Summary
Billeddannelse af centrosomal proteiner under Drosophila spermatogenesen er en kraftfuld metode til at identificere nye proteiner kritiske for centrosome biologi samt at belyse den særlige funktion af kendte aktører i denne proces.
Abstract
Centrosomes bevares mikrotubuli-baserede organeller, hvis struktur og funktion ændre sig dramatisk i hele cellecyklus og celledifferentiering. Centrosomes er afgørende for at bestemme celledeling akse under mitosen og nucleate cilier under interfase. Identiteten af de proteiner, der medierer disse dynamiske ændringer er kun delvist kendt, og funktionen af mange af de proteiner, der har været impliceret i disse processer er rudimentære. Nyligt arbejde har vist, at Drosophila spermatogenesen giver et kraftfuldt system til at identificere nye proteiner kritiske for centrosome funktion og dannelse, samt at få indsigt i den særlige funktion af kendte spillere i centrosome-relaterede processer. Drosophila er en etableret genetisk model organisme, hvor mutanter i centrosomal gener kan let opnås let analyseres. Endvidere nylige fremskridt i følsomhed og opløsning lysmikroskopi ogudvikling af robuste genetisk mærkede centrosomal markører har forvandlet evnen til at bruge Drosophila testikler som et enkelt og tilgængeligt modelsystem til at studere centrosomes. Dette papir beskriver brugen af genetisk mærkede centrosomal markører til at udføre genetiske skærme til nye centrosomal mutanter og for at få indsigt i den specifikke funktion af nyligt identificerede gener.
Introduction
Drosophila testikler er et egnet organ til undersøgelse af en række cellulære og udviklingsmæssige processer og er blevet grundigt undersøgt gennem årene 1-9. Dette håndskrift fokuserer på anvendelsen af Drosophila testikler at studere centrosome, en bevaret cellulær organel. Som i andre systemer, centrosome af Drosophila testikler funktion i mitose, meiose, og ciliogenesis 10. Centrosomes er sammensat af et par mikrotubuli-baserede strukturer kendt som centrioler omgivet af et komplekst protein netværk kaldet pericentriolar materiale (PCM). Den centriole par består af en ældre mor centriole og en yngre datter centriole. Da cellen udvikler sig hen imod mitose begge centrioler adskilt, duplikere, og erhverve en stor mængde PCM til sidst at danne to adskilte centrosomes. Centrosome indeholder den oprindelige mor centriole omtales som moderen centrosome og centrOsome indeholder den oprindelige datter centriole omtales som datter centrosome.
Drosophila testikler er ideelle til at studere den molekylære basis for centrosome biologi ved fluorescensmikroskopi for en række forskellige årsager.
- De fleste af de Drosophila proteiner, der er nødvendige for centrosome biologi i testiklerne er konserveret blandt eukaryoter, tyder på, at indsigt relevante for centrosome biologi hos mennesker og andre arter kan opnås ved at studere centrosome i Drosophila testikler 1,11-14.
- Udførelse af mutant analyse i Drosophila giver en betydelig fordel, da, i modsætning til mange andre modeller, centrosomal mutationer i Drosophila er ikke embryonale dødelige, hvilket giver mulighed for klassisk genetisk analyse af centrosome funktion. Denne unikke funktion Drosophila skyldes tilstedeværelse af maternel bidrag, som fortsætter i de kritiske faser af embryonisk udvikpment. 1,11-14. Således kan man a) undersøgelse mutationer, der helt eliminere centrosome dannelse og b) undersøge skæbnen for en normal centrosome, der blev dannet i det tidlige foster fra moderens bidrag i en mutant sammenhæng efter moderens bidrag er udtømt (princippet om metoden er beskrevet i 11).
- Funktionelle transgener med genetisk kodet fluorescerende tags, etiket centrosome er tilgængelige. Mange af disse linjer bruge proteinets egen promotor til at drive transkription af transgenet for at undgå stærk overekspression. Dette er især vigtigt, fordi overekspression af proteiner resulterer ofte i artefakter, der interfererer med analysen af centrosome funktion 1,11.
- Den centriole og centrosome er unikt længe hele Drosophila spermatogenesen, hvilket giver mulighed for hurtig og nem analyse af centrosome ved billeddannelse.
- På hinanden følgende trin i spermatogenesen og centrosome biology er organiseret kronologisk langs testiklerne, startende ved testiklerne spids med centrosomes af sædceller stamceller og slutter i bunden af testiklerne med nedsat centrosome størrelse og aktivitet i modne sædceller (figur 1 og 2). Det giver mulighed for nem identifikation og analyse af centrosome funktion under forskellige stadier af udviklingen af sæd.
- Testiklerne er let dissekeres fra mandlig larver, pupper og voksne 27.
