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Biology

डिजाइनर न्युक्लिअसिज़ का उपयोग कर माउस जीनोम इंजीनियरिंग

Published: April 2, 2014 doi: 10.3791/50930
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Institute of Laboratory Animal Science, University of Zurich, 2Department of Genetics, Cell Biology & Development and Center for Genome Engineering, University of Minnesota

Summary

ऐसे जस्ता उंगली न्युक्लिअसिज़ (ZFNs) और प्रतिलेखन उत्प्रेरक की तरह प्रेरक न्युक्लिअसिज़ (TALENS) के रूप में डिजाइनर न्युक्लिअसिज़ nonhomologous अंत में शामिल होने (NHEJ) और मुताबिक़ पुनर्संयोजन (मानव संसाधन) रास्ते दोनों ट्रिगर द्वारा माउस Preimplantation भ्रूण के जीनोम को संशोधित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इन अग्रिमों सटीक आनुवंशिक संशोधनों के साथ चूहों की तेजी पीढ़ी सक्षम.

Abstract

साइट विशेष जीनोम संशोधनों (पीटा, तोड़े में) ले जाने ट्रांसजेनिक चूहों जटिल जैविक प्रणालियों विदारक के लिए और साथ ही मानव रोगों मॉडलिंग और चिकित्सीय रणनीतियों के परीक्षण के लिए महत्वपूर्ण महत्व के हैं. ऐसे जस्ता उंगली न्युक्लिअसिज़ (ZFNs), प्रतिलेखन उत्प्रेरक की तरह प्रेरक न्युक्लिअसिज़ (TALENS), और क्लस्टर नियमित interspaced कम मुरजबंध संबंधी दोहराता (CRISPR) / के लिए CRISPR जुड़े (कैस) 9 सिस्टम साइट के रूप में डिजाइनर न्युक्लिअसिज़ के उपयोग में हाल के अग्रिमों विशिष्ट जीनोम इंजीनियरिंग भ्रूण स्टेम (ते) सेल प्रौद्योगिकी पर भरोसा करने के लिए आवश्यकता के बिना वास्तव में किसी भी प्रयोगशाला प्रजातियों में तेजी से लक्षित जीनोम संशोधन प्रदर्शन करने की संभावना खुला. एक जीनोम संपादन प्रयोग आम तौर पर अन्वेषक से परिभाषित जीनोमिक ठिकाना करने nuclease गतिविधि निर्देशित करने के लिए कस्टम डीएनए बाध्यकारी डोमेन के निर्माण द्वारा पीछा ब्याज की एक जीन के भीतर डिजाइनर nuclease लक्ष्य साइटों की पहचान के साथ शुरू होता है. डिजाइनर nuclease plasmids विट्रो में हैं </ उन्हें> निषेचित माउस oocytes के microinjection के लिए mRNA उत्पन्न करने के लिए लिखित. यहाँ, हम निषेचित माउस oocytes में talen mRNA की प्रत्यक्ष इंजेक्शन द्वारा लक्षित जीनोम संशोधन को प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं.

Introduction

चूहों ट्रांसजेनिक पशु मॉडल पैदा करने के लिए अब तक के सबसे लोकप्रिय मंच से कर रहे हैं. माउस भ्रूण 1-3 की जेनेटिक इंजीनियरिंग के लिए बहुमुखी उपकरण बॉक्स हाल ही में, जस्ता उंगली न्युक्लिअसिज़ (ZFN) के रूप में डिजाइनर न्युक्लिअसिज़ पर आधारित जीनोम संपादन दृष्टिकोण से 4-6, प्रतिलेखन उत्प्रेरक की तरह प्रेरक न्युक्लिअसिज़ (talen) 7,8 बढ़ा दिया गया है और क्लस्टर नियमित interspaced कम मुरजबंध संबंधी दोहराता (CRISPR) / CRISPR जुड़े (कैस) 9 प्रणाली 9. ZFN और प्रत्येक FokI endonuclease 10-12 के लिए मिलकर कर रहे हैं कि (क्रमशः जस्ता उंगली प्रोटीन की सरणियों और दोहराने चर डि अवशेष (RVDS),) दो कस्टम डिजाइन प्रोटीन आधारित डीएनए बाध्यकारी डोमेन के जोड़े के रूप में talen समारोह. इसके विपरीत, Cas9 की मध्यस्थता डीएनए दरार की विशिष्टता (यह भी एक एकल कैमेरिक शाही सेना अणु करार दिया गाइड शाही सेना में जोड़ा जा सकता है जो crRNA और tracrRNA,) CRISPR RNAs transactivating द्वारा प्रदान की जाती है के साथ एक जटिल में है कि अधिनियम 11CRISPR प्रोटीन.

RVDS की एक परिभाषित अनुक्रम के साथ TALENS तेजी से 13-17 चुनने के लिए विधानसभा की रणनीतियों की एक भीड़ के साथ व्यक्तिगत प्रयोगकर्ताओं द्वारा निर्माण किया जा सकता है. CRISPR/Cas9 हालांकि गाइड शाही सेना डीएनए की विशिष्टता अभी भी पूरी तरह से 18,19 हल नहीं है, बंधन, डिजाइनर न्युक्लिअसिज़ की भी कम श्रम प्रधान पीढ़ी का वादा किया. कस्टम ZFNs की पीढ़ी अब तक विशेष शैक्षिक प्रयोगशालाओं के लिए और इस तरह के Sangamo बायोसाइंसेज और सिग्मा CompoZr सेवा के रूप में वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ताओं के लिए सीमित कर दिया गया है.

सामान्य में, डिजाइनर न्युक्लिअसिज़ के साथ संपादन जीनोम बाद में शामिल होने nonhomologous अंत (NHEJ) या मुताबिक़ पुनर्संयोजन (मानव संसाधन) डीएनए की मरम्मत मशीनरी 10,12 आकर्षित जो परिभाषित जीनोमिक loci, पर डबल भूग्रस्त टूटता (डीएसबी) शुरू करने के लिए करना है. एक डीएसबी के NHEJ की मध्यस्थता मरम्मत अक्सर मरम्मत की साइट के पास सम्मिलन और विलोपन की शुरूआत में यह परिणाम है. इस प्रकार NHEJ मरम्मत गएक जीन प्रोटीन कोडिंग अनुक्रम 4,7,9 के भीतर एक फ्रेम पारी उत्परिवर्तन शुरू करने से एक लक्ष्य जीन के समारोह में दस्तक के लिए शोषण किया जा. वैकल्पिक रूप से, परिभाषित अलावा या आनुवांशिक जानकारी के प्रतिस्थापन डिजाइनर न्युक्लिअसिज़ के साथ मिलकर एक डीएनए दाता प्रदान करके प्राप्त किया जा सकता है. एक डीएनए दाता इस प्रकार मानव संसाधन द्वारा डीएसबी की मरम्मत के लिए एक टेम्पलेट के रूप में सेवारत, लक्ष्य ठिकाना साथ अनुरूपता के क्षेत्रों से घिरे अन्वेषक से डिजाइन डीएनए अनुक्रम शामिल हैं. Plasmids 5,6,20 और एकल असहाय oligonucleotides 8,9,21 दोनों को सफलतापूर्वक दाताओं के रूप में इस्तेमाल किया गया है. NHEJ और न ही ऑफिस की मध्यस्थता जीनोम संपादन न तो समग्र आनुवंशिक संरचना के बिना परेशान nucleotide अनुक्रम में छोटे परिवर्तन बनाने के लिए इन रणनीतियों विशेष रूप से अच्छी तरह से अनुकूल बनाता है जो माउस भ्रूण के जीनोम में एक चयन मार्कर की शुरूआत की आवश्यकता होती है.

