolonier fra hver plate etter koloni PCR med primere TAL_F1 og TAL_R2 (se tabell 1 for primersekvenser). Korrekt montert Talens viser et PCR-produkt med en lengde svarende til det totale antall rvds innlemmet (figur 1D, dette båndet er noen ganger vanskelig å oppdage mens "stigeeffekten" representerer en robust indikator på vellykket montering).
PCR-programmet:
95 ° C 3 min
95 ° C 30 sek
55 ° C 30 sek
72 ° C 3 min
30-35 sykluser
72 ° C 10 min - Bruk bekreftet riktige kloner å starte natten bakteriekulturer (2-5 ml LB med 100 mikrogram / ml ampicillin).
- Screen 1-3 hvite kolonier fra hver plate etter koloni PCR med primere TAL_F1 og TAL_R2 (se tabell 1 for primersekvenser). Korrekt montert Talens viser et PCR-produkt med en lengde svarende til det totale antall rvds innlemmet (figur 1D, dette båndet er noen ganger vanskelig å oppdage mens "stigeeffekten" representerer en robust indikator på vellykket montering).
- Dag 5 - Bekreftelse på Riktig TALEN Assembly
- Utfør "minipreps" å isolere pCAG-T7-TALEN plasmider.
- Ved sekvensering ble ikke utført i seg selvDette skjer 2.3.2, bruke primere TAL_Seq_5-en og TAL_R2 (se tabell 1 for primersekvenser) å bestemme riktig RVD montering i full lengde TALEN.
Tre. Nuclease mRNA Synthesis
- Generering av DNA Mal
- Forbered høy kvalitet midi eller maxipreps av pCAG-T7-TALEN plasmider for mRNA syntese.
- Linear 10 ug av TALEN eller ZFN mRNA-syntese-plasmidet ved hjelp av et restriksjons-enzym som preferensielt spalter nedstrøms og i umiddelbar nærhet til nuklease stoppkodonet (for pCAG-T7-talen vektorer bruk Saci). mRNA syntese plasmider inkluderer vanligvis en T7-eller SP6-fag-promotoren oppstrøms for nuklease-kodende sekvens.
- Kjør 200-500 ng av fordøyd plasmid på en 0,7 til 1% agarosegel for å se etter fullført fordøyelse.
- Salter fra plasmid fordøye ved utfelling av DNA med 0,1 volum natriumacetat og 3 volumer etanol i 1 time ved romtemperature. Pellet DNA ved sentrifugering ved 14.000 x g eller mer i 10 min, vaskes pelleten med 200 ul 70% etanol, sentrifugering for en annen 5 min, fjerne etanol, lufttørker og resuspender pelleten i et egnet volum av RNAse-fritt vann. Rensing av det lineariserte plasmid er også mulig å bruke en kolonne basert system, f.eks QIAquick PCR Purification Kit.
- Bestem konsentrasjonen av den lineære malen og bruk 1 mikrogram til å sette opp in vitro transkripsjon.
- mRNA syntese og polyadenylering
- For in vitro transkripsjon av pCAG-T7-TALEN plasmider bruke mMESSAGEmMACHINE T7 Ultra Kit. Sett opp transkripsjon reaksjon for hver TALEN på is: til 20 mL med nukleasefritt vann, 10 mL T7 2x NTP / ARCA, 2 mL 10x T7 reaksjonsbuffer, 1 mikrogram av DNA mal, 2 mL T7 enzym blanding. Bland reaksjonen og inkuberes i 1-2 timer ved 37 ° C.
- Bruk hele 20 mL transcripsjon reaksjonsblanding for å sette opp polyadenylerings-reaksjonen på is: 36 pl av nuclease-fritt vann, 20 ul 5x EPAP buffer, 10 pl 25 mM MnCl2, 10 ul 10 mM ATP. Bland og fjerne 2,5 pl av reaksjonsblandingen som kontrollprøver L1 og R1 (for venstre-og høyre-nuklease, henholdsvis). Tilsett 4 mL av E-PAP-enzymet og inkuberes reaksjonsblandingen i 45-60 min ved 37 ° C. Fjern ytterligere 2,5 pl av reaksjonsblanding som kontrollprøver L2 og R2.
- mRNA Rensing
- Bruk NucAway Spin Kolonner for mRNA rensing (buffer utveksling og fjerning av kommunefritt nukleotider). Trykk kolonner å bosette tørr gel i kolonnen bunnen. Hydrat-kolonnen med 650 mL av RNAse-fri mikroinjeksjon buffer (1 mM Tris-Cl, 0,1 EDTA, pH 7,5). Cap, vortex, trykke ut luftbobler, og hydrat for 5-15 minutter ved romtemperatur.