- Under spermatogenesen, centrosome og dens centrioler fortsætte gennem flere kompositorisk, strukturelle og funktionelle tilstande til at fungere i mitose, meiose, og cilium dannelse. I løbet af disse processer, centrosome samler, dubletter, migrerer, ankre til bestemte dele af cellen, modnes, dividere, og skaber en cilium. Endvidere centriole af det modne sædcelleantal giver anledning til en centriolar forstadium navngivet PCL 1. Også i den modne sædcelleantal, centrosome undergår en fremgangsmåde called centrosome reduktion, hvorved det mister mange komponenter af PCM og centriole (figur 1 og 2). Således studier i testiklerne tillader en at tage flere aspekter af centrosome livet såsom centrosome tilbageholdelse i stamceller, centriole dobbeltarbejde, centriole stabilitet, centriole forlængelse, centriole separation og segregation, PCM rekruttering, ciliogenesis, PCL dannelse, centrosome reduktion, og astral mikrotubuli nukleær blandt andre.
- Endelig studier af centrosome biologi hjulpet af de andre kendte karakteristika af Drosophila, der har gjort det til en foretrukken model organisme til biologiske undersøgelser. Heriblandt en kort generationstid, let genetik, samt tilfældige og steddirigeret mutagenese.
Sammen de ovennævnte karakteristika for Drosophila testikler giver en model, hvor centrosome kan studeres ved let, hurtig og detaljeret billeddannelse. De beskrevne teknikkeri dette papir er blevet anvendt til at undersøge mange aspekter af centrosome biologi, herunder centriole dannelse 11, centriole dobbeltarbejde 15, PCM rekruttering 16 centrosome regulering 17 og ciliogenesis 18. Disse teknikker er også blevet anvendt til at studere centrosome på andre områder af biologien, såsom meiotisk regel 19, spindel samling 20 og centrosome aktivitet i asymmetriske stamceller division 21 blandt mange andre.
Billeddannelse af testikler i centrosome starter med at få fluer, der udtrykker genetisk mærkede centrosomal proteiner og isolere testiklerne fra mandlige larver, pupper eller voksne fluer. Disse fluer er tilgængelige fra flere forskergrupper 1,11,15,22-25. Larve testikler indeholder alle stadier af spermatogenesen før meiosen og er nyttige, når man analyserer mutationer, der er dødelig i puppe eller voksen. Men Late puppe eller ung ADUlt testikler er de mest robuste og indeholder alle præ-og post-meiotiske stadier af spermatogenesen, og dermed gøre dem foretrække til analyse. Da antallet af sædceller falder som fluen aldre, brugen af voksne testiklerne er også velegnet til at studere centrosome i forbindelse med aldring. 26.. En fremgangsmåde af testis isoleret fra voksne fluer er tidligere blevet beskrevet 27.
Billeddannelse af centrosomes og deres funktion i Drosophila testikler kan opnås via tre relaterede spor, der er præsenteret her (figur 3). Udvælgelse af hvilket spor der er mest hensigtsmæssig afhænger af karakteren af det spørgsmål, investigator er adressering.
Spor A indebærer billeddannelse af levende testikler. Det er den mest hurtige af de tre spor, men kan kun anvendes, når prøverne ikke behøver at blive bevaret, og når immunfarvning er ikke påkrævet. I Track A, testikler monteret (intakt, gennemboret eller klippe) på diasog omhyggeligt klemt under et dækglas til at danne et enkelt lag af let identificerbare celler. Cellerne bliver derefter visualiseres ved hjælp af både fase-kontrast mikroskopi og fluorescerende mikroskopi. Brugen af fase-kontrast er særlig vigtig for analysen af Drosophila testikler fordi den afslører cellulære oplysninger, der ikke er synlig med andre former for transmitteret belysning og dermed giver mulighed for hurtig identifikation af forskellige stadier af udviklingen af sæd 28,29. Dog Track A har to primære ulemper. Først er den morfologiske integritet celler ofte kompromitteret når testiklerne er sprængt. For det andet, ikke-fikserede celler undertiden bevæge sig inden prøven, hvilket gør billeddannelse af flere konfokal lag inden for en bestemt region vanskelig. For at fremme analyse af specifikke celletyper, kan testes gennemboret eller skæres for at lede den måde testis brister, således at mase under dækglasset minimalt påvirker morfologien af celletypen af interesse.
Spor B indebærer kemisk fiksering af testiklerne. Dette spor kræver en mellemliggende mængde tid for prøvepræparation og har den fordel, at faste prøver kan gemmes til senere analyse. Desuden fiksering tjener til at gøre cellulære strukturer mere stive, hvilket minimerer bevægelse af prøven under billedbehandling. Dog bliver fase-kontrast mikroskopi langt mindre informative efter kemisk fiksering, gøre nogle stadier af sæd udvikling vanskelige at identificere.
Spor C er den mest tidskrævende, men har den ekstra fordel, at cellulære strukturer er faste og immunofarvet, giver mulighed for visualisering af proteiner, der ikke er tilgængelige med de relevante genetik tags. Der er mange antistoffer til rådighed både kommercielt og fra diverse forskergrupper til immunfarvning centrosomes og centrosome-relaterede strukturer i Drosophila testikler.