इस प्रोटोकॉल में हम में जीनोम संपादन के लिए सभी आवश्यक प्रक्रियाओं का वर्णनTALENS का उपयोग माउस भ्रूण. ये एक talen लक्ष्य साइट 22 में से 1) पहचान शामिल है, गोल्डन गेट क्लोनिंग 13 से TALENS के 2) निर्माण, talen mRNA, निषेचित माउस oocytes, भ्रूण स्थानांतरण के लिए 5) शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं में talen mRNA की 4) microinjection की 3) इन विट्रो संश्लेषण , और 6) के संस्थापक पशुओं में talen प्रेरित mutagenesis का विश्लेषण. हम talen mRNA microinjection और NHEJ प्रेरित सम्मिलन / विलोपन के लिए संस्थापकों की स्क्रीनिंग पर ध्यान केंद्रित. इस उद्देश्य के लिए हम plasmids के रूप में और माउस भ्रूण में microinjection के लिए talen mRNA की इन विट्रो संश्लेषण में ट्रांसफ़ेक्ट जब स्तनधारी कोशिकाओं में दोनों अभिव्यक्ति की अनुमति है कि bifunctional talen निर्माणों उत्पन्न किया है. इन निर्माणों heterodimeric FokI से जुड़े हुए एक छोटा कहानी रीढ़ 23 स्तनधारी कोशिकाओं में इष्टतम जीनोम संपादन के लिए 24,25 डोमेन शामिल हैं. इस प्रोटोकॉल भी अन्य डिजाइनर न्युक्लिअसिज़ के microinjection के लिए या डिजाइनर न्युक्लिअसिज़ के संयुक्त इंजेक्शन के लिए अपनाया जा सकता हैऔर दाता निर्माणों (डीएनए दाताओं की डिजाइन WEFERS एट अल. 26,27 से उत्कृष्ट तकनीकी प्रकाशनों में वर्णित किया गया है).

एथिकल विवरण

सभी पशु प्रयोगों केंटन ज्यूरिख के केंटन पशु चिकित्सा कार्यालय के दिशा निर्देशों और नियमों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया.

Protocol

1. Talen लक्ष्य साइटों की पहचान

  1. ताल effector के Nucleotide Targeter 2.0 वेबसाइट (http://tale-nt.cac.cornell.edu) पर जाएँ और "talen Targeter" चुनें.
  2. लक्ष्य जीन के अनुक्रम दर्ज करें. PCAG-T7-talen अभिव्यक्ति इस्तेमाल किया जा रहा है निर्माण करती हैं (चित्रा 1C) का चयन "मिलर एट अल., 2011" के तहत (इष्टतम स्पेसर लंबाई के साथ लक्षित किया जा सकता है कि लक्ष्य साइटों की भविष्यवाणी करने के क्रम में "एक पूर्व निर्धारित वास्तुकला का उपयोग करें" 15-20 बीपी) और इस talen वास्तुकला के लिए कहानी RVDS (15-20) की संख्या.
  3. "जी विकल्प" के अंतर्गत "एनएन" चुनें (ग्वानोसिन विशेष एनएच RVDS भी उपलब्ध हैं, लेकिन अभी तक नहीं बड़े पैमाने पर talen विधानसभा के लिए परीक्षण).
  4. वैकल्पिक: अन्य सेटिंग्स और विकल्प के लिए वेबसाइट पर निर्देश और वहां दिए गए लिंक का पालन करें.
  5. संभावित लक्ष्य साइटों के साथ एक textfile हो सकता है, जो उत्पन्न होता हैअधिक सुविधाजनक देखने के लिए एक स्प्रेडशीट प्रोग्राम में आयात किया. गोल्डन गेट विधानसभा के लिए talen जोड़ी (ओं) का चयन करें.
  6. वैकल्पिक: अनुक्रम सार्वजनिक डेटाबेस में के लिए जिम्मेदार है और नहीं भी हो सकता है कि संभव एकल nucleotide बहुरूपताओं (SNPs) का पता लगाने के लिए microinjection के लिए उपयोग किया जाएगा जो माउस तनाव में ब्याज की जीनोमिक क्षेत्र संभवतः बंधन nuclease रोकने सकता है.
  7. वैकल्पिक: अतिरिक्त डिजाइनर न्युक्लिअसिज़ से संबंधित ऑनलाइन संसाधनों के लिए 3 टेबल को देखें.
  8. ZFN और talen निर्माण के लिए आवश्यक अधिकांश plasmids Addgene से प्राप्त किया जा सकता है:
    http://www.addgene.org/special-collections/
    गोल्डन गेट talen किट और स्तनधारी talen अभिव्यक्ति निर्माणों के लिए Addgene आईडी के 2 टेबल में प्रदान की जाती हैं.
    वैकल्पिक रूप से, इस तरह जस्ता उंगली डोमेन के रूप में विशेष कार्यात्मक मॉड्यूल एक जीन संश्लेषण सेवा प्रदाता से आदेश दिया जा सकता है.

यह खंड Cermak एट अल. 13 पूर्ण लंबाई TALENS दो बाद गोल्डन गेट क्लोनिंग कदम (चित्रा 1) के प्रयोग का निर्माण कर रहे हैं द्वारा प्रकाशित एक प्रोटोकॉल का उपयोग TALENS की विधानसभा का वर्णन करता है. इस दृष्टिकोण के अंतिम अभिव्यक्ति निर्माणों में 12 और 31 के बीच RVDS के किसी भी संख्या का समावेश अनुमति देता है. विधानसभा प्रोटोकॉल oocyte microinjection निम्नलिखित अत्यधिक सक्रिय TALENS व्यक्त कि पैदा mRNAs (चित्रा 1C) के लिए डिजाइन गंतव्य वैक्टर करने के लिए अनुकूलित किया गया है. भी (स्थापित करने और प्लाज्मिड पुस्तकालय को बनाए रखने के लिए गोल्डन गेट talen किट की ऑनलाइन प्रोटोकॉल का संदर्भ लें http://www.addgene.org/TALeffector/goldengateV2/ ).