- Plasser på kolonnen i en samling rør og spinved 750 x g, 4 ° C i 2 min for å fjerne overskudd av interstitiell fluid. Kast samling rør og legg i en kolonne 1,5 ml elusjons-rør.
- Påfør fullstendig reaksjon mix fra pkt. 3.2.2 til kolonne og spinn ved 750 xg, 4 ° C i 2 min. Nuclease mRNA vil nå bli oppløst i mikroinjeksjon buffer. Fjern 2,5 mL av rensede prøver L3 og R3.
- Butikk mRNA ved -80 ° C inntil mikroinjeksjon alikvotene er forberedt.
- mRNA Gel elektroforese
- Renhet en gel kammer for å fjerne forurensninger ved hjelp av RNase 10% SDS-løsning eller RNaseZAP.
- Forbered en 1% agarosegel i 1xTBE kjører buffer.
- Bland hver RNA prøve L1/R1, L2/R2, L3/R3 med tre bind av NorthernMax Formaldehyd Load Dye og inkuberes i 15 minutter ved 65 ° C.
- Belastningsprøver og en RNA størrelse stige (f.eks RNA Millennium størrelse markør) på gelog kjøre gel ved 10 V / cm i 1 x TBE inntil laste fargestoff når enden av gelen.
- Flekk gelen ved hjelp av SYBR grønn løsning (Invitrogen) i 30-60 min med omrøring ved romtemperatur.
- Bilde gel og sammenligne størrelser av L1/R1 med L2/R2 og L3/R3. Prøver L2/R2 og L3/R3 bør vise band av en økt størrelse i forhold til L1/R1 indikerer vellykket polyadenylering i (Figur 2).
- Bestem mRNA konsentrasjon ved hjelp av et spektrofotometer.
- Forbered mRNA alikvotene for microinjections ved å blande venstre nuclease og høyre nuklease mRNA i forholdet 1:1. Det anbefales fremstilling av alikvoter med en total konsentrasjon av 200 ng / pl (100 ng / mL av hver nuklease) ved fortynning med mikroinjeksjon buffer. Butikk mRNA alikvoter ved -80 ° C.
4. Embryo Isolering og Mikroinjeksjon
- Embryo Isolation. Denne protokollen har blitt brukt med C57BL/6J og BDF1 belastnings, og kan mest sannsynlig være tilpasset for andre påkjenninger som vanligvis brukes i mikroinjeksjon eksperimenter som FVB eller CBF1. Musene blir plassert under en 12 timers-12-timers lys-mørke-syklus i et temperatur-og fuktighetskontrollerte innretning med mat og vann ad libitum.
- Superovulate donorhunn å øke utbyttet av embryoer. 16 kvinner (4 uker gamle) er superovulated ved intraperitoneal (ip) injeksjon av 5 IU gravid mare serum gonadotropin (PMSG), etterfulgt av ip injeksjon av 5 IE humant choriongonadotropin (hCG) 48 timer senere.
- Mate de 16 superovulated kvinner til 16 hekkealder (2-8 måneder) menn umiddelbart etter hCG-injeksjon.
- Sacrifice hunnene ved hjelp av en godkjent dødshjelp protokoll som CO 2 innånding.
- Gjenopprette de befruktede eggceller. Oocytter blir samlet fra oviduktene neste morgen og deretter befridd for eventuelle gjenværende cumulus-celler av en 3-5 min behandling i 0,1% bovin hyaluronidase oppløst i M2 medium. Alt etter parring ytelse og belastningen anvendes embryoet utbytte kan variere. 16 C57BL/6J hunner produserer vanligvis 150-250, mens BDF1 gi 300-400 befruktede eggceller, henholdsvis.
- Embryo Mikroinjeksjon
- Injisere nuclease mRNA. Pronuclear scene ubefruktede egg er vanligvis injiseres i tidlig ettermiddag. Cytoplasmisk mRNA mikroinjeksjon gjennomføres i M2 medium under mineralolje ved hjelp av et invertert mikroskop utstyrt med Nomarski DIC hjelp 20X objektiv og med embryo micromanipulators samt en injeksjonsenhet. Det anbefales påbegynnes injeksjoner av TALEN mRNA ved en konsentrasjon på 10 ng / pl (20 ng / mL totalt).
- Aspirer eggcelle med en eierandel kapillær og injisere nuclease mRNA i cytoplasma av embryoet å unngå kontakt med pronuclei. Injeksjonen skal være grunne, i nærheten av plasma membranen. Injeksjonsvolumet bør holdes lav og mikroinjeksjon nålen skal være viddhdrawn ved første tegn på cytoplasmatisk distensjon. En mikroinjeksjon serie vil normalt bestå av 100-300 egg. Vanligvis bør minst 80 til 90% av embryoene overleve injeksjon uten umiddelbar lysis.