Protocol
1.. Spor A. Udarbejdelse af Levende Testes
- Forbered PBS ved at opløse 8,0 g NaCl, 0,2 g KCI, 1,44 g Na 2 HPO 4, 0,24 g KH 2PO 4 i 800 ml destilleret vand, og pH justeres til 7,4. Rumfanget bringes op på 1 L og steriliseres ved autoklavering.
- Isoler testikler som tidligere beskrevet 27.
- Forbered DAPI farvning buffer ved at fortynde 1 mg / ml stamopløsning til 1 ug / ml i PBS. Brug aluminiumfolie for at beskytte røret fra lys og opbevares ved -20 ° C.
- Efter isolering af testiklerne, nedsænke prøven i 6 ul DAPI farvning puffer på toppen af en positivt ladet objektglas i 10 minutter. Testiklerne klæbe godt til kommercielt tilgængelige positivt ladede dias, giver mulighed for nem manipulation af prøven. Positivt ladede objektglas er kovalent modificeret til at bibringe en statisk positiv ladning til glasoverfladen. Svarende til polylysin belægning, det fremmer interaktionen af testiklerne with overflade diaset.
- Vask overskydende DAPI ved at erstatte farvningsbuffer to gange med 6 pi PBS. Brug et stykke filterpapir for at bortsuge bufferen efter hvert vasketrin. Udvis forsigtighed for ikke at uheld fjerne testiklerne sammen med buffer under hver vask.
- Tilsæt 6 pi PBS til modellen. Mængden af buffer, der bruges bør justeres for størrelsen af dækglasset. De i denne protokol mængder er for en 18 x 18 mm dækglas. Valgfrit: Det er tilrådeligt at gennembore testiklerne nær den relative placering af den celle type af interesse. Dette vil sikre, at der er minimalt tryk på disse celler under squashing trin, og dermed bevare deres strukturelle integritet. Gennemboring af testiklerne kan udføres ved hjælp af en skarp, ren skalpel.
- Placer forsigtigt et dækglas på toppen af prøven.
- Forsegle kanterne af dækglasset ved hjælp af klar neglelak for at sikre, at bufferen ikke fordamper fra levende enhed, mens imaldring.
- Brug en markør til at udpege positionen af testiklerne til lethed i prøveemnet på diaset og gå videre til billeddannelse.
- Vask overskydende DAPI farvning buffer ved at erstatte puffer to gange med 6 pi PBS. Brug et stykke filterpapir for at bortsuge bufferen efter hvert vasketrin. Vær omhyggelig med ikke at uheld fjerne præparatet sammen med buffer under hver vask.
2. Track B. Fremstilling af faste Testes
- Forbered Fix buffer ved at fortynde 37% formaldehyd-stamopløsning i PBS til en slutkoncentration på 3,7% formaldehyd i 1x PBS
- Forbered DAPI farvning buffer ved at fortynde 1 mg / ml DAPI lager til 1 mg / ml i PBS.
- Fordyb testiklerne i en 6 pi dråbe PBS på toppen af en positivt ladet objektglas.
- Manuelt orientere testiklerne i en lineær måde eller på anden måde foretrækkes.
- Brug et stykke filtrerpapir til at væge væk PBS og erstatte det med 6 pi Fixbuffer i 5 minutter.
- Brug et stykke filtrerpapir til at væge væk Fix buffer og fordybe modellen i 6 pi DAPI farvning buffer i 10 min.
- Placer forsigtigt en 18 x 18 mm dækglas på toppen af prøven.
- Forsegle kanterne af dækglasset ved hjælp af klar neglelak for at sikre, at bufferen ikke fordamper fra prøven, mens billeddannelse.
- Brug en markør til at udpege placeringen af testiklerne for lethed i prøveemnet på diaset og gå videre til billeddannelse.
3. Track C. Udarbejdelse af immunofarvet Testiklerne
Dækglas siliconisering: Fordyb flere 18 x 18 mm dækglas i en lille bakke indeholdende siliconizing opløsning og inkuberes i 1 min ved stuetemperatur under en emhætte. Sørg for at dækglas fuldt eksponeret og ikke stables oven på hinanden.
- Placer prøven i en 5 ul dråbe PBS på silikoniseret dækglas. Vendtestikler som ønsket, og gennembore testiklerne med en skarp skalpel. Anbring forsigtigt en positivt ladet objektglas over dækglasset, så PBS bliver jævnt fordelt mellem dækglasset og objektglasset. Brug et lille stykke filterpapir til at væge væk overskydende buffer mellem dækglasset og glide. Som buffer fjernes af filterpapir, vil stigningen i trykket squash testiklerne. Mange prøver bør udarbejdes samtidig, som nogle kan gå tabt eller beskadiget i løbet af protokollen. Et glas gravør kan bruges til at mærke de dias, hvis forskellige prøver vil blive udarbejdet samtidigt.
- Vask dækglas 3x i 1 min hver i vand efterfulgt af 3 x 1 min hver i 70% ethanol, og en endelig vask i 1 min i vand. Lad siliconiserede dækglas lufttørre under en emhætte.
- Drop dias i flydende nitrogen og lade prøven til at fryse i 5-10 min.
