Summary
Beeldvorming van centrosomal eiwitten in Drosophila spermatogenese is een krachtige methode om nieuwe eiwitten essentieel voor centrosome biologie identificeren en de specifieke functie van bekende spelers in dit proces verduidelijken.
Abstract
Centrosomes geconserveerd microtubule organellen basis waarvan de structuur en functie dramatisch veranderen tijdens de celcyclus en celdifferentiatie. Centrosomes zijn essentieel voor de celdeling as bepalen tijdens de mitose en cilia nucleëren tijdens interfase. De identiteit van de eiwitten die deze dynamische mediëren blijft slechts gedeeltelijk bekend en de werking van veel van de eiwitten die zijn betrokken bij deze processen is rudimentair. Recent onderzoek heeft aangetoond dat Drosophila spermatogenese biedt een krachtig systeem om nieuwe eiwitten van cruciaal belang voor centrosome functie en vorming als om inzicht te krijgen in de specifieke functie van de bekende spelers in-centrosome gerelateerde processen te krijgen. Drosophila is een gevestigde genetisch modelorganisme waar mutanten in centrosomal genen kunnen gemakkelijk worden verkregen en gemakkelijk geanalyseerd. Bovendien zouden de recente ontwikkelingen in de gevoeligheid en resolutie van lichtmicroscopie en deontwikkeling van robuuste genetisch gelabeld centrosomal markers hebben de mogelijkheid om Drosophila testes gebruiken als een eenvoudige en toegankelijke modelsysteem om centrosomen studeren getransformeerd. Dit document beschrijft het gebruik van genetisch-gelabeld centrosomal markers om genetische screens uit te voeren voor nieuwe centrosomal mutanten en inzicht in de specifieke functie van nieuw geïdentificeerde genen krijgen.
Introduction
Drosophila testes een geschikte orgaansysteem een verscheidenheid van cellulaire en ontwikkelingsprocessen te bestuderen en zijn uitgebreid beoordeeld in de jaren 1-9. Dit handschrift oog op de ontwikkeling van Drosophila testes centrosome, een geconserveerd cellulair organel bestuderen. Net als in andere systemen, de centrosome van de Drosophila testes functie in mitose, meiose, en ciliogenese 10. Centrosomes bestaan uit een paar microtubulus gebaseerde structuren bekend als centrioles omgeven door een genoemd pericentriolar materiaal (PCM) complex eiwitnetwerk. De centriole paar bestaat uit een oudere moeder centriole en een jongere dochter centriole. Als de cel vordert richting mitose, zowel centriolen scheiden, dupliceren, en het verwerven van een grote hoeveelheid PCM om uiteindelijk vormen twee verschillende centrosomes. Centrosome met de oorspronkelijke moeder centriole wordt aangeduid als de moeder centrosome en het ceOsome met de oorspronkelijke dochter centriole wordt aangeduid als de dochter centrosome.
Drosophila testes zijn ideaal voor het bestuderen van de moleculaire basis van centrosome biologie door fluorescentiemicroscopie om verschillende redenen.
- De meeste Drosophila eiwitten die nodig zijn voor centrosome biologie de testes geconserveerd onder eukaryoten suggereert dat inzicht centrosome biologie bij mensen en andere soorten betrokken kunnen worden verkregen door het bestuderen centrosome in Drosophila testes 1,11-14.
- Het uitvoeren van mutant analyse in Drosophila biedt een groot voordeel, omdat, in tegenstelling tot vele andere modellen, centrosomal mutaties in Drosophila zijn niet embryonale dodelijk, waardoor voor klassieke genetische analyse van centrosome functie. Deze unieke eigenschap van Drosophila is door de aanwezigheid van maternale bijdrage die aanhoudt tijdens de kritieke fasen van de embryonale ontwikpment. 1,11-14. Zo kan men a) studie mutaties die volledig elimineren centrosome vorming en b) bestuderen het lot van een normale centrosome dat in de vroege embryo werd gevormd door maternale bijdrage in een mutant context na de moederlijke bijdrage is uitgeput (het principe van de methode wordt beschreven in 11).