  1. दिन 1 - गोल्डन गेट रिएक्शन # 1 - pFUS वैक्टर में RVD सारणियों की सभा
    1. वैकल्पिक: पी में बनाया गया प्रत्येक talen जोड़ी के लिएrotocol 1, प्रत्येक गोल्डन गेट प्रतिक्रिया के लिए एक pipetting योजना उत्पन्न करने के लिए TALEN_Voytas_Pipetting स्प्रेडशीट में '(3 के लिए' प्रारंभिक टी, 5 सहित) के दो लक्ष्य साइटों के डीएनए अनुक्रम में प्रवेश (भी विधानसभाओं के लिए उपयोग किए गए सभी plasmids के सांद्रता दर्ज ). स्प्रेडशीट भी खंड 2.5.2 में अनुक्रमण परिणामों के संरेखण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि सभी RVDS की उम्मीद डीएनए अनुक्रम प्रदान करता है.
    2. हर अद्वितीय talen प्रोटोकॉल 1 में बनाया गया के लिए:
      Talen लंबाई 12-21 (मानक), का चयन दोहराने चर डि अवशेष (RVDS) 1-10 और गंतव्य वेक्टर pFUS_A है. शेष RVDS और खंड 2.3.3 में अंतिम विधानसभा में जोड़ दिया जाएगा जो पिछले दोहराने चुनें, RVDS 11-14 और गंतव्य वेक्टर pFUS_B4 (चित्रा 1 ए) सहित 15 RVDS (साथ एक talen के लिए जैसे एक pFUS_B गंतव्य वेक्टर, का चयन करें.
      Talen लंबाई 22-31 है, तो उपयोग RVDS 1-10 और गंतव्य vector pFUS_A30A. RVDS 11-20 और गंतव्य वेक्टर pFUS_A30B उठाओ. शेष RVDS और 24 RVDS RVDS 21-23 और गंतव्य वेक्टर pFUS_B3 लेने के साथ talen के लिए जैसे एक pFUS_Bdestination वेक्टर, का चयन करें.
    3. अब से 21 RVDS, 1-10 + pFUS_A30A, 11-20 pFUS_A30B, और शेष RVDS प्रत्येक pFUS + RVD संयोजन अलग, यानी 1-10 + pFUS_A और शेष RVDS + संबंधित pFUS_B वेक्टर के लिए या talen के लिए गोल्डन गेट प्रतिक्रिया # 1 सेट करें + संबंधित pFUS_B वेक्टर. 20 μl कुल प्रतिक्रिया मात्रा करने के लिए प्रत्येक RVD वेक्टर के 150 एनजी, pFUS वेक्टर के 150 एनजी, 1 μl BsaI, 1 μl टी -4 डीएनए ligase, 2 μl 10x टी -4 डीएनए ligase बफर, और एच 2 ओ का प्रयोग करें. (टी -4 ligase बफर के दोहराया विगलन / ठंड प्रतिक्रियाओं की क्षमता को कम कर सकते हैं के बाद से गोल्डन गेट विधानसभाओं के हर दौर के लिए टी -4 ligase बफर के ताजा aliquots का उपयोग की सिफारिश की है.)
    4. एक थर्मामीटरों cycler में गोल्डन गेट प्रतिक्रियाओं जगह.
      कार्यक्रम:
      37 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट
      16 डिग्री सेल्सियस 10 मिनट
      50 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट
      80 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट
    5. प्रत्येक मिश्रण करने के लिए 1 μl 10 मिमी एटीपी और 1 μl प्लाज्मिड सुरक्षित nuclease जोड़ें और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. इस इलाज तब्दील बैक्टीरिया में vivo मुताबिक़ पुनर्संयोजन द्वारा गंतव्य वैक्टर में क्लोन किया जा सकता है कि रैखिक अधूरा बंधाव उत्पादों को हटा देगा.
    6. ई. रूपांतरण व्यक्तिगत बंधाव प्रतिक्रियाओं के साथ कोलाई (जैसे XL1 ब्लू या DH5α रूप α-पूरक सुविधा है कि electrocompetent या रासायनिक सक्षम ई. कोलाई यहाँ और बाद परिवर्तनों में इस्तेमाल किया जा सकता है).
    7. एक्स लड़की और IPTG साथ spectinomycin पर प्लेट बैक्टीरिया (50 माइक्रोग्राम / एमएल) प्लेटें नीले / सफेद कॉलोनी चयन के लिए (40 माइक्रोग्राम / प्रत्येक एमएल).
  2. 2 दिन - सही pFUS-RVDS विधानसभा की पुष्टि
    1. प्राइमरों pCR8_F1 और pCR8_R1 साथ कॉलोनी पीसीआर का उपयोग करके (प्राइमर दृश्यों के लिए 1 टेबल देखें) स्क्रीन 1-3 सफेदप्रत्येक थाली से कालोनियों. सही pFUS-RVDS विधानसभाओं आम तौर पर संयुक्त क्लोन सभी RVDS (10 RVDS के लिए जैसे लगभग 1.1 केबी) की लंबाई और इसी को एक बैंड दिखाने के एक छोटे कम प्रमुख बैंड (चित्रा 1 बी) के "सीढ़ी".
      पीसीआर कार्यक्रम:
      95 डिग्री सेल्सियस 3 मिनट
      95 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड
      55 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड
      72 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट 45 सेकंड
      30-35 चक्र
      72 डिग्री सेल्सियस 10 मिनट
    2. उपयोग (50 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर spectinomycin साथ 2-5 मिलीलीटर पौंड) रातोंरात संस्कृति शुरू करने के लिए क्लोन की पुष्टि की.
  3. दिन 3 - गोल्डन गेट रिएक्शन # 2 - talen अभिव्यक्ति वैक्टर में RVD सारणियों
    1. (RVDS pFUS_A और pFUS_B या pFUS_A30A, pFUS_A30B, और pFUS_B या तो की संख्या के आधार पर) pFUS-RVD असेंबलियों को अलग करने के लिए "minipreps" प्रदर्शन करना.
    2. वैकल्पिक: प्राइमरों pCR8_F1, pCR8_R1 (प्राइमर दृश्यों के लिए 1 टेबल देखें) का उपयोग कर अनुक्रम व्यक्ति pFUS वैक्टर. अनुक्रमण भी महिला पर किया जा सकता हैinal talen constructs (धारा 2.5.2); हालांकि, अब TALENS पूरा के लिए सेंगर अनुक्रमण का उपयोग संभव नहीं हो सकता है सभी RVDS की पढ़ता है.
    3. प्रत्येक एकल talen के लिए गोल्डन गेट प्रतिक्रिया # 2 सेट करें. प्रत्येक pFUS वेक्टर के 150 एनजी, RVD अनुक्रम की डिजाइन करने के लिए और एल ईएफटी talen 75 एनजी उपयोग के लिए अनुसार पीएलआर HD, मूल उधार दर एनजी, पीएलआर-नी, पीएलआर एनएन (पिछले "आधा दोहराने") के 150 एनजी pCAG-T7-talen-वृद्धावस्था गंतव्य की और सही talen 75 एनजी pCAG-T7-talen-केकेआर गंतव्य (या इसके विपरीत) का उपयोग के लिए. 1 μl Esp3I, 1 μl टी -4 डीएनए ligase, 2 μl 10x टी -4 डीएनए ligase बफर जोड़ें, एच 2 ओ से 20 μl कुल प्रतिक्रिया मात्रा.
    4. एक थर्मामीटरों cycler में गोल्डन गेट प्रतिक्रियाओं जगह.
      कार्यक्रम:
      37 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट
      16 डिग्री सेल्सियस 10 मिनट
      10 चक्रों
      37 डिग्री सेल्सियस 15 मिनट
      80 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट
    5. ई. को बदलने के लिए खंड 2.3.4 से प्रतिक्रियाओं का प्रयोग करें कोलाई.
  4. <मजबूत> दिवस 4 - सही talen विधानसभा की पुष्टि
    1. कॉलोनी प्राइमरों TAL_F1 साथ पीसीआर और TAL_R2 द्वारा प्रत्येक थाली से स्क्रीन 1-3 सफेद कालोनियों (प्राइमर दृश्यों के लिए 1 टेबल देखें). सही ढंग से इकट्ठा TALENS एक लम्बाई (चित्रा -1, इस बैंड "सीढ़ी प्रभाव" सफल विधानसभा की एक मजबूत सूचक का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि पता लगाने के लिए कभी कभी मुश्किल है) शामिल RVDS की कुल संख्या को इसी के साथ एक पीसीआर उत्पाद दिखा.
      पीसीआर कार्यक्रम:
      95 डिग्री सेल्सियस 3 मिनट
      95 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड
      55 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड
      72 डिग्री सेल्सियस 3 मिनट
      30-35 चक्र
      72 डिग्री सेल्सियस 10 मिनट
    2. इस्तेमाल की रात भर बैक्टीरियल संस्कृतियों (2-5 एमएल 100 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन के साथ लेग) शुरू करने के लिए सही क्लोन की पुष्टि की.
  5. 5 दिन - सही talen विधानसभा की पुष्टि
    1. PCAG-T7-talen plasmids अलग करने के लिए "minipreps" प्रदर्शन करना.
    2. अनुक्रमण एसई में प्रदर्शन नहीं थाction 2.3.2, उपयोग प्राइमरों TAL_Seq_5 -1 और TAL_R2 पूर्ण लंबाई talen में सही RVD विधानसभा निर्धारित करने के लिए (प्राइमर दृश्यों के लिए 1 टेबल देखें).