- Fjern dias fra liquid kvælstof ved hjælp af en stor pincet. Brug en skalpel til hurtigt at fjerne dækglasset. Prøven skal forblive på diaset. Vær omhyggelig med ikke at smøre prøven i løbet af denne proces ved at skubbe dækglasset langs diaset.
- Glassene inkuberes i forafkølet methanol i et glas Coplin farvning krukke ved -20 ° C i 15 min.
- Overfør dias til et glas Coplin farvning beholder indeholdende forafkølet acetone ved -20 ° C i 30 sek.
- Vaskes objektglassene i 1 min i PBS ved stuetemperatur under anvendelse af et glas Coplin farvning krukken.
- Forbered PBST-B ved at supplere PBS med 0,1% Triton-X100 og 1% bovint serumalbumin (BSA). 5% normalt serum fra den samme værtsart som det sekundære antistof (fra trin 3.14), kan anvendes i stedet for BSA for at reducere baggrundsstøjen er fremstillet af ikke-specifik sekundær antistofbinding.
- Glassene inkuberes i 10 min i PBST-B i et glas Coplin farvning krukke for at blokere uspecifikke sites.
- Fyld brøndene ifugt kammer med vand. Fugtighed i kammeret vil minimere fordampning af antistofopløsninger fra prøven under inkubationstrin.
- Forbered PBST-BR ved at supplere PBST-B med 100 ug / ml RNase A. RNase A nedbryder RNA i prøven og fungerer også som en ekstra blokering agent ved at absorbere kraftigt til glasoverfladen.
- Placer en omtrent 1x1 cm stykke Parafilm oven på prøven for at sprede antistofopløsning jævnt og beskytte antistof-opløsningen fordamper. Luk fugt kammer og inkuber modellen i det primære antistof i 1 time ved stuetemperatur.
- Fjern dias fra PBST-B. Brug et stykke filtrerpapir til at tørre område af objektglasset omkring prøven, ved hjælp af forsigtighed for ikke at tørre prøven selv. Endelig placere dias i fugt kammer med prøven opad
- Forsigtigt tilføje 100 ul primært antistof fortyndet i PBST-BR oven specImen (1:200 er generelt et godt udgangspunkt koncentration for uncharacterized antistoffer).
- Dæk prøven med en cirka 1 x 1 cm stykke Parafilm og lukke fugt kammer. Inkuber modellen i sekundært antistof i 1 time ved stuetemperatur.
- Åbn fugt kammer og bruge pincet til forsigtigt at fjerne Parafilm fra diaset. Glassene inkuberes i 5 minutter i PBST i et glas Coplin farvning krukke ved stuetemperatur at vaske. Gentag denne fremgangsmåde til i alt tre vaske.
- Fjern dias fra PBST-B og placere dem i fugt kammer med prøven opad. Forsigtigt tilføje 100 ul sekundært antistof fortyndet i PBST-BR på toppen af prøven.
- Åbn fugt kammer og bruge pincet til forsigtigt at fjerne Parafilm fra diaset. Igen, vaske prøven 3x i 5 min hver i PBST i et glas Coplin farvning krukke efterfulgt af 3x i 5 min hver i PBS.
- Brug en Kimwipe-og filterpapir til omhyggeligt tørre overfladen af dias, være omhyggelig med at undgå at berøre eller tørring af prøven.
- Tilsæt 6 ul monteringsmedie at prøve, dække med en ren dækglas (ikke belagt med silikone), og tætningen kanter med neglelak.
- Brug en markør til at udpege placeringen af testiklerne for lethed i prøveemnet på diaset og gå videre til billeddannelse.
4.. Imaging Notes
Imaging kan opnås ved hjælp af en opretstående eller omvendt almindeligt lys mikroskop eller konfokal mikroskop. Det er vigtigt, at mikroskopet være udstyret med fasekontrast, især for billeddannelse af levende testikler prøver (spor A). Denne funktion er for nylig blevet tilgængelige på konfokal mikroskoper.
Når testiklerne bryder spontant (spor A), er spidsen (stamcelle-regionen) normalt holdes intakt og let kan identificeres, hvilket giver en god markør i første omgang at finde og bruge til orientering.
_content "> centrioler er forholdsvis små strukturer og billeder bør derfor tages med 63x eller 100X mål, en zoom faktor 4-6X, og en opløsning på mindst 512 x 512 pixels når muligt.Representative Results
Centrosomes gennemgå flere morfologiske og funktionelle forandringer i løbet af spermatogenesen. Denne egenskab af spermatogenesen gør testiklerne et nyttigt system til at studere forskellige aspekter af centrosome biologi. En sådan let observeret proces er centrosome forlængelse. I spermatogonier, den centriolar markør ANA1-GFP markerer 0,6 um lange centriole (figur 4a). Denne centriole elongates under spermatogenesen og når en længde på 2,5 um i næsten modne spermatider. Da centrioler i Drosophila sædceller er unikt lang, kan billeddannelse bruges til at lave kvantitative udsagn om centrosome forlængelse (figur 4b). Analyse af centriole Længden kan også udføres i en mutant baggrund og forskellige mutanter er blevet identificeret, der ændrer centriole vækst (figur 5). Eksempler er altid tidligt (aly) og Cannonball (CAN), mutationer, Arrest spermatogenesen før påbegyndelsen af meiosen 30, men ikke blokerer centriole forlængelse. I disse mutanter, centrioler af modne spermatocyte vokse til omkring ~ 2,4 um i forhold til centrioler af kontrol celler, som når et maksimum på 1,8 um.
