Designer nukleaser som sink finger nukleaser (ZFNs) og transkripsjons aktivator lignende effektor nukleaser (Talens) kan brukes til å endre genomet muse preimplantation embryoer ved å utløse både ikkehomologe ende bli (NHEJ) og homolog rekombinasjon (HR) trasé. Disse fremskrittene muliggjøre rask generasjon av mus med presise genetiske modifikasjoner.
Transgene mus som bærer stedsspesifikke genom modifikasjoner (knockout, knock-in) er av avgjørende betydning for å dissekere komplekse biologiske systemer, så vel som for å modellere menneskelige sykdommer og teste terapeutiske strategier. Nylige fremskritt i bruk av designer nukleaser som sink finger nukleaser (ZFNs), transkripsjons aktivator lignende effektor nukleaser (Talens), og de gruppert regelmessig interspaced korte palindromic repetisjoner (CRISPR) / CRISPR-forbundet (Cas) 9 system for område- spesifikke genom ingeniør åpne muligheten til å utføre raske målrettede genomet modifisering i praktisk talt alle laboratorie arter uten å måtte stole på embryonale stamceller (ES) celleteknologi. Et genom redigering eksperiment starter vanligvis med identifisering av designer nuklease målnettsteder innenfor et gen av interesse etterfulgt av bygging av tilpassede DNA-bindende domener til direkte nukleaseaktivitet til etterforsker definerte genomisk locus. Designer nuklease plasmider er in vitro </ Em> transkribert for å generere mRNA for mikroinjeksjon av befruktede mus eggceller. Her gir vi en protokoll for å oppnå målrettet genomet modifisering ved direkte injeksjon av TALEN mRNA inn befruktede mus eggceller.
Mus er langt den mest populære plattformen for generering av transgene dyremodeller. Den allsidige verktøykasse for genteknologi av musen embryo 1-3 har nylig blitt utvidet ved genom redigering tilnærminger basert på designer nukleaser som sink finger nukleaser (ZFN) 4-6, transkripsjons aktivator lignende effektor nukleaser (Talen) 7,8, og gruppert regelmessig interspaced korte palindromic repetisjoner (CRISPR) / CRISPR-forbundet (Cas) 9 system ni. ZFN og TALEN funksjon som par med to spesialdesignede protein-baserte DNA-bindende domener (arrays av sink finger proteiner og gjenta-variabel di-rester (rvds), henholdsvis) som hver er koblet til Foki endonuclease 10-12. Omvendt, er det spesielle ved Cas9-mediert DNA-spalting leveres av transactivating CRISPR RNA (crRNA og tracrRNA, som også kan bli kombinert i en enkelt chimerisk RNA molekyl betegnet guide RNA) 11 som opptrer i et kompleks med denCRISPR protein.
Talens med en definert sekvens av rvds kan raskt konstruert av individuelle forskere med et mangfold av monterings strategier for å velge 13-17. CRISPR/Cas9 lover enda mindre arbeidskrevende generasjon av designer nukleaser, men spesifisiteten av guiden RNA-DNA-binding er fortsatt ikke helt løst 18,19. Generering av tilpassede ZFNs har så langt vært begrenset til spesialiserte akademiske laboratorier og til kommersielle leverandører som Sangamo biovitenskap og Sigma CompoZr tjenesten.
Generelt genom redigering med designer nukleaser tar sikte på å innføre doble trådbrudd (DSB) på definerte genomisk loci, som senere tiltrekke ikkehomologe ende bli (NHEJ) eller homolog rekombinasjon (HR) DNA-reparasjons machineries 10,12. NHEJ-mediert reparasjon av et DSB ofte resulterer i innføring av innsettinger og delesjoner i nær tilknytning til området for reparasjon. Dermed NHEJ reparasjon cen utnyttes for å slå ut funksjonen av et mål-genet ved å innføre en ramme-skiftmutasjon innenfor genene protein-kodende sekvens 4,7,9. Alternativt kan defineres tillegg eller utskifting av genetisk informasjon kan oppnås ved å gi en DNA-donor sammen med designer nukleaser. En DNA-donor består etterforsker-designet DNA-sekvenser flankert av regioner av homologi med målet locus, og dermed tjene som en mal for DSB reparasjon av HR. Begge plasmidene 5,6,20 og single-strandet oligonukleotider 8,9,21 har blitt brukt som donorer. Hverken NHEJ-nor HR-mediert genom redigering krever innføring av en selekterbar markør inn i genomet av mus embryo, noe som gjør disse strategiene spesielt godt egnet for å lage små endringer i nukleotidsekvensen uten å forstyrre den totale genetiske arkitektur.