- Etter mikroinjeksjon, plassere embryoene for en time i M16 (Sigma) medium ved 37 ° C og 5% CO 2 og overføre de overlevende embryoer inn pseudopregnant foster mødre.
5. Kirurgisk Embryo Transfer
- Forbered pseudopregnant embryo mottakere (foster mødrene) en dag før mRNA mikroinjeksjon. Modne kvinner (3-6 måneder gammel) av en robust outbred belastning, slik CD-en, er godt egnet for rollen. Fremkall pseudopregnancy ved å parre hunnene på en tidligere dag med enten kirurgisk eller genetisk vasectomized hanner 28. Kun 0,5 DPC hunner med en klar copulatory plugg brukes som embryo mottakere. I ubrukte hunner den pseudopregnancy forsvinner etter ca 3 weeks slik at deres gjentatt bruk.
- Anaesthetize de 0,5 DPC fostermor hunner ved ip injeksjon av ketamin, xylazin (120 mg / kg og 16 mg / kg, henholdsvis). Denne formuleringen garantier ~ 30 min kirurgisk toleranse tid er mer enn tilstrekkelig for den planlagte operasjonstid på 5-10 min.
- Plasser bedøves dyret på buken på en varm overflate og desinfisere området av snittet med en passende desinfeksjonsmiddel slik som 70% etanol eller klorheksidin, og alkohol-blanding.
- Incise huden på ryggen av dyret og åpne bukhulen med steril saks.
- Visualisere og externalize livmor horn ved å trekke på fettpute festet til eggstokken. Hold organene fuktig ved hjelp av varm 0,9% NaCl-løsning. Husk at det kirurgiske området kan ha for å bli drapert med steril bandasje eller barbert for å samsvare med lokale veterinær retningslinjer.
- Immobilisere den reproduktive organer ved å klippe eggstokken fett pad med en klypen.
- Forsiktig tak oviduct like oppstrøms av ampulla med urmaker tang og bruke en 30 G kanyle til å lage et lite hull i oviduct veggen.
- Trekk nålen og sett en tynn glass kapillær inneholder embryoene inn i hullet slik at plassering av embryoene i ampulla ved å forsiktig blåse inn i munnstykket på kapillær holderen. Trekk kapillær når embryoene er deponert i ampulla og erstatte den reproduktive organer tilbake i kroppens hulrom.
- Lukke i bukhulen med en serie av sterile suturer (prolene 6-0).
- Lukk huden ved hjelp av 1-2 sår klipp (Autoclip 9 mm), avhengig av størrelsen på åpningen.
- Etter operasjonen returnere dyrene til sine hjem bur og veilede dem frem til effekten av anestesi slites av.
- For å minimere stress, huse musene i stabile sosiale grupper (2-4 dyr / type III bur) når det er mulig.
- Påfør postoperativ smertestillendes i form av Dafalgan tilsatt til drikkevannet (Paracetamol 200 mg / kg kroppsvekt) i 3 dager etter operasjonen.
6. Analyse av stifterne av PCR og T7 Endonuklease eller Restriction Enzyme Fordøyelse
- Design primere til å forsterke et område mellom 200-700 bp rundt nuclease bindingssetet. Avstandene forover primer-nuklease spacer regionen og nuklease spacer regionen-revers primer bør være tilstrekkelig forskjellige til å tillate deteksjon av to separate bånd av nedbrutte produkter på en agarose-gel (se figurene 3 og 4 for eksemplene).
- Kjør PCR med optimaliserte forhold. Kontroller PCR fragment størrelse på en agarosegel.
- Valgfritt: Purify PCR-produkter, f.eks med QIAquick PCR Purification Kit for å fjerne salter og nukleotider fra PCR miksen. Mange restriksjonsenzymer er aktive i PCR-prøver supplert med det passende restriksjonsenzym og buffer rensing ikke er nødvendig. Vi har også successfully brukt T7 endonuclease i QiagenTaq PCR buffer supplert med NEBuffer to.
- T7 endonuclease analysen. Bland 17 mL av PCR produkt med 2 mL av NEBuffer to og kjøre heterodupleks formasjonen (Figur 3b) program i en thermocycler:
95 ° C 2 min
95 ° C til 85 ° C (-2 ° C / sek)
85 ° C til 25 ° C (-0,1 ° C / sek)
4 ° C hold.