3. Nuclease mRNA संश्लेषण

  1. डीएनए टेम्पलेट का सृजन
    1. उच्च गुणवत्ता मिडी या mRNA संश्लेषण के लिए pCAG-T7-talen plasmids के maxipreps तैयार करें.
    2. Preferentially cleaves अनुप्रवाह और nuclease बंद codon के पास (pCAG-T7-talen वैक्टर के लिए Saci का उपयोग करें) कि एक प्रतिबंध एंजाइम का उपयोग talen या ZFN mRNA संश्लेषण प्लाज्मिड की 10 ग्राम linearize. mRNA संश्लेषण plasmids आम तौर पर nuclease कोडन अनुक्रम की नदी के ऊपर एक T7 या SP6 फेज प्रमोटर शामिल हैं.
    3. पूरा पाचन के लिए जाँच करने के लिए एक 0.7-1% agarose जेल पर पचा प्लाज्मिड के 200-500 एनजी चलाएँ.
    4. कमरे temperatur पर 1 घंटे के लिए 0.1 मात्रा सोडियम एसीटेट और 3 खंडों इथेनॉल के साथ डीएनए precipitating से पचा प्लाज्मिड से लवण निकालेंई. इथेनॉल, हवा RNase मुफ्त पानी का एक उचित मात्रा में गोली और resuspend सूखी हटाने, एक और 5 मिनट के लिए, 200 70 μl% इथेनॉल के साथ स्पिन गोली धोने, 10 मिनट के लिए 14,000 XG या अधिक पर centrifugation द्वारा डीएनए गोली. Linearized प्लाज्मिड की शुद्धि एक स्तंभ आधारित प्रणाली, जैसे QIAquick पीसीआर शोधन किट का उपयोग भी संभव है.
    5. रेखीय टेम्पलेट की एकाग्रता का निर्धारण और इन विट्रो प्रतिलेखन में स्थापित करने के लिए 1 ग्राम का उपयोग करें.
  2. mRNA संश्लेषण और polyadenylation
    1. PCAG-T7-talen के इन विट्रो प्रतिलेखन के लिए plasmids mMESSAGEmMACHINE T7 अल्ट्रा किट का उपयोग करें. Nuclease मुक्त पानी के साथ 20 μl, 10 μl T7 2x एनटीपी / ARCA, 2 μl 10x T7 प्रतिक्रिया बफर, डीएनए टेम्पलेट की 1 ग्राम, 2 μl T7 एंजाइम मिश्रण करने के लिए: बर्फ पर प्रत्येक talen के लिए प्रतिलेखन प्रतिक्रिया सेट करें. प्रतिक्रिया मिश्रण और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1-2 घंटे के लिए सेते
    2. पूरा 20 μl transcrip का प्रयोग करेंnuclease मुक्त पानी के 36 μl, 20 μl 5x EPAP बफर, 10 μl 25 मिमी MnCl2, 10 μl 10 मिमी एटीपी: बर्फ पर polyadenylation प्रतिक्रिया स्थापित करने के लिए tion प्रतिक्रिया मिश्रण. मिक्स और (क्रमशः, बाएँ और दाएँ nuclease के लिए) नियंत्रण के नमूने L1 और R1 के रूप में प्रतिक्रिया मिश्रण के 2.5 μl हटा दें. ई पीएपी एंजाइम की 4 μl जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 45-60 मिनट के लिए प्रतिक्रिया सेते नियंत्रण के नमूने L2 और R2 के रूप में प्रतिक्रिया मिश्रण का एक और 2.5 μl निकालें.
  3. mRNA शोधन
    1. MRNA शुद्धि (बफर विनिमय और अनिगमित nucleotides के हटाने) के लिए NucAway स्पिन स्तंभों का उपयोग. स्तंभ के नीचे में सूखा जेल व्यवस्थित करने के लिए कॉलम टैप करें. RNase मुक्त microinjection बफर (1 मिमी Tris-सीएल, 0.1 EDTA, 7.5 पीएच) के 650 μl के साथ हाइड्रेट स्तंभ. कैप, भंवर, हवाई बुलबुले बाहर नल, और कमरे के तापमान पर 5-15 मिनट के लिए हाइड्रेट.
    2. एक संग्रह ट्यूब और स्पिन में स्तंभ रखें750 XG पर, 4 डिग्री सेल्सियस 2 मिनट के लिए अतिरिक्त मध्य द्रव को दूर करने के लिए. एक 1.5 मिलीलीटर क्षालन ट्यूब में संग्रह ट्यूब और जगह स्तंभ त्यागें.
    3. 750 XG, 2 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्तंभ और स्पिन करने के लिए खंड 3.2.2 से पूरा प्रतिक्रिया मिश्रण लागू करें. Nuclease mRNA अब microinjection बफर में भंग कर दिया जाएगा. शुद्ध नमूने L3 और R3 के 2.5 μl निकालें.
    4. -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर mRNA microinjection aliquots तैयार कर रहे हैं जब तक.
  4. mRNA जेल वैद्युतकणसंचलन
    1. 10% एसडीएस समाधान या RNaseZAP का उपयोग RNAse संदूषण दूर करने के लिए एक जेल चैम्बर साफ करें.
    2. 1xTBE चल बफर में एक 1% agarose जेल तैयार करें.
    3. NorthernMax Formaldehyde लोड डाई के 3 संस्करणों के साथ प्रत्येक शाही सेना नमूना L1/R1, L2/R2, L3/R3 मिक्स और 65 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते
    4. लोड नमूने और जेल पर एक शाही सेना आकार सीढ़ी (जैसे शाही सेना मिलेनियम आकार मार्कर)लोड हो रहा है डाई जेल के अंत तक पहुँचता है और 1x TBE में 10 वी / सेमी में जेल चला रहे हैं.
    5. कमरे के तापमान पर आंदोलन के साथ 30-60 मिनट के लिए SYBR हरी समाधान (Invitrogen) का उपयोग कर जेल दाग.
    6. छवि जेल और L2/R2 और L3/R3 साथ L1/R1 के आकार की तुलना करें. नमूने L2/R2 और L3/R3 (चित्रा 2) में सफल polyadenylation का संकेत L1/R1 के सापेक्ष एक वृद्धि आकार के बैंड दिखाना चाहिए.
    7. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग mRNA एकाग्रता का निर्धारण.
    8. एक 1:1 अनुपात में छोड़ दिया nuclease और सही nuclease mRNA मिश्रण से microinjections के लिए mRNA aliquots तैयार करें. हम microinjection बफर के साथ गिराए द्वारा 200 एनजी / μl की कुल एकाग्रता (प्रत्येक nuclease के 100 एनजी / μl) के साथ aliquots तैयारी की सलाह देते हैं. सेल्सियस -80 पर स्टोर mRNA aliquots

4. भ्रूण अलगाव और microinjection

  1. भ्रूण अलगाव. इस प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक C57BL/6J और BDF1 तनाव के साथ इस्तेमाल किया गया हैएस और सबसे अधिक संभावना है जो सामान्य रूप से इस तरह के FVB या CBF1 रूप microinjection प्रयोगों में इस्तेमाल अन्य उपभेदों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. चूहों भोजन और पानी यथेच्छ के साथ एक तापमान और आर्द्रता नियंत्रित सुविधा में एक 12 HR-12 घंटा प्रकाश अंधेरे चक्र के तहत आते हैं.
    1. Superovulate दाता महिलाओं भ्रूण की उपज बढ़ाने के लिए. (4 सप्ताह पुराना) 16 महिलाओं के 48 घंटे बाद 5 आइयू मानव chorionic gonadotropin (एचसीजी) के आईपी इंजेक्शन द्वारा पीछा 5 आइयू गर्भवती घोड़ी सीरम gonadotropin (PMSG) की intraperitoneal इंजेक्शन (आईपी), द्वारा superovulated रहे हैं.
    2. 16 प्रजनन आयु (2-8 महीने) के लिए 16 superovulated महिलाओं मेट तुरंत एचसीजी इंजेक्शन के बाद पुरुषों.
    3. ऐसे सीओ 2 साँस लेना के रूप में एक अनुमोदित इच्छामृत्यु प्रोटोकॉल का उपयोग महिलाओं बलिदान.
    4. निषेचित oocytes वसूल लेंगे. Oocytes अगली सुबह oviducts से एकत्र की है और तब M2 मध्यम में भंग 0.1% गोजातीय hyaluronidase में एक 3-5 मिनट के उपचार के द्वारा किसी भी शेष मेघपुंज कोशिकाओं से मुक्त कर रहे हैं. संभोग प्रदर्शन और इस्तेमाल तनाव के आधार पर भ्रूण उपज भिन्न हो सकते हैं. BDF1 क्रमश: 300-400 निषेचित oocytes उपज जबकि 16 C57BL/6J महिलाओं को आमतौर पर 150-250 का उत्पादन.
  2. भ्रूण Microinjection
    1. Nuclease mRNA इंजेक्षन. Pronuclear चरण oocytes आम तौर पर जल्दी दोपहर में इंजेक्ट कर रहे हैं. Cytoplasmic mRNA microinjection 20x उद्देश्य का उपयोग Nomarski डीआईसी के साथ और भ्रूण micromanipulators के साथ ही एक इंजेक्शन यूनिट से लैस एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग खनिज तेल के तहत M2 मध्यम में किया जाता है. हम 10 एनजी / μl के एक एकाग्रता (कुल 20 एनजी / μl) में talen mRNA की इंजेक्शन शुरू होने की सलाह देते हैं.
    2. एक होल्डिंग केशिका साथ oocyte Aspirate और pronuclei साथ संपर्क परहेज भ्रूण की कोशिका द्रव्य में nuclease mRNA इंजेक्षन. इंजेक्शन प्लाज्मा झिल्ली के करीब, उथले होना चाहिए. इंजेक्शन की मात्रा कम रखा जाना चाहिए और microinjection सुई बुद्धि होना चाहिएcytoplasmic बढ़ाव का पहला संकेत पर hdrawn. एक microinjection श्रृंखला सामान्य रूप से 100-300 oocytes शामिल होंगे. आमतौर पर, भ्रूण के कम से कम 80-90% तत्काल सेल के बिना इंजेक्शन जीवित रहने चाहिए.
    3. Microinjection के बाद 37 डिग्री सेल्सियस M16 (सिग्मा) मध्यम में 1 घंटे के लिए भ्रूण जगह और 5% सीओ 2 और pseudopregnant पालक माताओं में जीवित भ्रूण हस्तांतरण.