Figur 1. Spermatogenesen og centrosome Biology. A) Udvikling af stamceller og spermatogonier. Alle sædceller stammer fra stamceller findes på den apikale spids af testiklerne. Hver Stem Cell opdeler asymmetrisk for at danne en stamcelle, der arver moderen centrosome og en stamfader spermatogonium der arver datteren centrosome 31. Som spermatogonia formular, bliver de omgivet af 2 cyste celler, der fortsat omgiver spermatocytter og spermatider hele spermatogenesen. Spermatogonia divide 4 gange for at producere 16 spermatogonia, der hver indeholder to centrioler. B) Udvikling af spermatocytter og meiose. Under spermatocyte udvikling, centrioler duplikere en gang mere for at generere fire centrioler organiseret i to par pr celle og 64 centrioler pr cyste. Tidligt under spermatocyte udvikling, hver centriole flytter til plasmamembranen, dokker til det, og elongates at danne en struktur, der ligner en primær cilium 18,32-34. På modne spermatocytter, centriole længde når ~ 1,8 um. De centrosomes spille en væsentlig rolle i meiose. Under meiose I, de centriole par, der stadig er fastgjort til plasmamembranen hen imod midten af cellen og skabe cellemembranen invaginationer på deres distale spids. PCM omkring centrioler vokser, nucleates astrale mikrotubuli og colocalizes med spindelpol. Under overgangen til meiose II, adskiller centriole par, så kun et enkelt centriole er præsent ved hver spindel pol. C) Spermiogenesis. Ved udgangen af meiose II Early Round sædcelleantal har en enkelt centriole fastgjort til sammentrækningsorgan plasmamembranen. En stor rund mitokondrie derivat er fundet i nærheden kernen og senere begynder at langstrakt langs voksende axoneme i senere Round spermatider. Under spermatogenese de axoneme former og elongates inde i cytoplasmaet. Desuden vises en ny centriolar struktur kaldet PCL (proksimal centriole Ligesom) nær allerede eksisterende centriole 1.. Ved udgangen af spermatogenesen, celler deler en fælles cyste adskilt fra hinanden for at blive fuldt modne bevægelige sædceller. De diagrammer over spermatocyte udvikling (B) og Spermiogenesis (C) viser kun en celle ud af de 16 spermatocytter og 64 spermatider henholdsvis pr cyste, og ikke skildrer cyste celler. Klik her for at se det i stortr figur.
Figur 2. Drosophila Testikler. En overlejring af et fasekontrast-og GFP-fluorescens mikrograf af en hel-mount testis udtrykker den pan-centriolar markør Ana-1-GFP. Distinct areal svarende til panelerne 1-3 i figur 1 er adskilt af en stiplet rød linje A) Stamceller og spermatogonia, B) spermatocytter og meiose, C) Spermiogenesis.
Figur 3. Tracks Mod Imaging centrosomes i Drosophila Testes.
Figur 4.. Centrosome Forlængelse Under Spermatogenese. A) Hvert trin viser et fase-kontrast billede (til venstre), fluorescens billede (i midten), og forstørret billede af centrosome (højre). Fase-kontrast billede viser den særlige celle stadiet baseret på positionen og morfologi af cellen, nucleus, nucleolus, og mitokondrier. Fluorescens billede viser DNA farvet med DAPI (blå). Centrosome billede viser centrosomes mærket med Asterless-GFP (ASL, top billeder) og ANA1-GFP (ANA1, nederste billede). En hvid cirkel fremhæver cellemembranen i både fase-kontrast og fluorescens billeder. De stiplede hvide cirkler og grå cirkel i fluorescensbillede markere den position af kernen og nucleolus hhv. Gul pil peger på Y-kromosomernenogle sløjfer. Rød stiplede cirkler markerer mitokondrierne. Stages 1-6 refererer til 29 og iscenesætter 13-17 refererer til beskrivelsen af celle stadier i 32.. Trin 1: Primær spermatocyte. Identificeret som et småcellet en spids af testiklerne. Etape 2a: Polar spermatocyte. Identificeres ved tilstedeværelsen af en mitokondrier hætte på den ene side af kernen. Trin 3: apolært spermatocyte. Identificeret ved sin relative større størrelse end den primære spermatocyte og mangel på en mitokondrier hætte. Trin 4: Primær spermatocyte. Identificeret ved fremkomsten af alle: Alle 3 Y-kromosom sløjfer. Trin 5: Modne Primary spermatocyte. Største spermatocyte produceret i Spermatogenese, identificeret ved en yderligere stigning i nukleare størrelse. Trin 6: Premeiotic Primary spermatocyte. Y-kromosom sløjfer smuldre og kernen forsvinder. Etape 13: Onion Stage sædcelleantal. Runde celle indeholdende lige store kerne og mitokondrier. Etape 17: Late sædcelleantal. Identificeret som en langstrakt sædcelleantal som forbliver en del af en Bundle af 64 spermatider med kerner findes nær bunden af testiklerne., Kerner er lidt bredere end modne spermatider fundet i sædblæren. Skalapanelerne, 10 um og 1 um. B) Graf viser gennemsnit og standardafvigelse for hver fase målt ved Asterless-GFP (blå) og ANA1-GFP (grøn). I fase 6, Asterless-GFP (blå) og ANA1-GFP (grøn) gennemsnit og standardafvigelser overlapper hinanden, og kun Asterless-GFP (blå) er tydelig. Starter ved Stage 13, er Asterless-GFP ikke dekorere hele centriole og målinger blev ikke bestemt (ND).