Legg 1 mL av T7-endonuklease til hver prøve og inkuber ved 37 ° C i 20 min. (Besiktelsesmannen analysen (Transgenomics), som er avhengig av CEL en nuclease, kan også brukes her. Vennligst referer til produsentens instruksjoner.) - Begrensning sammendrag av PCR produkt. Bland 17 mL av PCR produkt med 2 mL av 10x begrensning enzym buffer og en mL av restriksjonsenzym. Fordøy ved passende temperatur i 1 time eller mer.
- T7 endonuclease analysen. Bland 17 mL av PCR produkt med 2 mL av NEBuffer to og kjøre heterodupleks formasjonen (Figur 3b) program i en thermocycler:
- Legg DNA lasting fargestoff til prøvene og kjørt på en 2% agarosegel for å detektere distinkt fordøyelsemønstre for vill-type dyr og grunnleggere bærer muterte alleler. Se figurene 3 og 4 for forventede resultater.
- Clone PCR-produkter av grunnleggerne positive for muterte alleler for Sanger-sekvensering (eventuelt med TA-kloning inn pGEM-T Easyor direkte sekvens blandinger av PCR-produkter ved hjelp av neste generasjons sekvensering.
Representative Results
Vi konstruerte plasmidene destinasjon kompatible med Golden GateTALEN montering publisert av Cermak et al. 13. som tillater ekspresjon av Talens i pattedyrceller, så vel som in vitro mRNA syntese fra fagen T7-promoteren (figur 1C). Disse plasmider bære heterodimere FoKI domener (ELD eller KKR mutasjoner) som har vist seg å redusere off-target effekter i forhold til Foki homodimers og å forbedre cleavage aktivitet i forhold til første generasjon Foki heterodimerer 25,29. Golden gate montering reaksjoner # 1 og # 2 er vanligvis svært effektiv og hver hvit koloni, når analysert av koloni PCR, viser forventede mønsteret for den aktuelle antall rvds klonet (Tall 1B og 1D).
Gel analyse av in vitro syntetisert mRNA (figur 2) bringer med seg et enkelt skilles bånd med liten eller ingen smear for hver analyserte prøve. Det bør være et klart størrelse skift mellom prøvene L1/R1 og L2/R2, L3/R3, noe som indikerer vellykket polyadenylering.
Stifter-dyr kan bli screenet for NHEJ-induserte muterte alleler ved hjelp genotyping PCR fulgt av enten T7 endonukleasefordøyelse (figur 3) eller en restriksjon digest ved hjelp av et enzym som spalter villtypesekvensen innenfor den spacer regionen av nuklease abel (figur 4). Den T7-endonuklease-analysen kan anvendes på en hvilken som helst form for mutasjon uten hensyn til den bestemte genomiske sekvens innenfor avstands regionen av nuklease paret injisert; men oppdager det bare uoverensstemmelser mellom DNA-trådene i heterodupleks PCR-produkter. Derfor, i sjeldne tilfelle at en gründer bærer to identisk muterte alleler, PCR produktene ville ikke vise noen T7 fordøyelsen mønster. En slik forskjell er imidlertid alltid mulig når et bestemt restriksjonssete er plassert inne i nuklease spacer regionen som skal bli eliminert ved NHEJ-Indusert innsett / slettinger (figur 5). Her ufordøyde band indikere nærværet av mutasjoner, og fraværet av eventuelle fordøyd produkt tyder sterkt på en legger bærer mutasjoner i begge alleler av målrettet genet (merket med stjerner i Figur 4b).
Figur 1. Golden Gate kloning av Talen rvds inn heterodimere pCAG-T7-Destination vektorer. A) Montering av RVD arrays i pFUS vektorer. Her et eksempel er vist for en TALEN par med individuelle fortelling arrays bestående 15 rvds og 17 rvds, henholdsvis (for Tale arrays lenger enn 21 rvds, er tre pFUS-rvds forsamlinger som kreves, ikke vist). Pilene angir primere for pFUS spesifikke koloni PCR reaksjoner. B) PCR-produkteramplifisert fra korrekte pFUS monte vanligvis viser et bånd tilsvarende den kombinerte lengde av rvds klonet (f.eks rundt 1,1 kb til 10 rvds) og en "stige" med mindre mindre fremtredende bånd på grunn av repeterende natur RVD matriser. C) Ferdig sammensetning av pFUS-RVD arrays og et plasmid som inneholder den siste gjentakelse (PLR) inn heterodimere Talen ekspresjonsvektorene med FokIELD og FokIKKR varianter, henholdsvis. Den TALEN ryggrad (kommentert som N-og C) ligner den arkitekturen publisert av Miller et al. 23. Den CAG (CMV-tidlig forsterkerelement / kylling beta-aktin) promoter sikrer høye ekspresjonsnivåer i transfekterte pattedyrceller, mens T7 phage-promoteren tillater in vitro-mRNA-syntese (bruke Saci for linearisering av vektoren nedstrøms for nuklease stoppkodonet). D) Colony PCR ved bruk av primere som er markert med piler i C) gjør det mulig å identifisere korrekt montert Talens. Full-Length PCR produktene er ofte mindre fremtredende mens "ladder effekten" representerer en robust indikator på vellykket montering. Klikk her for å se større bilde .