5. सर्जिकल भ्रूण स्थानांतरण

  1. Pseudopregnant भ्रूण प्राप्तकर्ता (पालक माताओं) mRNA microinjection से एक दिन पहले तैयार करें. एक मजबूत outbred तनाव, सीडी-1, अच्छी तरह से इस भूमिका के लिए इस तरह के अनुकूल हैं के (3-6 महीने पुराने) परिपक्व महिलाओं. या तो शल्य चिकित्सा या आनुवंशिक रूप vasectomized पुरुषों 28 के साथ पिछले दिन पर महिलाओं संभोग से pseudopregnancy प्रेरित. एक स्पष्ट मैथुनविषयक प्लग के साथ केवल 0.5 डीपीसी महिलाओं भ्रूण प्राप्तकर्ता के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं. अप्रयुक्त महिलाओं में pseudopregnancy लगभग 3 मूत के बाद गायब हो जाता हैउनके दोहराया उपयोग की अनुमति के एस.
  2. Ketamine के आईपी इंजेक्शन द्वारा 0.5 डीपीसी धात्री महिलाओं बेहोश करना, xylazine (क्रमशः 120 मिलीग्राम / किग्रा और 16 मिलीग्राम / किग्रा). इस निर्माण की गारंटी देता है ~ 30 मिनट शल्य सहिष्णुता समय 5-10 मिनट का अनुमान संचालन समय के लिए पर्याप्त से अधिक है.
  3. एक गर्म सतह पर अपने पेट पर anaesthetized पशु रखें और इस तरह के 70% इथेनॉल या chlorhexidine और शराब के मिश्रण के रूप में एक उपयुक्त कीटाणुनाशक के साथ चीरा के क्षेत्र कीटाणुरहित.
  4. जानवर की पीठ पर त्वचा काटकर अलग कर देना और बाँझ कैंची से peritoneal गुहा खुला.
  5. कल्पना और अंडाशय से जुड़ी वसा पैड पर खींच कर गर्भाशय सींग अमल में लाना. गर्म 0.9% NaCl समाधान का उपयोग कर नम अंगों रखें. शल्य साइट बाँझ ड्रेसिंग के साथ लिपटी या स्थानीय पशु चिकित्सा के दिशा निर्देशों के अनुरूप करने के क्रम में मुंडा किया जा सकता है कि मन में रखो.
  6. एक बुलडॉग क्लैंप के साथ अंडाशय वसा पैड कतरन से प्रजनन अंगों स्थिर.
  7. धीरे घड़ीसाज़ संदंश के साथ कलश की बस नदी के ऊपर डिंबवाहिनी समझ और डिंबवाहिनी दीवार में एक छोटा सा छेद बनाने के लिए एक 30 ग्राम चमड़े के नीचे सुई का उपयोग करें.
  8. सुई वापस लेने और धीरे केशिका धारक के मुखपत्र में उड़ाने से कलसा में भ्रूण की नियुक्ति की अनुमति छेद में भ्रूण युक्त एक पतली गिलास केशिका डालें. भ्रूण कलसा में जमा कर रहे हैं एक बार केशिका वापस लेने और वापस शरीर गुहा में प्रजनन अंगों की जगह.
  9. बाँझ टांके (Prolene 6-0) की एक श्रृंखला के साथ peritoneal गुहा को बंद करें.
  10. उद्घाटन के आकार के आधार पर 1-2 घाव क्लिप (Autoclip 9 मिमी) का उपयोग कर त्वचा को बंद करें.
  11. आपरेशन उनके घर पिंजरे में जानवरों लौटने और संज्ञाहरण के प्रभाव से दूर पहनने जब तक उन्हें निगरानी के बाद.
  12. , तनाव को कम (2-4 जानवरों / प्रकार III पिंजरे) जब भी संभव स्थिर सामाजिक समूहों में चूहों के घर के क्रम में.
  13. पोस्ट ऑपरेटिव एनाल्जेसिक लागू करेंDafalgan के रूप में सर्जरी के बाद 3 दिन के लिए पीने के पानी (पैरासिटामोल 200 मिग्रा / किग्रा BW) में जोड़ा.

6. पीसीआर और T7 endonuclease या प्रतिबंध एंजाइम पाचन द्वारा संस्थापकों का विश्लेषण

  1. Nuclease बंधन स्थल के चारों ओर 200-700 बीपी के बीच एक क्षेत्र बढ़ाना डिजाइन प्राइमरों. दूरी आगे प्राइमर-nuclease स्पेसर क्षेत्र और nuclease स्पेसर क्षेत्र रिवर्स प्राइमर एक agarose जेल पर पचा उत्पादों के लिए दो अलग बैंड का पता लगाने (उदाहरण के लिए आंकड़े 3 और 4 देखें) की अनुमति देने के लिए पर्याप्त रूप से अलग होना चाहिए.
  2. अनुकूलित शर्तों के साथ पीसीआर चलाएँ. एक agarose जेल पर पीसीआर amplicon आकार की जाँच करें.
  3. वैकल्पिक: पीसीआर मिश्रण से लवण और nucleotides दूर करने के लिए QIAquick पीसीआर शोधन किट के साथ जैसे शुद्ध पीसीआर उत्पादों,. कई एंजाइमों प्रतिबंध उचित प्रतिबंध एंजाइम बफर और शोधन के साथ पूरक पीसीआर नमूने में सक्रिय हैं की जरूरत नहीं है. हम भी सफलतापूर्वक हैQiagenTaq पीसीआर बफर में lly इस्तेमाल किया T7 endonuclease NEBuffer 2 के साथ पूरक.
    1. T7 endonuclease परख. NEBuffer 2 के 2 μl के साथ पीसीआर उत्पाद के 17 μl मिक्स और heteroduplex गठन चलाने (चित्रा 3 बी) thermocycler में कार्यक्रम:
      95 डिग्री सेल्सियस 2 मिनट
      95 डिग्री सेल्सियस से 85 डिग्री सेल्सियस (-2 डिग्री सेल्सियस / सेक)
      85 डिग्री सेल्सियस से 25 डिग्री सेल्सियस (-0.1 डिग्री सेल्सियस / सेक)
      4 डिग्री सेल्सियस पकड़.
      प्रत्येक नमूने के T7 endonuclease की 1 μl जोड़ें और 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. (सीईएल 1 nuclease पर निर्भर करता है जो सर्वेक्षक परख (Transgenomic), भी. निर्माता के निर्देशों को देखें यहां इस्तेमाल किया जा सकता है.)
    2. पीसीआर उत्पाद का प्रतिबंध डाइजेस्ट. 10x प्रतिबंध एंजाइम बफर के 2 μl और प्रतिबंध एंजाइम की 1 μl के साथ पीसीआर उत्पाद के 17 μl मिलाएं. 1 घंटा या अधिक के लिए उचित तापमान पर डाइजेस्ट.
  5. नमूने को डीएनए लोडिंग डाई जोड़ें और अलग पाचन पता लगाने के लिए एक 2% agarose जेल पर चलनेजंगली प्रकार के जानवरों और उत्परिवर्तित alleles ले जाने के संस्थापकों के लिए पैटर्न. अपेक्षित परिणाम के लिए आंकड़े 3 और 4 को देखें.
  6. क्लोन पीसीआर pGEM आयकर Easyor में टीए क्लोनिंग सीधे अगली पीढ़ी के अनुक्रमण का उपयोग पीसीआर उत्पादों के मिश्रण अनुक्रम द्वारा जैसे सेंगर अनुक्रमण के लिए उत्परिवर्तित alleles (के लिए सकारात्मक संस्थापकों में से उत्पादों.