Figur 5. Unormalt lange centrioler i Stage 6 spermatocytter af Aly og kan mutanter. AC) lysmikroskopi af hele testikler og fluorescerende panel af repræsentative centrosome laBeled af ANA1-GFP. Bemærk den unormal form af testiklerne i aly og kan mutanter, der skyldes en mangel på spermatider som en konsekvens af meiotisk anholdelse. D) Graf viser gennemsnittet, standardafvigelse og data distribution af centriole længde i vildtype, Aly og kan . Prøve nummer for hvert datapunkt er i parentes. Målestok, 1 um.
Discussion
Studere centrosome biologi i flyve testikler ved hjælp af genetisk-mærkede centrosomal markører er en nyttig metode til at vurdere centrosome funktion og aktivitet i både en vildtype og mutant kontekst. I særdeleshed, Bane A er velegnet til hurtig screening af centrosomal abnormiteter såsom misdannelse, misegregation, ustabilitet, eller unormal længde i et forsøg på at identificere nye mutanter. Desuden sædcelleantal cilier i levende præparater forbliver motile i ca 15 min efter dissektion og brugen af levende testikler i Track A giver også for spermamotilitet være let løses. Da aktiviteten af sperm motile cilier er direkte relateret til centrosome funktion, kan analyser udføres for at bestemme effekten af forskellige centrosomal mutationer på ciliaere funktion. Spor B kan bruges til mere specifikke bemærkninger, især når de statistiske data, der er nødvendige, såsom til at tælle antallet af centrioler per celle og eller antal celler pr cyste. Spor C er mest useful for detaljerede observationer, der kræver farvning med antistoffer. Eksempler indbefatter mærkning af en bestemt celletype, såsom stamceller, farvning af et protein, der ikke har en tilgængelig tag såsom acetyleret tubulin eller til at kontrollere fravær eller mislocalization af et protein i en mutant.
Når billeddannelse centrosomes og centrosome-relaterede strukturer ved hjælp af genetisk mærkede markører snarere end antistoffer er ikke kun eksperimentelt lettere, men også giver mere robuste og reproducerbare resultater. Derfor er brugen af genetisk mærkede centrosomal proteiner er en pålidelig metode til mekanistiske og kvantitative analyser, der kræver et stort datasæt. For eksempel har brugen af genetisk mærkede centrosomal markører været særligt værdifulde til kvantificering af centriole længde. Sådan analyse har afsløret, at forskellige mutationer kan inddeles i to kategorier baseret på variation i centriole længde. Én kategori omfatter mutationer, change centriole længde, men ikke påvirker standardafvigelsen 1 og den anden kategori omfatter mutationer, der påvirker både centriole længde og standardafvigelsen i længden 11. Sådanne kvantitative data kan give nyttig indsigt i funktionen af bestemte centrosomal gener. Centrosomal mutanter, som udviser defekt centriole længde med en stigning i standardafvigelse kan skyldes en destabilisering af centriolar struktur. Defekt centriole længde med en normal standard fejl, kan dog angive, at mutationen ikke strukturelt destabilisere centriole og er mere tilbøjelige til at være på grund af en ændring i reguleringsmekanisme kontrollerende centriole længde. På grund af uoverensstemmelser i immunofarvning, er det vanskeligt med brugen af antistofmarkørerne alene kvantitative analyser.
Centrosome er en stor, kompleks proteinholdige struktur og mange af dets proteiner findes kun inden for dens indre. Brug genetisk mærkede centrosomalmarkører snarere antistoffer tillader en konsekvent mærke interne komponenter centrosome, hvis epitoper kan være anderledes utilgængelige for antistofmarkørerne. For eksempel localization undersøgelser af Bld10 anvendelse af antistoffer finder protein, der skal beriges ved de distale og proximale ender af centriole 13, mens Bld10-GFP viser en mere ensartet fordeling 1. Men det er også vigtigt at overveje niveauet af ekspression af et særligt genetisk mærkede protein, da dette kan påvirke protein distribution. Lokalisering af Sas-4-GFP og SAS-6-GFP udtrykkes under deres endogene er begrænset til de proximale ender af centriole 1,16,35 På den anden side, Sas-4-GFP og SAS-6-GFP udtrykkes under stærk ubiquitinpromotoren er lokaliseret langs hele længden af centriole 12,14. En anden vigtig overvejelse er virkningen af den genetiske tag på proteinfunktion. Analysere om genetisk mærkede proteiner er funktionelle kan være TESTED ved at indføre de transgene proteiner til en mutant baggrund og undersøge, om de transgene proteiner redder mutantfænotypen.