I denne protokollen beskriver vi alle nødvendige prosedyrer for genom redigering imus embryo ved hjelp Talens. Disse omfatter 1) identifikasjon av en TALEN målområde 22, 2) konstruksjon av Talens med Golden Gate klon 13, 3) in vitro syntese av TALEN mRNA, 4) mikroinjeksjon av TALEN mRNA inn i befruktede oocytter mus, 5) kirurgiske prosedyrer for embryo og 6) analyse av TALEN-indusert mutagenese in stifter dyr. Vi fokuserer på TALEN mRNA mikroinjeksjon og screening av grunnleggerne for NHEJ-indusert innsett / slettinger. For dette formål har vi generert bifunksjonelle Talen konstruksjoner som tillater både ekspresjon i pattedyrceller når transfektert som plasmider og in vitro syntese av TALEN mRNA for mikroinjeksjon i mus embryo. Disse konstruksjoner omfatter en avkortet TALE ryggrad 23 smeltet til heterodimert foki domener 24,25 for optimal genomet redigering i pattedyrceller. Denne protokollen kan også tas i bruk for mikroinjeksjon av andre designer nukleaser eller for kombinerte injeksjoner av designer nukleaserog donor-konstruksjoner (utforming av DNA-givere er blitt beskrevet i gode tekniske publikasjoner fra Wefers et al. 26,27).
Etisk Erklæring
Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med de retningslinjer og regler i Cantonal Veterinary Office of Canton Zürich.
Designer nukleasefritt drevet genom redigering tilnærminger har betydelig utvidet spekter av arter mottakelig for målrettede endringer for sine respektive genomer 10,12. Hos mus, har genet målretting i ES-celler vært en standard teknikk i over to tiår; har det imidlertid vist seg vanskelig å tilpasse seg ES celler fra andre enn musen arter, selv om det har vært noen nylige suksess i rotte ES-celler. Selv med tilgjengeligheten av "off-the-sokkel" gen-målrettet mus ES cell kloner levert av konsortier som EUCOMM, KOMP, eller NorCOMM tre genomet redigering av ZFN og TALEN gir høyere presisjon og fleksibilitet med hensyn til spekteret av endringer som kan være innføres i musegenomet. Grunnlegger dyr som bærer nukleasefritt mediert mutasjoner synes å være svært bakterie-linjen kompetent 4-6,20,21, noe som ikke alltid er tilfelle for chimeras stammer fra blastocyst injeksjoner av ES-celler. Derfor, i visse tilfeller mikroinjeksjon av designer nukleaser kan resultere i betydelig raskere generasjon av nye mus linjer med målrettede genom modifikasjoner.
Den vellykkede generasjonen av knockout mus ved injeksjon av ZFN og TALEN avhenger i stor grad på aktiviteten av den injiserte nuclease pair. Talens har vist seg å ha en høy suksessrate på målrettet mot et bredt spekter av gener i en rekke organismer; men nylige studier antyder at TALEN binding er følsom for cytosin metylering 30,31. således nylig genererte nuklease par, for eksempel Talens klonet inn pCAG-T7 vektorer, kan bli transfektert inn i en forbigående musecellelinje slik som NIH-3T3 eller Neuro -2a, som etterligner kromatin tilstanden i mus embryo i en viss grad. Her kan nukleaseaktivitet beregnes ved hjelp av T7 endonuclease analysen eller en begrensning sammendrag av PCR produktet som beskrevet i kapittel 5 før mRNA syntese og mikroinjeksjon. Vi anbefaler sekvensering av genomet regionen av interesse i respektive cellelinje og musen stamme brukt for mikroinjeksjon eksperimenter.
I muse zygotes, vil ulike Talen eller ZFN parene fungere optimalt på forskjellige mRNA konsentrasjoner og dermed den optimale arbeids konsentrasjonen av microinjected nuclease mRNA kan måtte bestemmes eksperimentelt. Avhengig av nuklease-par, vil en for lav konsentrasjon resulterer i ingen spaltning, mens for høyt kan resultere i embryoletalitet. Avhengig av nuklease paret, vi har hatt suksess ved hjelp totale mRNA-konsentrasjoner så lave som 2 ng / mL, og så høy som 200 ug / ul. Disse effekter er vanskelige å forutsi fra eksperimenter i cellekultur, og den nuklease konsentrasjon optimal for begge embryo overlevelse og modifisering hastighet av målet locus må bestemmes empirisk.
Meget aktiv ZFN eller TALEN kan holde seg sine mål sekvens utover ett-celle stadium av microinjected embryo og dermed føre til komplekse mønstre av mutagenesis end mosaicism i grunnleggere. Vi og andre 4 har observert tre eller flere distinkte muterte alleler i en enkelt grunnlegger (figur 5C). Således, ved etablering av en ny mus linje fra disse erne, avkom bør nøye vist ved sekvensering for nærvær av den gunstige mutasjon siden fordøyelse assays gi bevis på at bare en udefinert mutasjon er tilstede.