Representative Results

हम स्तनधारी कोशिकाओं में TALENS की अभिव्यक्ति के साथ ही T7 फेज प्रमोटर (चित्रा 1C) से इन विट्रो mRNA संश्लेषण की अनुमति है कि Cermak एट अल. 13 द्वारा प्रकाशित गोल्डन GateTALEN विधानसभा साथ संगत गंतव्य plasmids का निर्माण किया. इन plasmids FokI homodimers के सापेक्ष बंद लक्ष्य प्रभाव को कम करने के लिए और FokI 25,29 heterodimers पहली पीढ़ी की तुलना में दरार गतिविधि बढ़ाने के लिए दिखाया गया है कि heterodimeric FokI डोमेन (वृद्धावस्था या केकेआर म्यूटेशन) ले. गोल्डन गेट विधानसभा प्रतिक्रियाओं # # 1 और 2 आमतौर पर बहुत कुशल हैं और हर सफेद कॉलोनी, कॉलोनी पीसीआर द्वारा विश्लेषण किया है, क्लोन RVDS (आंकड़े 1 बी और 1 डी) के विशेष नंबर के लिए उम्मीद पैटर्न से पता चलता है.

इन विट्रो संश्लेषित mRNA की जेल विश्लेषण (चित्रा 2) का विश्लेषण हर नमूना के लिए कम या कोई धब्बा के साथ एक एकल अलग पहचाना बैंड प्रकट करना चाहिए. सफल polyadenylation इंगित करता है जो नमूने L1/R1 और L2/R2, L3/R3, के बीच एक स्पष्ट आकार बदलाव किया जाना चाहिए.

संस्थापक जानवरों एक एंजाइम का उपयोग कर या तो T7 endonuclease पाचन द्वारा पीछा जीनोटाइपिंग पीसीआर (चित्रा 3) या एक प्रतिबंध डाइजेस्ट का उपयोग NHEJ प्रेरित उत्परिवर्तित alleles के लिए जांच की जा सकती nuclease जोड़ी की स्पेसर क्षेत्र के भीतर cleaves जंगली प्रकार अनुक्रम (चित्रा 4) है. T7 endonuclease परख पर ध्यान दिए बिना इंजेक्शन nuclease जोड़ी की स्पेसर क्षेत्र में विशिष्ट जीनोमिक अनुक्रम के उत्परिवर्तन के किसी भी प्रकार के लिए लागू होता है; हालांकि, यह heteroduplex पीसीआर उत्पादों में डीएनए किस्में के बीच ही बेमेल का पता लगाता है. इस प्रकार, एक संस्थापक दो हूबहू उत्परिवर्तित alleles किया जाता है कि दुर्लभ घटना में, पीसीआर उत्पादों को किसी भी T7 पाचन पैटर्न नहीं दिखा सकते हैं. एक विशिष्ट प्रतिबंध साइट NHEJ से सफाया हो जाएगा कि nuclease स्पेसर क्षेत्र के भीतर स्थित है, जब इस तरह के भेद हमेशा, हालांकि, संभव हैसम्मिलन / विलोपन (चित्रा 5) प्रेरित. इधर, पचाया बैंड म्यूटेशन की उपस्थिति का संकेत है, और किसी भी पचा उत्पादों के अभाव दृढ़ता से (चित्रा 4 बी में तारक से चिह्नित) लक्षित जीन की दोनों alleles में उत्परिवर्तन ले जाने के एक संस्थापक पता चलता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. PFUS वैक्टर में RVD सरणियों की heterodimeric pCAG-T7 गंतव्य वैक्टर में talen RVDS की गोल्डन गेट क्लोनिंग. ए) विधानसभा. यहाँ एक उदाहरण व्यक्तिगत कहानी सरणियों क्रमशः 15 RVDS और 17 RVDS शामिल साथ एक talen जोड़ी के लिए दिखाया गया है (अब 21 RVDS से कहानी सरणियों के लिए, तीन pFUS-RVDS विधानसभाओं नहीं दिखाया गया है, की आवश्यकता होती है). तीर pFUS विशेष कॉलोनी पीसीआर प्रतिक्रियाओं. बी) पीसीआर उत्पादों के लिए प्राइमरों का संकेतसही pFUS विधानसभाओं से परिलक्षित आमतौर पर) एक बैंड क्लोन सभी RVDS (10 RVDS के लिए जैसे लगभग 1.1 केबी) और एक कारण RVD सरणियों का दोहराव प्रकृति के छोटे कम प्रमुख बैंड के "सीढ़ी". सी की संयुक्त लंबाई को इसी दिखाने अंतिम विधानसभा pFUS-RVD सरणियों और क्रमशः FokIELD और FokIKKR वेरिएंट के साथ heterodimeric talen अभिव्यक्ति वैक्टर में पिछले दोहराने (पीएलआर) से युक्त एक प्लाज्मिड की. (एन और सी के रूप में एनोटेट) talen रीढ़ T7 फेज प्रमोटर में अनुमति देता है, जबकि सीएजी (सीएमवी जल्दी बढ़ाने तत्व / चिकन बीटा actin) प्रमोटर, ट्रांसफ़ेक्ट स्तनधारी कोशिकाओं में उच्च अभिव्यक्ति के स्तर सुनिश्चित मिलर एट अल. 23 द्वारा प्रकाशित वास्तुकला जैसा दिखता है इन विट्रो mRNA संश्लेषण (nuclease बंद codon के बहाव वेक्टर के linearization के लिए Saci का उपयोग करें). डी) सी में तीर द्वारा संकेत प्राइमरों का उपयोग कॉलोनी पीसीआर) सही ढंग से इकट्ठा TALENS की पहचान देता है. पूर्ण lengt"सीढ़ी प्रभाव" सफल विधानसभा की एक मजबूत सूचक का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि घंटे पीसीआर उत्पादों अक्सर कम प्रमुख हैं. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. . Agarose जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग इन विट्रो संश्लेषण में nuclease mRNA की गुणवत्ता नियंत्रण ZFN mRNAs एक उदाहरण के रूप में दिखाए जाते हैं (एल, ZFN छोड़ा; आर, सही ZFN). नमूने पूर्व polyadenylation को mRNA दिखाने L1/R1, mRNA और L3/R3 polyadenylated नमूने L2/R2 शो शुद्ध polyadenylated mRNA दिखा. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