Fiksering af Drosophila testiklerne kan udføres ved hjælp af en række kemiske fikseringsmidler. Her beskriver vi fiksering med både formaldehyd (spor B) og methanol-acetone (spor C). Dog kan enten fikseringsmiddel anvendes i flæng, og da forskellige fikseringsmidler kemisk kan forstyrre native antistofepitoper, skal valget af den passende fiksativ til immunfarvning bestemmes eksperimentelt. Følgende fikseringsmidler og inkubationsbetingelser er almindeligt anvendt: 3,7% formaldehyd, 5 minutter ved stuetemperatur, methanol, 15 minutter ved -20 ° C acetone i 10 minutter ved -20 ° C, methanol, 15 minutter ved -20 ° C. efterfulgt af acetone, 30 sekunder ved -20 ° C, ethanol, 20 minutter ved -20 ° C. Selvom fiksering med acetone, methanol og ethanol ikke kræver en udvidet permeabilization skridt for immunfarvning, fiksering with formaldehyd bør efterfølges af en 1 times inkubation i PBST-B ved stuetemperatur for at permeabilisere cellemembraner og tillade antistof adgang til intracellulære epitoper. Endvidere er visse fikseringsmidler er mere egnede til bestemte antigener. For eksempel formaldehyd fungerer godt til fiksering af små proteiner, mens methanol og acetone er velegnede til fiksering af store molekylære komplekser 36.
Immunfarvning af Drosophila testiklerne er tidligere blevet beskrevet for at observere chromatin strukturer og mikrotubulus-cytoskelettet 29,37. Her (spor C), er proceduren blevet optimeret til analyse af centrosomal strukturer, der indeholder genetisk mærkede proteiner. Vi giver en detaljeret beskrivelse af denne procedure til at vejlede personer, der er uerfaren i at arbejde i Drosophila testikler. Denne procedure indbefatter også modifikationer til forbedring af bevarelse og morfologien af testiklerne, såsom ved hjælp af siliconized dækglas og positivt ladede glas objektglas.
Disclosures
Fri adgang til denne publikation blev støttet af Leica Microsystems.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en bevilling (R01GM098394) fra NIH og National Institute of General Medical Sciences samt tilskud 1.121.176 fra National Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Positively Charged Slides | AZER Scientific | EMS200A+ | |
| Feather Microscalpel | Electron Microscopy Sciences | 72045-30 | |
| 37% Formaldehyde or Paraformaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Boston Bioproducts | BM-220 | |
| 18x18 mm coverslips number 1.5 | VWR | 48366 205 | |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100 ml | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| Acetone | Fisher Scientific | A949-1 | |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T9284-100ML | |
| BSA | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| RNAse A | 5 prime | 2900142 | |
| Filter paper | Whatman | 1001-055 | |
| Glass engraver | Dremel | 290-01 | |
| TCS SP5 confocal microscope | Leica | ||
| Mounting Media | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
| Immuno Stain Moisture Chamber, Black | Electron Microscopy Sciences | 62010-37 | |
| Glass Coplin Staining Jar, Screw Cap | Electron Microscopy Sciences | 70315 |
References
- Blachon, S., et al. A proximal centriole-like structure is present in Drosophila spermatids and can serve as a model to study centriole duplication. Genetics. 182, 133-144 (2009).
- Hennig, W. Spermatogenesis in Drosophila. The International journal of developmental biology. 40, 167-176 (1996).
- Fabian, L., Brill, J. A. Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages. Spermatogenesis. 2, 197-212 (2012).
- White-Cooper, H. Molecular mechanisms of gene regulation during Drosophila spermatogenesis. Reproduction. 139, 11-21 (2010).
- Davies, E. L., Fuller, M. T. Regulation of self-renewal and differentiation in adult stem cell lineages: lessons from the Drosophila male germ line. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 73, 137-145 (2008).
- Belote, J. M., Zhong, L. Duplicated proteasome subunit genes in Drosophila and their roles in spermatogenesis. Heredity. 103, 23-31 (2009).
- Xiao, X., Yang, W. X. Actin-based dynamics during spermatogenesis and its significance. Journal of Zhejiang University. Science. B. 8, 498-506 (2007).
- Hennig, W. Chromosomal proteins in the spermatogenesis of Drosophila. Chromosoma. 111, 489-494 (2003).
- Wakimoto, B. T. Doubling the rewards: testis ESTs for Drosophila gene discovery and spermatogenesis expression profile analysis. Genome research. 10, 1841-1842 (2000).