- Functionele transgenen met genetisch gecodeerd fluorescerende labels die centrosome label beschikbaar. Veel van deze lijnen te gebruiken promotor van het eiwit om transcriptie van het transgen om sterke overexpressie voorkomen. Dit is bijzonder belangrijk omdat overexpressie van eiwitten leidt vaak tot artefacten die interfereren met de analyse van centrosome functie 1,11.
- De centriole en centrosome zijn uniek lange hele Drosophila spermatogenese, waardoor voor een snelle en eenvoudige analyse van de centrosome door beeldvorming.
- Opeenvolgende stappen in spermatogenese en centrosome biology chronologisch georganiseerd langs de testes, vanaf de testis tip met de centrosomes sperma stamcellen en eindigend onder in de testes met verminderde centrosome grootte en activiteit in rijpe spermacellen (figuren 1 en 2). Dit zorgt voor gemakkelijke identificatie en analyse van centrosome functie tijdens de verschillende stadia van sperma ontwikkeling.
- Testes zijn gemakkelijk ontleed uit mannelijke larven, poppen, en volwassenen 27.
- Tijdens de spermatogenese, de centrosome en haar centriolen verder door meerdere compositorische, structurele en functionele staat te functioneren in mitose, meiose, en cilium vorming. Tijdens deze processen, de centrosome assembleert, duplicaten, migreert, ankers om specifieke delen van de cel, rijpt, delen, en zorgt voor een cilium. Bovendien is de centriole van het rijpe spermatide ontstaat een centriolar precursor genoemd de PCL 1. Ook in de volwassen spermatide, centrosome ondergaat een proces called centrosome vermindering waarbij verliest veel onderdelen van het PCM en centriole (figuren 1 en 2). Zo studies in de testikels laten ons toe om meerdere aspecten van centrosome leven zoals centrosome retentie in de stamcellen, centriole duplicatie, centriole stabiliteit, centriole rek, centriole separatie en segregatie, PCM werving, ciliogenese, PCL vorming, centrosome reductie, en aan te pakken astrale microtubuli nucleatie onder anderen.
- Tenslotte studies centrosome biologie geholpen door de andere bekende eigenschappen van Drosophila dat het een aangewezen modelorganisme voor biologische studies hebben. Deze omvatten een korte generatietijd, gemak van genetica, alsook willekeurige en plaatsgerichte mutagenese.
Samen vormen de hierboven genoemde kenmerken van Drosophila testes biedt een model waarbij de centrosome kan worden bestudeerd door eenvoudig, snelle en gedetailleerde beeldvorming. De beschreven techniekenin dit document zijn toegepast op vele aspecten van het centrosome biologie waaronder centriole vorming 11, centriole dubbel 15, PCM werving 16, centrosome regulering 17 en ciliogenese 18 onderzoeken. Deze technieken zijn ook toegepast op centrosome studie in het gebied van biologie, zoals meiotische regulering 19 spilstelsel 20 en centrosome activiteit in asymmetrische stamcellen celdeling 21 onder vele anderen.
Beeldvorming van testes in de centrosome begint met het verkrijgen van vliegen die genetisch-gelabelde centrosomal eiwitten tot expressie en het isoleren van de testikels van mannelijke larven, poppen of volwassen vliegen. Deze vliegen zijn verkrijgbaar bij verschillende onderzoeksgroepen 1,11,15,22-25. De larvale testes bevatten alle stadia van de spermatogenese voorafgaand aan meiose en zijn nuttig bij het analyseren van mutaties die dodelijk zijn in de pop of volwassene. Echter, Late pupal of jonge adult testes zijn de meest robuuste en bevatten alle pre-en post-meiotische stadia van de spermatogenese, waardoor ze de voorkeur voor analyse maken. Aangezien het aantal zaadcellen af naarmate de vlieg leeftijd, het gebruik van volwassen teelballen is ook geschikt voor het bestuderen centrosome in de context van veroudering. 26. Werkwijze testis isolatie van volwassen vliegen is eerder beschreven 27.