Figur 2. . Kvalitetskontroll av nuklease mRNA in vitro-syntese ved hjelp av agarosegel-elektroforese ZFN mRNA er vist som et eksempel (L, venstre ZFN, R, rett ZFN). Prøver L1/R1 vise mRNA før polyadenylering, prøver L2/R2 showet polyadenylated mRNA og L3/R3 vise renset polyadenylert mRNA. Klikk her for å se større bilde .
Figur 3. Eksempel på en T7-endonuklease-analyse anvendes for identifisering av stifter dyr som bærer nuklease-induserte mutasjoner av målet locus. A) En TALEN pair er designet for å holde seg innenfor den kodende regionen muse prion protein genet (Prnp, kan TALEN target-sekvensen gis på forespørsel). Et PCR-produkt blir generert ved hjelp av en fremre primer (F) som ligger 110 bp oppstrøms og en revers primer (R) 250 bp nedstrøms for TALEN spaltningssete. B) PCR-produktet ble deretter underkastet heterodupleks-dannelsen og T7 endonukleasefordøyelse. C) TALEN-indusert mutagenese innenfor målrettet genomisk regionen i enkelt gründerne er avslørt av tilstedeværelsen av en full-lengde PCR produkt med fordøyelsen produkter av 250 og 110 bps.50930/50930fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større bilde.
Figur 4. Eksempel på en begrensning sammendrag av PCR-produkter som brukes til identifisering av grunnleggeren dyr som bærer nukleasefritt indusert mutasjoner av målet locus. ZFN spesifikke for musen Rosa26 locus 29 mål en XbaI begrensning nettsted innen intron 1. A) Grunnleggerne ble skjermet av genotype PCR hjelp en forward primer (F) ligger 500 bp oppstrøms og en omvendt primer (R) 250 bp nedstrøms spaltningssetet. B) Fordøyelse av PCR-produkter med Xbal avslører fordøyelsen mønstre indikerer mus med bi-allele mutasjoner (markert med stjerne), mono -allele mutasjoner (fordøyd og ufordøyd band, for eksempel dyr 2)og vekt mus (komplett fordøyelsen, f.eks dyr 21). C) Sekvensering av mus med potensielle bi-allelisk modifikasjoner viser opptil 3 (animalsk 24) distinkte innsett / slettinger. Klikk her for å se større bilde .
| Navn på Primer | Sekvens 5 'til 3' |
| pCR8_F1 | ttgatgcctggcagttccct |
| pCR8_R1 | cgaaccgaacaggcttatgt |
| TAL_F1 | ttggcgtcggcaaacagtgg |
| TAL_R2 | ggcgacgaggtggtcgttgg |
| TAL_Seq_5-en | catcgcgcaatgcactgac |
Tabell 1. Sekvenser med primere som brukes for koloni PCRs og sekvensering innenfor Golden Gate TALEN monteringprotokoll.
| Plasmid / Collection | Senior | Addgene ID | Kommentarer |
| Golden Gate TALEN og TAL Effector Kit 2,0 | Voytas lab | 1000000024 | Inneholder alle plasmider nødvendige for Golden Gate TALEN montering |
| pCAG-T7-TALEN -KKR/ELD destinasjon vektorer | Pelczar lab | 40131, 40132 | Add-on plasmider for TALEN ekspresjon i mammalske celler, og in vitro-mRNA-syntese |
Tabell 2. Plasmider og plasmid samlinger som kreves for Golden Gate TALEN montering kan fås fra Addgene ( www.addgene.org ).
| OnlineRessurs | Kommentarer |
| http://tale-nt.cac.cornell.edu | Design av TALEN; TALEN off-target prediksjon |
| http://zifit.partners.org/ZiFiT/ | Design av TALEN, OPEN ZFN, CODA ZFN, CRISPR/Cas9 |
| http://www.genome-engineering.org | Design av TALEN, CRISPR/Cas9; CRISPR/Cas9 off-target prediksjon |
| http://baolab.bme.gatech.edu/Research/BioinformaticTools/assembleTALSequences.html | Montering av TALEN sekvenser for bekreftelse av sekvense resultater |
| http://pgfe.umassmed.edu/ZFPmo dularsearchV2.html | Design av modulær montering ZFN |
| www.genomecenter.ucdavis.edu/s egallab / segallabsoftware | Design av modulær montering ZFN |
Tabell 3. Online ressurser for å utforme ZFN, TALEN, og CRISPR/Cas9.