- Avidor-Reiss, T., Gopalakrishnan, J. Building a centriole. Curr Opin Cell Biol. , (2012).
- Blachon, S., et al. Drosophila asterless and vertebrate Cep152 Are orthologs essential for centriole duplication. Genetics. 180, 2081-2094 (2008).
- Basto, R., et al. Flies without Centrioles. Cell. 125, 1375-1386 (2006).
- Mottier-Pavie, V., Megraw, T. L. Drosophila bld10 is a centriolar protein that regulates centriole, basal body, and motile cilium assembly. Mol Biol Cell. 20, 2605-2614 (2009).
- Rodrigues-Martins, A., et al. DSAS-6 Organizes a Tube-like Centriole Precursor, and Its Absence Suggests Modularity in Centriole Assembly. Curr Biol. 17, 1465-1472 (2007).
- Stevens, N. R., Dobbelaere, J., Brunk, K., Franz, A., Raff, J. W. Drosophila Ana2 is a conserved centriole duplication factor. J Cell Biol. 188, 313-323 (2010).
- Gopalakrishnan, J., et al. Sas-4 provides a scaffold for cytoplasmic complexes and tethers them in a centrosome. Nat Commun. 2, 359 (2011).
- Gopalakrishnan, J., et al. Tubulin nucleotide status controls Sas-4-dependent pericentriolar material recruitment. Nat Cell Biol. 14, 865-873 (2012).
- Riparbelli, M. G., Callaini, G., Megraw, T. L. Assembly and persistence of primary cilia in dividing Drosophila spermatocytes. Dev Cell. 23, 425-432 (2012).
- Maines, J. Z., Wasserman, S. A. Post-transcriptional regulation of the meiotic Cdc25 protein Twine by the Dazl orthologue Boule. Nat Cell Biol. 1, 171-174 (1999).
- Herrmann, S., Amorim, I., Sunkel, C. E. The POLO kinase is required at multiple stages during spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Chromosoma. 107, 440-451 (1998).
- Yamashita, Y. M., Jones, D. L., Fuller, M. T. Orientation of asymmetric stem cell division by the APC tumor suppressor and centrosome. Science. 301, 1547-1550 (2003).
- Dix, C. I., Raff, J. W. Drosophila Spd-2 Recruits PCM to the Sperm Centriole, but Is Dispensable for Centriole Duplication. Curr Biol. , (2007).
- Stevens, N. R., Dobbelaere, J., Wainman, A., Gergely, F., Raff, J. W. Ana3 is a conserved protein required for the structural integrity of centrioles and basal bodies. J Cell Biol. 187, 355-363 (2009).
- Giansanti, M. G., Bucciarelli, E., Bonaccorsi, S., Gatti, M. Drosophila SPD-2 Is an Essential Centriole Component Required for PCM Recruitment and Astral-Microtubule Nucleation. Curr Biol. , (2008).
- Januschke, J., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Drosophila neuroblasts retain the daughter centrosome. Nat Commun. 2, 243 (2011).
- Cheng, J., et al. Centrosome misorientation reduces stem cell division during ageing. Nature. 456, 599-604 (2008).
- Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster testes. J. Vis. Exp. , e2641 (2011).
- Fuller, M. T. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-174 (1993).
- Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis. J Cell Sci. . 107 (Pt. 12), 3521-3534 (1994).
- White-Cooper, H., Schafer, M. A., Alphey, L. S., Fuller, M. T. Transcriptional and post-transcriptional control mechanisms coordinate the onset of spermatid differentiation with meiosis I in Drosophila. Development. 125, 125-134 (1998).
- Yamashita, Y. M., Mahowald, A. P., Perlin, J. R., Fuller, M. T. Asymmetric inheritance of mother versus daughter centrosome in stem cell division. Science. 315, 518-521 (2007).
- Tates, A. D. Cytodifferentiation during Spermatogenesis in Drosophila melanogaster: An Electron Microscope Study. , Rijksuniversiteit de Leiden. Leiden, Netherlands. (1971).
- Baker, J. D., Adhikarakunnathu, S., Kernan, M. J. Mechanosensory-defective, male-sterile unc mutants identify a novel basal body protein required for ciliogenesis in Drosophila. Development. 131, 3411-3422 (2004).
- Avidor-Reiss, T., Gopalakrishnan, J., Blachon, S., Polyanovsky, A. The Centrosome: Cell and Molecular Mechanisms of Functions and Dysfunctions in Disease. Schatten, H. , Humana Press. (2012).
- Gopalakrishnan, J., et al. Self-assembling SAS-6 multimer is a core centriole building block. J Biol Chem. 285, 8759-8770 (2010).
- Hassell, J., Hand, A. R. Tissue fixation with diimidoesters as an alternative to aldehydes. I. Comparison of cross-linking and ultrastructure obtained with dimethylsuberimidate and glutaraldehyde. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 22, 223-229 (1974).
- Pisano, C., Bonaccorsi, S., Gatti, M. The kl-3 loop of the Y chromosome of Drosophila melanogaster binds a tektin-like protein. Genetics. 133, 569-579 (1993).