सामग्री चौड़ाई के लिए = "6in": src = "/ files/ftp_upload/50930/50930fig3highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/50930/50930fig3.jpg" चौड़ाई = "600" के लिए alt = "चित्रा 3" />
चित्रा 3. लक्ष्य लोकस की nuclease प्रेरित म्यूटेशनों ले संस्थापक पशुओं की पहचान के लिए इस्तेमाल एक T7 endonuclease परख का उदाहरण है. ए) एक talen जोड़ी माउस prion प्रोटीन जीन (Prnp की कोडिंग क्षेत्र के भीतर फोड़ना करने के लिए डिजाइन किया गया था, talen लक्ष्य अनुक्रम) अनुरोध पर उपलब्ध कराई जा सकती है. एक पीसीआर उत्पाद पीसीआर उत्पाद बाद में गठन और T7 endonuclease पाचन heteroduplex के अधीन है नदी के ऊपर 110 बीपी स्थित एक आगे प्राइमर (एफ) और एक रिवर्स प्राइमर (नि.) talen दरार साइट. बी के बहाव के 250 बीपी) का उपयोग कर उत्पन्न होता है. सी) एकल संस्थापकों में से लक्षित जीनोमिक क्षेत्र के भीतर talen प्रेरित mutagenesis के पाचन 250 के उत्पादों और 110 आधार अंकों के साथ एक पूर्ण लंबाई पीसीआर उत्पाद की मौजूदगी से पता चला है.50930/50930fig3highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
चित्रा 4. लक्ष्य लोकस की nuclease प्रेरित म्यूटेशन माउस Rosa26 लोकस 29 लक्ष्य Intron 1 के भीतर एक XbaI प्रतिबंध साइट के लिए. ZFN विशिष्ट ले जाने के संस्थापक पशुओं की पहचान के लिए प्रयोग किया जाता पीसीआर उत्पादों की एक प्रतिबंध डाइजेस्ट का उदाहरण है. ए) संस्थापकों का उपयोग पीसीआर जीनोटाइपिंग द्वारा जांच की गई एक आगे प्राइमर (एफ) 500 अपस्ट्रीम बीपी और एक रिवर्स प्राइमर (नि.) दरार साइट. बी के बहाव के 250 बीपी) XbaI साथ पीसीआर उत्पादों की पाचन तारक से चिह्नित द्वि allelic परिवर्तन के साथ चूहों () का संकेत पाचन पैटर्न से पता चलता है, मोनो स्थित -allelic उत्परिवर्तन (पच और पचाया बैंड, जैसे पशु 2)संभावित द्वि allelic संशोधनों के साथ चूहों की और WT चूहों (पूरा पाचन, जैसे जानवर 21). सी) अनुक्रमण 3 (जानवर 24) अलग सम्मिलन / विलोपन को दिखाता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

प्राइमर का नाम '3 को' अनुक्रम 5
pCR8_F1 ttgatgcctggcagttccct
pCR8_R1 cgaaccgaacaggcttatgt
TAL_F1 ttggcgtcggcaaacagtgg
TAL_R2 ggcgacgaggtggtcgttgg
TAL_Seq_5-1 catcgcgcaatgcactgac

तालिका 1. गोल्डन गेट talen विधानसभा के भीतर कॉलोनी PCRs और अनुक्रमण के लिए इस्तेमाल किया प्राइमरों के दृश्योंप्रोटोकॉल.

प्लाज्मिड / संग्रह अंशदाता Addgene आईडी टिप्पणियां
गोल्डन गेट talen और ताल effector के किट 2.0 Voytas प्रयोगशाला 1000000024 गोल्डन गेट talen विधानसभा के लिए आवश्यक सभी plasmids होता है
pCAG-T7-talen -KKR/ELD गंतव्य वैक्टर Pelczar प्रयोगशाला 40131, 40132 ऐड - ऑन स्तनधारी कोशिकाओं में और इन विट्रो mRNA संश्लेषण में talen अभिव्यक्ति के लिए plasmids

तालिका 2. गोल्डन गेट talen विधानसभा के लिए आवश्यक plasmids और प्लाज्मिड संग्रह Addgene (से प्राप्त किया जा सकता www.addgene.org ).

ऑनलाइनसंसाधन टिप्पणियां
http://tale-nt.cac.cornell.edu Talen के डिजाइन; Talen बंद लक्ष्य भविष्यवाणी
http://zifit.partners.org/ZiFiT/ Talen, खुली ZFN, कोडा ZFN, CRISPR/Cas9 का डिजाइन
http://www.genome-engineering.org Talen, CRISPR/Cas9 के डिजाइन; CRISPR/Cas9 बंद लक्ष्य भविष्यवाणी
http://baolab.bme.gatech.edu/Research/BioinformaticTools/assembleTALSequences.html Talen के विधानसभा अनुक्रमण परिणाम की पुष्टि के लिए दृश्यों
http://pgfe.umassmed.edu/ZFPmo dularsearchV2.html मॉड्यूलर विधानसभा ZFN का डिजाइन
www.genomecenter.ucdavis.edu/s egallab / segallabsoftware मॉड्यूलर विधानसभा ZFN का डिजाइन

तालिका 3. ZFN, talen, और CRISPR/Cas9 डिजाइनिंग के लिए ऑनलाइन संसाधनों.

Discussion

डिजाइनर nuclease संचालित जीनोम संपादन दृष्टिकोण काफी उनके संबंधित जीनोम 10,12 के लक्षित संशोधन करने के लिए उत्तरदायी प्रजातियों की सीमा बढ़ा दिया है. चूहों में जीन को लक्षित ES कोशिकाओं में दो दशक से अधिक के लिए एक मानक तकनीक से किया गया है; चूहे ES कोशिकाओं में कुछ हाल ही में सफलता हुई है हालांकि, हालांकि यह माउस के अलावा अन्य प्रजातियों से ES कोशिकाओं के लिए अनुकूल करने के लिए मुश्किल साबित हो गया है. यहां तक कि ऐसे EUCOMM, KOMP, या ZFN और talen उच्च परिशुद्धता और हो सकता है कि संशोधनों के स्पेक्ट्रम के संबंध में लचीलापन प्रदान करता द्वारा NorCOMM 3 जीनोम संपादन के रूप में भागीदारी द्वारा प्रदान "बंद-the-शेल्फ" जीन लक्षित माउस ES सेल क्लोन की उपलब्धता के साथ माउस जीनोम में पेश किया. Nuclease की मध्यस्थता म्यूटेशनों ले संस्थापक जानवरों हमेशा ES कोशिकाओं के ब्लास्टोसिस्ट इंजेक्शन से होने वाले काइमेरा के लिए ऐसा नहीं है जो अत्यधिक रोगाणु लाइन सक्षम 4-6,20,21, होने लगते हैं. इस प्रकार, देस के कुछ मामलों microinjection मेंigner न्युक्लिअसिज़ लक्षित जीनोम संशोधनों के साथ उपन्यास माउस लाइनों का काफी तेजी से पीढ़ी में परिणाम कर सकते हैं.

ZFN और talen के इंजेक्शन से पीटा चूहों की सफल पीढ़ी इंजेक्शन nuclease जोड़ी की गतिविधि पर काफी हद तक निर्भर करता है. TALENS जीवों की संख्या में जीन की एक विस्तृत श्रृंखला को निशाना बनाने में एक उच्च सफलता दर है दिखाया गया है; हालांकि, हाल के अध्ययनों से Talen बंधनकारी साइटोसिन मेथिलिकरण 30,31 के प्रति संवेदनशील है कि सुझाव है. इस प्रकार, नव सृजित nuclease जोड़े, उदाहरण के लिए TALENS pCAG-T7 वैक्टर में क्लोन, ऐसे एनआईएच 3T3 या न्यूरो के रूप में एक माउस सेल लाइन में transiently ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता है कुछ हद तक माउस भ्रूण की chromatin राज्य नकल जो-2A,. इधर, nuclease गतिविधि पूर्व mRNA संश्लेषण और microinjection को धारा 5 में वर्णित के रूप में T7 endonuclease परख या पीसीआर उत्पाद का प्रतिबंध डाइजेस्ट का उपयोग कर अनुमान लगाया जा सकता है. हम संबंध में ब्याज की जीनोमिक क्षेत्र का अनुक्रमण की सिफारिशसेल लाइन और microinjection प्रयोगों के लिए इस्तेमाल माउस तनाव ive.