Beeldvorming van centrosomes en hun functie in Drosophila testes kan worden bereikt via drie samenhangende sporen dat hier (figuur 3) worden gepresenteerd. Selectie van welk spoor het meest geschikt is afhankelijk van de aard van de vraag de onderzoeker richt.
Spoor A impliceert beeldvorming van levend testes. Het is de snelste van de drie sporen maar kan alleen worden toegepast wanneer specimens niet te worden bewaard en wanneer immunokleuring is niet vereist. Volg A, zijn testikels gemonteerd (intact, doorboord of gesneden) op dia'sen zorgvuldig onder een dekglaasje geplet tot een enkele laag van gemakkelijk identificeerbare cellen vormen. De cellen worden vervolgens gevisualiseerd middels zowel fase-contrast microscopie en fluorescentie microscopie. Het gebruik van fase-contrast is bijzonder belangrijk voor de analyse van Drosophila testes want het toont cellulaire informatie die niet zichtbaar met andere vormen van uitgezonden verlichting en aldus zorgt voor een snelle bepaling van de verschillende fasen van sperma ontwikkeling 28,29. Echter, Spoor A heeft twee belangrijke nadelen. Eerst wordt de morfologische integriteit van cellen vaak aangetast wanneer de testes zijn gescheurd. Ten tweede, niet gefixeerde cellen soms verplaatsen binnen het model, waardoor de beeldvorming van meerdere confocale lagen binnen een bepaald gebied moeilijk. Om de analyse van specifieke celtypen te bevorderen, kan testes worden doorboord of gesneden om direct de manier waarop de testis breuken zodanig dat pletten onder het dekglaasje minimaal van invloed op de morfologie van het celtype van belang.
Spoor B omvat chemische fixatie van de testes. Deze track vereist een tussenstap hoeveelheid tijd voor prepareren en heeft het voordeel dat vaste exemplaren kunnen worden opgeslagen voor latere analyse. Bovendien fixatie dient om cellulaire structuren stijver te maken, het minimaliseren van beweging van het monster tijdens de beeldvorming. Echter, fase-contrast microscopie wordt veel minder informatief na chemische fixatie, waardoor sommige fasen van sperma ontwikkeling moeilijk te identificeren.
Track C is het meest tijdrovende, maar heeft het voordeel dat de cellulaire structuren vast en immunostained, waardoor de visualisatie van eiwitten die niet beschikbaar zijn met de juiste genetische tags. Er zijn veel antilichamen beschikbaar voor zowel commercieel als vanuit verschillende onderzoeksgroepen voor immunobeeld centrosomes en-centrosome verwante structuren in Drosophila testes.
Protocol
1. Track A. Bereiding van Levende Testes
- Bereid PBS door het oplossen van 8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2 HPO 4, 0,24 g KH 2 PO 4 in 800 ml gedestilleerd water en breng de pH op 7,4. Breng het volume op 1 L en steriliseer in de autoclaaf.
- Isoleer testes zoals eerder beschreven 27.
- Bereid DAPI kleuring buffer door verdunning van 1 mg / ml voorraad tot 1 ug / ml in PBS. Gebruik aluminiumfolie om de buis te beschermen tegen licht en bewaar bij -20 ° C.
- Na isoleren van de testes, dompel het monster in 6 pl DAPI kleuring buffer op een positief geladen microscoopglaasje gedurende 10 minuten. Testes hechten goed op in de handel verkrijgbare positief geladen dia's, zorgen voor gemakkelijke manipulatie van het monster. Positief geladen objectglaasjes covalent gemodificeerd geven een statische positieve lading aan het glasoppervlak. Net als polylysine coating, dit bevordert de interactie van de testes with het oppervlak van de dia.