Discussion
Designer nukleasefritt drevet genom redigering tilnærminger har betydelig utvidet spekter av arter mottakelig for målrettede endringer for sine respektive genomer 10,12. Hos mus, har genet målretting i ES-celler vært en standard teknikk i over to tiår; har det imidlertid vist seg vanskelig å tilpasse seg ES celler fra andre enn musen arter, selv om det har vært noen nylige suksess i rotte ES-celler. Selv med tilgjengeligheten av "off-the-sokkel" gen-målrettet mus ES cell kloner levert av konsortier som EUCOMM, KOMP, eller NorCOMM tre genomet redigering av ZFN og TALEN gir høyere presisjon og fleksibilitet med hensyn til spekteret av endringer som kan være innføres i musegenomet. Grunnlegger dyr som bærer nukleasefritt mediert mutasjoner synes å være svært bakterie-linjen kompetent 4-6,20,21, noe som ikke alltid er tilfelle for chimeras stammer fra blastocyst injeksjoner av ES-celler. Derfor, i visse tilfeller mikroinjeksjon av designer nukleaser kan resultere i betydelig raskere generasjon av nye mus linjer med målrettede genom modifikasjoner.
Den vellykkede generasjonen av knockout mus ved injeksjon av ZFN og TALEN avhenger i stor grad på aktiviteten av den injiserte nuclease pair. Talens har vist seg å ha en høy suksessrate på målrettet mot et bredt spekter av gener i en rekke organismer; men nylige studier antyder at TALEN binding er følsom for cytosin metylering 30,31. således nylig genererte nuklease par, for eksempel Talens klonet inn pCAG-T7 vektorer, kan bli transfektert inn i en forbigående musecellelinje slik som NIH-3T3 eller Neuro -2a, som etterligner kromatin tilstanden i mus embryo i en viss grad. Her kan nukleaseaktivitet beregnes ved hjelp av T7 endonuclease analysen eller en begrensning sammendrag av PCR produktet som beskrevet i kapittel 5 før mRNA syntese og mikroinjeksjon. Vi anbefaler sekvensering av genomet regionen av interesse i respektive cellelinje og musen stamme brukt for mikroinjeksjon eksperimenter.
I muse zygotes, vil ulike Talen eller ZFN parene fungere optimalt på forskjellige mRNA konsentrasjoner og dermed den optimale arbeids konsentrasjonen av microinjected nuclease mRNA kan måtte bestemmes eksperimentelt. Avhengig av nuklease-par, vil en for lav konsentrasjon resulterer i ingen spaltning, mens for høyt kan resultere i embryoletalitet. Avhengig av nuklease paret, vi har hatt suksess ved hjelp totale mRNA-konsentrasjoner så lave som 2 ng / mL, og så høy som 200 ug / ul. Disse effekter er vanskelige å forutsi fra eksperimenter i cellekultur, og den nuklease konsentrasjon optimal for begge embryo overlevelse og modifisering hastighet av målet locus må bestemmes empirisk.
Meget aktiv ZFN eller TALEN kan holde seg sine mål sekvens utover ett-celle stadium av microinjected embryo og dermed føre til komplekse mønstre av mutagenesis end mosaicism i grunnleggere. Vi og andre 4 har observert tre eller flere distinkte muterte alleler i en enkelt grunnlegger (figur 5C). Således, ved etablering av en ny mus linje fra disse erne, avkom bør nøye vist ved sekvensering for nærvær av den gunstige mutasjon siden fordøyelse assays gi bevis på at bare en udefinert mutasjon er tilstede.
En av kritikk ofte uttrykt mot ZFN og Talen systemer er muligheten for at disse nukleaser er også i stand til å spalte sekvenser tilstede et annet sted i genomet som er lik mål-områder. Slike off-target effekter har blitt observert med tidlig generasjon reagenser bruker homodimeric FoKI domene, og heterodimer konstruerer ble utformet for å lindre off-target effekter 25. Potensielle off-målnettsteder kan bli spådd til en viss grad i silico 32,33 og skjermet av PCR og sekvensering. En åpenbar fordel of ved hjelp av ZFNs og Talens for generering av musene i stedet for cellelinjer er muligheten for fjerning av target mutasjoner ukoblet til ønsket genomet modifikasjon ved å utføre flere backcrosses til en vill-type stamme av valget. For analyse av et stort antall stifter mus, neste generasjons dyp sekvensering av PCR-produkter generert fra nuklease-målrettede locus og in silico predikerte off-target loci kan tilby en alternativ kvalitativ og kvantitativ avlesning til råtneanalyser av PCR-produkter.