माउस युग्मनजों में, अलग talen या ZFN जोड़े अलग mRNA सांद्रता में बेहतर काम करेगा और इसलिए microinjected nuclease mRNA की इष्टतम काम एकाग्रता प्रयोगात्मक निर्धारित किया जा सकता है. बहुत अधिक भ्रूण मारक में परिणाम कर सकते हैं, जबकि nuclease जोड़ी पर निर्भर करता है, बहुत कम एक एकाग्रता कोई दरार में परिणाम होगा. Nuclease जोड़ी पर निर्भर करता है, हम 2 एनजी / μl और 200 माइक्रोग्राम / उल रूप में उच्च के रूप में कम के कुल mRNA सांद्रता का उपयोग कर सफलता मिली है. इन प्रभावों सेल संस्कृति और भ्रूण अस्तित्व और लक्ष्य लोकस के संशोधन दर दोनों अनुभव से निर्धारित किए जाने की आवश्यकता के लिए nuclease एकाग्रता इष्टतम में प्रयोगों से भविष्यवाणी करना मुश्किल है.

अत्यधिक सक्रिय ZFN या talen microinjected भ्रूण के एक सेल चरण परे अपने लक्ष्य अनुक्रम फोड़ना और इस तरह mutagenesis के एक के जटिल पैटर्न पैदा कर सकता हैसंस्थापकों में डी mosaicism. हम और 4 अन्य एक एकल संस्थापक (चित्रा 5C) में तीन या अधिक विशिष्ट उत्परिवर्तित alleles मनाया है. इन संस्थापकों में से एक नया माउस लाइन की स्थापना के इस प्रकार, जब वंश ध्यान से पाचन assays के एक अपरिभाषित उत्परिवर्तन मौजूद है ही कि प्रमाण उपलब्ध कराने के बाद से अनुकूल उत्परिवर्तन की उपस्थिति के लिए अनुक्रमण द्वारा जांच की जानी चाहिए.

आलोचनाओं में से एक अक्सर ZFN और talen सिस्टम के खिलाफ आवाज उठाई इन न्युक्लिअसिज़ भी लक्ष्य साइटों के लिए इसी तरह के हैं कि जीनोम में कहीं और वर्तमान दृश्यों cleaving करने में सक्षम हैं कि संभावना है. इस तरह के बंद लक्ष्य प्रभाव homodimeric FokI डोमेन का उपयोग जल्दी पीढ़ी अभिकर्मकों के साथ मनाया गया है, और heterodimer निर्माणों बंद लक्ष्य प्रभाव 25 कम करने के लिए डिजाइन किए गए थे. संभावित बंद लक्ष्य साइटों सिलिको 32,33 में कुछ हद तक भविष्यवाणी की है और पीसीआर और अनुक्रमण द्वारा जांच की जा सकती है. एक स्पष्ट लाभ ओएफ बल्कि सेल लाइनों से चूहों को पैदा करने के लिए ZFNs और TALENS का उपयोग पसंद का एक जंगली प्रकार के तनाव को कई backcrosses प्रदर्शन द्वारा वांछित जीनोम संशोधन करने के लिए लिंक रद्द लक्ष्य म्यूटेशन बंद को हटाने की संभावना है. संस्थापक चूहों की एक बड़ी संख्या, nuclease लक्षित लोकस से उत्पन्न और सिलिको में बंद लक्ष्य की भविष्यवाणी की पीसीआर उत्पादों की अगली पीढ़ी गहरी अनुक्रमण के विश्लेषण के लिए loci पीसीआर उत्पादों की पाचन assays के लिए एक विकल्प के गुणात्मक और मात्रात्मक readout पेश कर सकती है.

इस प्रोटोकॉल में वर्णित सहायता प्रजनन तकनीक ऐसी C57BL/6J या B6D2F1 रूप microinjection प्रयोगों के लिए इस्तेमाल मानक माउस उपभेदों के लिए अनुकूलित कर रहे हैं. ऐसे outbred उपभेदों के रूप में अलग मूल के चूहे, सिद्धांत में जीनोम संपादन दृष्टिकोण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और विशेष अनुसंधान प्रश्नों के लिए एक अधिक उपयुक्त आनुवंशिक पृष्ठभूमि प्रदान हो सकता है. ऐसे superovulation के रूप में सहायता प्रदान की प्रजनन तकनीक का प्रदर्शन predi हो सकता हैउपभेदों 34-36 के एक नंबर के लिए cted लेकिन nuclease microinjection के लिए भ्रूण के लिए पर्याप्त संख्या प्राप्त करने के क्रम में गैरमानक उपभेदों के लिए आगे अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है.

ZFN और talen इसके अलावा, इस तरह के आरएनए निर्देशित CRISPR/Cas9 प्रणाली 9,37,38 के रूप में नए डिजाइनर न्युक्लिअसिज़ अब जीनोम संपादन अनुप्रयोगों के लिए पेश किया गया है. Microinjection और यहां वर्णित संस्थापक जानवरों के विश्लेषण के लिए सभी तरीकों में भी CRISPR/Cas9 और जीनोम संपादन के भविष्य के मोड को लागू कर रहे हैं.

Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धा हितों की घोषणा.

Acknowledgments

हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए मोनिका Tarnowska, Cornelia अल्ब्रेक्ट, और इवा Skoczylas धन्यवाद देना चाहूंगा. इस अध्ययन एसएनएफ Sinergia अनुदान CRSI33-125073 पीपी द्वारा वित्त पोषित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BsaI NEB R0535S or L
Esp3I Thermo Scientific ER0451
T4 Ligase NEB M0202S or L
Spectinomycin Sigma S0692-1ML
Ampicillin  Sigma A0166
X-Gal Sigma B4252
IPTG Sigma I6758
Plasmid-Safe nuclease Epicentre E3101K
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106
QIAGEN Plasmid Midi Kit Qiagen 12143
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28106
mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit Invitrogen AM1345
NucAway Spin Columns Invitrogen AM10070
RNaseZAP Sigma R2020-250ML
NorthernMax Formaldyde Load Dye Invitrogen AM8552
RNA Millennium Markers Invitrogen AM7150
10x TBE buffer Thermo Scientific B52
T7 endonuclease NEB M0302S or L
pGEM-T EasyVector System I Promega A3600
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain Invitrogen S-7563
pregnant mare's serum gonadotrophin (PMSG) Sigma G4877
human chorionic gonadotropin (hCG) Sigma CG5
M2 embryo culture medium Sigma M7167
M16 embryo culture medium Sigma M7292
Mineral oil, embryo tested Sigma M8410
Ketamine CentraVet Ket 201
Xylazine Sigma Aldrich 46995
Equipment/Tools
Inverted microscope with Nomarski DIC optics (for example Nikon Eclipse TE200) Nikon
Micromanipulator units (for example Narishige, NT88NF) Narishige
Embryo holding capillaries Sutter Instruments B100-75-10
Embryo injection capillaries Narishige GD-1
Capillary puller (for example Sutter P97) Sutter Instruments
Microforge (for example Narishige MF-900) Narishige
Walton skin scissors FST 14077-10
Surgical scissors FST 14041-10
Surgical probe FST 10140-03
Reflex wound clip system (9 mm) FST 12031-09
Reflex wound clips (9 mm) FST 12032-09
Dumont fine forceps 5 FST 11254-20
Moria curved forceps FST 11370-31
Moria fine forceps FST 11399-80
Dietrich bulldog clamp FST 18038-45
C57BL/6J mice Jackson Labs strain code 000664
CD-1 mice Charles River strain code 000664

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References

  1. Capecchi, M. R. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. Nat. Rev. Genetics. 6, 507-512 (2005).
  2. Johansson, T., et al. Building a zoo of mice for genetic analyses: a comprehensive protocol for the rapid generation of BAC transgenic mice. Genesis. 48, 264-280 (2010).
  3. Skarnes, W. C., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474, 337-342 (2011).
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जेनेटिक्स अंक 86 Oocyte microinjection डिजाइनर न्युक्लिअसिज़ ZFN talen जीनोम इंजीनियरिंग
डिजाइनर न्युक्लिअसिज़ का उपयोग कर माउस जीनोम इंजीनियरिंग
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Hermann, M., Cermak, T., Voytas, D.… More

Hermann, M., Cermak, T., Voytas, D. F., Pelczar, P. Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases. J. Vis. Exp. (86), e50930, doi:10.3791/50930 (2014).

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