- Was overmaat DAPI tweemaal vervangen kleuring buffer 6 pl PBS. Gebruik een stuk filtreerpapier om lont weg van de buffer na elke wasstap. Wees voorzichtig om niet per ongeluk de testes, samen met de buffer tijdens elke wasbeurt te verwijderen.
- Voeg 6 pi PBS met het model. De hoeveelheid buffer die moet worden aangepast aan de grootte van het dekglaasje. De volumes in dit protocol zijn voor een 18 x 18 mm dekglaasje. Optioneel: Het is raadzaam om de testes doorboren nabij de relatieve locatie van het celtype van interesse. Dit zal ervoor zorgen dat er minimale druk op deze cellen tijdens het pletten stap, waardoor hun structurele integriteit handhaven. Doorboren van de testes kan worden uitgevoerd met een scherpe, schone scalpel.
- Plaats een dekglaasje voorzichtig op de bovenkant van het monster.
- Dicht de randen van het dekglaasje met behulp van duidelijke nagellak om ervoor te zorgen dat de buffer niet verdampt uit het levend exemplaar, terwijl imaging.
- Gebruik een markering aan om de positie van de testes voor het gemak aan te wijzen in het monster op de glijbaan en overgaan tot beeldvorming.
- Was overmaat DAPI kleuring buffer tweemaal vervangen van de buffer 6 pl PBS. Gebruik een stuk filtreerpapier om lont weg van de buffer na elke wasstap. Wees voorzichtig om niet per ongeluk het specimen samen met de buffer tijdens elke wasbeurt te verwijderen.
2. Track B. Bereiding van Vaste Testes
- Bereid Fix buffer door verdunning van 37% formaldehyde voorraadoplossing in PBS tot een eindconcentratie van 3,7% formaldehyde in 1x PBS
- Bereid DAPI kleuring buffer door verdunning van 1 mg / ml DAPI voorraad tot 1 ug / ml in PBS.
- Dompel de testes in 6 pl druppel PBS op een positief geladen microscoopglaasje.
- Handmatig oriënteren de testes lineair of anderszins voorkeur.
- Gebruik een stuk filtreerpapier om lont weg het PBS en te vervangen door 6 pi Fixbuffer gedurende 5 minuten.
- Gebruik een stuk filtreerpapier om lont weg de Fix buffer en dompel het model in 6 pl DAPI vlekken buffer gedurende 10 minuten.
- Plaats een 18 x 18 mm dekglaasje voorzichtig bovenop het monster.
- Dicht de randen van het dekglaasje met behulp van duidelijke nagellak om ervoor te zorgen dat de buffer niet verdampt uit het monster terwijl beeldvorming.
- Gebruik een markering aan om de positie van de testes voor het gemak aan te wijzen in het monster op de glijbaan en overgaan tot beeldvorming.
3. Track C. Bereiding van immunostained Testes
Coverslip silicium: Dompel meerdere 18 x 18 mm dekglaasjes in een kleine lade met siliconisering oplossing en incubeer 1 minuut bij kamertemperatuur onder een zuurkast. Controleer of de dekglaasjes volledig blootgesteld en niet gestapeld bovenop elkaar.
- Plaats het model in een 5 ul druppel PBS op de gesiliconiseerde dekglaasje. Oriënteer detestes zoals gewenst en prik de testikels met een scherp scalpel. Plaats voorzichtig een positief geladen glazen objectglaasje over de dekglaasje, zodat de PBS gelijkmatig verdeeld tussen het dekglaasje en de glijbaan geworden. Gebruik een klein stukje filtreerpapier om lont weg de overtollige buffer tussen het dekglaasje en glijbaan. Als de buffer wordt verwijderd door het filterpapier, zal de drukverhoging pletten de testes. Veel exemplaren moeten gelijktijdig worden voorbereid, zoals sommigen verloren gaan of beschadigd raken in de loop van het protocol. Een glasgraveur kan worden gebruikt om de dia label als verschillende monsters tegelijkertijd worden bereid.