De assistert befruktning som er beskrevet i denne protokollen er optimalisert for standard musestammer som brukes til mikroinjeksjon eksperimenter som C57BL/6J eller B6D2F1. Mus av forskjellig opprinnelse, slik som utav belastninger, kan i prinsippet benyttes til genom redigering metoder, og kan tilveiebringe en mer egnet genetisk bakgrunn for spesielle problemstillinger. Ytelsen til assistert reproduksjon som for eksempel superovulering kan være predicted for en rekke stammer 34-36, men kan kreve ytterligere optimalisering for ikke-standardiserte stammer for å få et tilstrekkelig antall embryoer for nuclease mikroinjeksjon.
Foruten ZFN og TALEN, har nye designer nukleaser som RNA-guidet CRISPR/Cas9 system 9,37,38 nå blitt introdusert for genom redigeringsprogrammer. Alle metoder for mikroinjeksjon og analyse av grunnlegger dyr som er beskrevet her er også gjeldende for CRISPR/Cas9 og fremtidige moduser av genomet redigering.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Monika Tarnowska, Cornelia Albrecht, og Ewa Skoczylas for utmerket teknisk assistanse. Denne studien ble finansiert av SNF Sinergia stipend CRSI33-125073 til PP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BsaI | NEB | R0535S or L | |
| Esp3I | Thermo Scientific | ER0451 | |
| T4 Ligase | NEB | M0202S or L | |
| Spectinomycin | Sigma | S0692-1ML | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | |
| X-Gal | Sigma | B4252 | |
| IPTG | Sigma | I6758 | |
| Plasmid-Safe nuclease | Epicentre | E3101K | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAGEN Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit | Invitrogen | AM1345 | |
| NucAway Spin Columns | Invitrogen | AM10070 | |
| RNaseZAP | Sigma | R2020-250ML | |
| NorthernMax Formaldyde Load Dye | Invitrogen | AM8552 | |
| RNA Millennium Markers | Invitrogen | AM7150 | |
| 10x TBE buffer | Thermo Scientific | B52 | |
| T7 endonuclease | NEB | M0302S or L | |
| pGEM-T EasyVector System I | Promega | A3600 | |
| SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S-7563 | |
| pregnant mare's serum gonadotrophin (PMSG) | Sigma | G4877 | |
| human chorionic gonadotropin (hCG) | Sigma | CG5 | |
| M2 embryo culture medium | Sigma | M7167 | |
| M16 embryo culture medium | Sigma | M7292 | |
| Mineral oil, embryo tested | Sigma | M8410 | |
| Ketamine | CentraVet | Ket 201 | |
| Xylazine | Sigma Aldrich | 46995 | |
| Equipment/Tools | |||
| Inverted microscope with Nomarski DIC optics (for example Nikon Eclipse TE200) | Nikon | ||
| Micromanipulator units (for example Narishige, NT88NF) | Narishige | ||
| Embryo holding capillaries | Sutter Instruments | B100-75-10 | |
| Embryo injection capillaries | Narishige | GD-1 | |
| Capillary puller (for example Sutter P97) | Sutter Instruments | ||
| Microforge (for example Narishige MF-900) | Narishige | ||
| Walton skin scissors | FST | 14077-10 | |
| Surgical scissors | FST | 14041-10 | |
| Surgical probe | FST | 10140-03 | |
| Reflex wound clip system (9 mm) | FST | 12031-09 | |
| Reflex wound clips (9 mm) | FST | 12032-09 | |
| Dumont fine forceps 5 | FST | 11254-20 | |
| Moria curved forceps | FST | 11370-31 | |
| Moria fine forceps | FST | 11399-80 | |
| Dietrich bulldog clamp | FST | 18038-45 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Labs | strain code 000664 | |
| CD-1 mice | Charles River | strain code 000664 | |
References
- Capecchi, M. R. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. Nat. Rev. Genetics. 6, 507-512 (2005).
- Johansson, T., et al. Building a zoo of mice for genetic analyses: a comprehensive protocol for the rapid generation of BAC transgenic mice. Genesis. 48, 264-280 (2010).
- Skarnes, W. C., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474, 337-342 (2011).
- Carbery, I. D., et al. Targeted genome modification in mice using zinc-finger nucleases. Genetics. 186, 451-459 (2010).