En av kritikk ofte uttrykt mot ZFN og Talen systemer er muligheten for at disse nukleaser er også i stand til å spalte sekvenser tilstede et annet sted i genomet som er lik mål-områder. Slike off-target effekter har blitt observert med tidlig generasjon reagenser bruker homodimeric FoKI domene, og heterodimer konstruerer ble utformet for å lindre off-target effekter 25. Potensielle off-målnettsteder kan bli spådd til en viss grad i silico 32,33 og skjermet av PCR og sekvensering. En åpenbar fordel of ved hjelp av ZFNs og Talens for generering av musene i stedet for cellelinjer er muligheten for fjerning av target mutasjoner ukoblet til ønsket genomet modifikasjon ved å utføre flere backcrosses til en vill-type stamme av valget. For analyse av et stort antall stifter mus, neste generasjons dyp sekvensering av PCR-produkter generert fra nuklease-målrettede locus og in silico predikerte off-target loci kan tilby en alternativ kvalitativ og kvantitativ avlesning til råtneanalyser av PCR-produkter.
De assistert befruktning som er beskrevet i denne protokollen er optimalisert for standard musestammer som brukes til mikroinjeksjon eksperimenter som C57BL/6J eller B6D2F1. Mus av forskjellig opprinnelse, slik som utav belastninger, kan i prinsippet benyttes til genom redigering metoder, og kan tilveiebringe en mer egnet genetisk bakgrunn for spesielle problemstillinger. Ytelsen til assistert reproduksjon som for eksempel superovulering kan være predicted for en rekke stammer 34-36, men kan kreve ytterligere optimalisering for ikke-standardiserte stammer for å få et tilstrekkelig antall embryoer for nuclease mikroinjeksjon.
Foruten ZFN og TALEN, har nye designer nukleaser som RNA-guidet CRISPR/Cas9 system 9,37,38 nå blitt introdusert for genom redigeringsprogrammer. Alle metoder for mikroinjeksjon og analyse av grunnlegger dyr som er beskrevet her er også gjeldende for CRISPR/Cas9 og fremtidige moduser av genomet redigering.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Monika Tarnowska, Cornelia Albrecht, og Ewa Skoczylas for utmerket teknisk assistanse. Denne studien ble finansiert av SNF Sinergia stipend CRSI33-125073 til PP.
BsaI | NEB | R0535S or L |
Esp3I | Thermo Scientific | ER0451 |
T4 Ligase | NEB | M0202S or L |
Spectinomycin | Sigma | S0692-1ML |
Ampicillin | Sigma | A0166 |
X-Gal | Sigma | B4252 |
IPTG | Sigma | I6758 |
Plasmid-Safe nuclease | Epicentre | E3101K |
QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 |
QIAGEN Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 |
mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit | Invitrogen | AM1345 |
NucAway Spin Columns | Invitrogen | AM10070 |
RNaseZAP | Sigma | R2020-250ML |
NorthernMax Formaldyde Load Dye | Invitrogen | AM8552 |
RNA Millennium Markers | Invitrogen | AM7150 |
10x TBE buffer | Thermo Scientific | B52 |
T7 endonuclease | NEB | M0302S or L |
pGEM-T EasyVector System I | Promega | A3600 |
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S-7563 |
pregnant mare's serum gonadotrophin (PMSG) | Sigma | G4877 |
human chorionic gonadotropin (hCG) | Sigma | CG5 |
M2 embryo culture medium | Sigma | M7167 |
M16 embryo culture medium | Sigma | M7292 |
Mineral oil, embryo tested | Sigma | M8410 |
Ketamine | CentraVet | Ket 201 |
Xylazine | Sigma Aldrich | 46995 |
Equipment/Tools | ||
Inverted microscope with Nomarski DIC optics (for example Nikon Eclipse TE200) | Nikon | |
Micromanipulator units (for example Narishige, NT88NF) | Narishige | |
Embryo holding capillaries | Sutter instruments | B100-75-10 |
Embryo injection capillaries | Narishige | GD-1 |
Capillary puller (for example Sutter P97) | Sutter instruments | |
Microforge (for example Narishige MF-900) | Narishige | |
Walton skin scissors | FST | 14077-10 |
Surgical scissors | FST | 14041-10 |
Surgical probe | FST | 10140-03 |
Reflex wound clip system (9mm) | FST | 12031-09 |
Reflex wound clips (9mm) | FST | 12032-09 |
Dumont fine forceps 5 | FST | 11254-20 |
Moria curvrd forceps | FST | 11370-31 |
Moria fine forceps | FST | 11399-80 |
Dietrich bulldog clamp | FST | 18038-45 |
Animals | ||
C57BL/6J mice | Jackson labs | strain code 000664 |
CD-1 mice | Charles river | strain code 000664 |