- Was de dekglaasjes 3x gedurende 1 min elk in water, gevolgd door 3x gedurende 1 min elk in 70% ethanol en een laatste wasbeurt gedurende 1 min in water. Laat de gesiliconiseerde dekglaasjes aan de lucht drogen onder een afzuigkap.
- Laat de dia's in vloeibare stikstof en laat het monster te bevriezen gedurende 5-10 minuten.
- Verwijder de dia's van de l-vloeibare stikstof met een grote tang. Gebruik een scalpel om snel te verwijderen van het dekglaasje. Het monster moet op de dia blijven. Wees voorzichtig met het model niet te smeren tijdens dit proces door het schuiven van de dekglaasje langs de glijbaan.
- Incubeer de glaasjes in voorgekoelde methanol in een glazen Coplin kleuring pot bij -20 ° C gedurende 15 minuten.
- Breng de dia een glazen Coplin kleuring pot die voorgekoeld aceton bij -20 ° C gedurende 30 sec.
- Was de dia's voor 1 min in PBS bij kamertemperatuur met een glazen Coplin kleuring pot.
- Bereid PBST-B door aanvulling PBS met 0,1% Triton-X100 en 1% Bovine Serum Albumine (BSA). 5% normaal serum van dezelfde gastheersoort als het secundaire antilichaam (van stap 3.14) kan in plaats van BSA worden gebruikt om de ruis uit niet-specifieke secundaire antilichaam binding te verminderen.
- Incubeer de glaasjes gedurende 10 min in PBST-B in een glazen Coplin kleuring pot voor niet-specifieke sites te blokkeren.
- Vul de putjes vanhet vocht kamer met water. Vochtigheid in de kamer zal de verdamping van antilichaam-oplossingen van het monster te minimaliseren tijdens de incubatie stappen.
- Bereid PBST-BR met PBST-B vullen met 100 ug / ml RNase A RNase A degradeert RNA in het monster en dient ook als een extra blokkeermiddel door sterk zuigende het glasoppervlak.
- Een ongeveer 1x1 cm stuk Parafilm bovenop het monster aan het antilichaam oplossing gelijkmatig verdeeld en de antilichaamoplossing tegen verdampen. Sluit het vocht kamer en incubeer het monster in het primaire antilichaam gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Verwijder de dia's van PBST-B. Gebruik een stuk filtreerpapier drogen het gebied van de slede rond het monster, met voorzichtigheid het monster zelf niet te drogen. Tot slot plaatst u de dia in het vocht kamer met het monster naar boven
- Voeg voorzichtig 100 ul van primair antilichaam verdund in PBST-BR bovenop de specimen (1:200 is over het algemeen een goed uitgangspunt concentratie voor ongekarakteriseerde antilichamen).
- Bedek het monster met een ongeveer 1 x 1 cm stuk van Parafilm en sluit het vocht kamer. Incubeer het monster in het secundair antilichaam gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Open het vocht kamer en een tang om voorzichtig te verwijderen van de Parafilm uit de dia. Incubeer de glaasjes gedurende 5 min in PBST in een glazen Coplin kleuring pot bij kamertemperatuur te wassen. Herhaal dit proces voor een totaal van drie wassingen.
- Verwijder de dia's van PBST-B en plaats ze in het vocht kamer met het monster naar boven. Voeg voorzichtig 100 pl secundair antilichaam verdund in PBST-BR bovenop het monster.
- Open het vocht kamer en een tang om voorzichtig te verwijderen van de Parafilm uit de dia. Nogmaals, was het monster 3x gedurende 5 minuten elk in PBST in een glazen Coplin kleuring pot gevolgd door 3x gedurende 5 minuten elk in PBS.
- Gebruik een Kimwipe en filterpapier aan zorgvuldig droog het oppervlak van de dia, en voorzichtig om te voorkomen dat het aanraken of het drogen van het monster.
- Voeg 6 pl Montage Media grote exemplaren, dek af met een schoon dekglaasje (niet bedekt met siliconen), en het zegel randen met nagellak.