- Meyer, M., de Angelis, M. H., Wurst, W., Kuhn, R. Gene targeting by homologous recombination in mouse zygotes mediated by zinc-finger nucleases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15022-15026 (2010).
- Cui, X., et al. Targeted integration in rat and mouse embryos with zinc-finger nucleases. Nat. Biotechnol. 29, 64-67 (2011).
- Sung, Y. H., et al. Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting. Nat. Biotechnol. 31, 23-24 (2013).
- Wefers, B., et al. Direct production of mouse disease models by embryo microinjection of TALENs and oligodeoxynucleotides. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 3782-3787 (2013).
- Wang, H., et al. One-Step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
- Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat. Rev. Genetics. 11, 636-646 (2010).
- ZFN, T. A. L. E. N. CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31, 397-405 (2013).
- Joung, J. K., Sander, J. D. TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 14, 49-55 (2013).
- Cermak, T., et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res. 39, (2011).
- Reyon, D., et al. FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing. Nat. Biotechnol. 30, 460-465 (2012).
- Sanjana, N. E., et al. A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering. Nat. Protoc. 7, 171-192 (2012).
- Kim, Y., et al. A library of TAL effector nucleases spanning the human genome. Nat. Biotechnol. 31, 251-258 (2013).
- Schmid-Burgk, J. L., Schmidt, T., Kaiser, V., Honing, K., Hornung, V. A ligation-independent cloning technique for high-throughput assembly of transcription activator-like effector genes. Nat. Biotechnol. 31, 76-81 (2013).
- Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat. Biotechnol. 31, 827-832 (2013).
- Fu, Y., et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat. Biotechnol. 31, 822-826 (2013).
- Hermann, M., et al. Evaluation of OPEN zinc finger nucleases for direct gene targeting of the ROSA26 locus in mouse embryos. PLoS ONE. 7, (2012).
- Meyer, M., Ortiz, O., Hrabe de Angelis, M., Wurst, W., Kuhn, R. Modeling disease mutations by gene targeting in one-cell mouse embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 9354-9359 (2012).
- Doyle, E. L., et al. TAL Effector-Nucleotide Targeter (TALE-NT) 2.0: tools for TAL effector design and target prediction. Nucleic Acids Res. 40, 117-122 (2012).
- Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat. Biotechnol. 29, 143-148 (2011).
- Guo, J., Gaj, T., Barbas, C. F. 3rd Directed evolution of an enhanced and highly efficient FokI cleavage domain for zinc finger nucleases. J. Mol. Biol. 400, 96-107 (2010).
- Doyon, Y., et al. Enhancing zinc-finger-nuclease activity with improved obligate heterodimeric architectures. Nat. Methods. 8, 74-79 (2011).
- Wefers, B., et al. Current Protocols in Mouse Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2011).
- Wefers, B., Wurst, W., Kühn, R. Current Protocols in Mouse Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2011).
- Haueter, S., et al. Genetic vasectomy-overexpression of Prm1-EGFP fusion protein in elongating spermatids causes dominant male sterility in mice. Genesis. 48, 151-160 (2010).
- Perez-Pinera, P., Ousterout, D. G., Brown, M. T., Gersbach, C. A. Gene targeting to the ROSA26 locus directed by engineered zinc finger nucleases. Nucleic Acids Res. 40, 3741-3752 (2012).
- Bultmann, S., et al. Targeted transcriptional activation of silent oct4 pluripotency gene by combining designer TALEs and inhibition of epigenetic modifiers. Nucleic Acids Res. 40, 5368-5377 (2012).
- Valton, J., et al. Overcoming TALE DNA binding domain sensitivity to cytosine methylation. J. Biol. Chem. 287, 38427-38432 (2012).
- Cradick, T. J., Ambrosini, G., Iseli, C., Bucher, P., McCaffrey, A. P. ZFN-Site searches genomes for zinc finger nuclease target sites and off-target sites. BMC Bioinform. 12, (2011).
- Doyle, E. L., et al. TAL Effector-Nucleotide Targeter (TALE-NT) 2.0: tools for TAL effector design and target prediction. Nucleic Acids Res. 40, 117-122 (2012).
- Byers, S. L., Payson, S. J., Taft, R. A. Performance of ten inbred mouse strains following assisted reproductive technologies (ARTs). Theriogenology. 65, 1716-1726 (2006).
- Luo, C., et al. Superovulation strategies for 6 commonly used mouse strains. J. Am. Assoc. Lab. Animal Sci. 50, 471-478 (2011).
- Pease, S., Saunders, T. L. International Society for Transgenic Technologies. Advanced protocols for animal transgenesis : an ISTT manual. , Springer. (2011).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-Guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