- Gebruik een markering aan om de positie van de testes voor het gemak aan te wijzen in het monster op de glijbaan en overgaan tot beeldvorming.
4. Imaging Notes
Beeldvorming kan worden bereikt met behulp van een rechtopstaande of omgekeerde gewone lichtmicroscoop of confocale microscoop. Het is belangrijk dat de microscoop uitgerust met fasecontrast, vooral voor de beeldvorming van levende testes specimens (spoor A). Deze functie is sinds kort verkrijgbaar op confocale microscopen.
Wanneer de testes breken spontaan (Track A), wordt de tip (stamcel regio) meestal intact gehouden en is gemakkelijk te identificeren, die een goede marker om in eerste instantie te vinden en te gebruiken voor oriëntatie.
_content "> centriolen zijn vrij kleine structuren en beelden moeten daarom worden genomen met behulp van 63X of 100X doelstellingen, een zoomfactor van 4-6X, en een resolutie van minimaal 512 x 512 pixels wanneer mogelijk.Representative Results
Centrosomes ondergaan meerdere morfologische en functionele veranderingen in de loop van de spermatogenese. Dit kenmerk van de spermatogenese maakt de testes een nuttig systeem om de verschillende aspecten van centrosome biologie te bestuderen. Een dergelijke gemakkelijk waargenomen proces centrosome rek. In spermatogonia, de centriolar marker Ana1-GFP markeert de 0,6 micrometer lang centriole (Figuur 4a). Dit centriole verlengt tijdens spermatogenese en een lengte van 2,5 micrometer in bijna volwassen spermatiden bereikt. Sinds centriolen in Drosophila sperma zijn uniek lang, kan beeldvorming worden gebruikt om kwantitatieve uitspraken over centrosome rek (figuur 4b) te maken. Analyse van centriole lengte kan ook worden uitgevoerd in een mutant achtergrond en verscheidene mutanten geïdentificeerd die centriole groei (figuur 5) te wijzigen. Voorbeelden zijn altijd vroeg (Aly) en kanonskogel (kan), mutaties die arrest spermatogenese voor het begin van meiose 30 maar centriole rek niet blokkeren. In deze mutanten, centrioles van het rijpe spermatocyte groeien tot ongeveer ~ 2,4 micrometer in vergelijking met centriolen van controlecellen die maximaal 1,8 urn bereiken.
Figuur 1. Spermatogenese en centrosome Biology. A) Ontwikkeling van stamcellen en Spermatogonia. Alle zaadcellen ontstaan uit stamcellen gevonden op het apicale uiteinde van de testes. Elke Stem Cell asymmetrisch een Stem Cell dat de moeder centrosoom en een stamvader spermatogonium dat de dochter centrosome 31 erft erft vormen. Zoals Spermatogonia vorm, worden ze omringd door 2 cyste cellen, die nog steeds de spermatocyten en Spermatiden omringen hele spermatogenese. Spermatogonia kloof 4 keer tot 16 Spermatogonia, elk met twee centriolen. B) Ontwikkeling van spermatocyten en Meiose produceren. Tijdens spermatocyt ontwikkeling, centriolen dupliceren nog eens vier centriolen georganiseerd in twee paar per cel en 64 centriolen per cyste te genereren. Vroeg tijdens ontwikkeling spermatocyte elk centriole verplaatst naar de plasmamembraan, dokken, en verlengt van een structuur die een primaire cilium 18,32-34 lijkt te vormen. In volwassen spermatocyten, centriole lengte bereikt ~ 1.8 micrometer. De centrosomes spelen een essentiële rol in de meiose. Tijdens de meiose I, de centriole paren die verbonden blijven met de plasmamembraan overgang naar het midden van de cel en maken celmembraan invaginations hun distale punt. De PCM rond de centriolen groeit, nucleates astrale microtubuli, en colocalizes met de spindel pole. Tijdens de overgang naar meiose II, de centriole paar scheidt zodat slechts een centriole wordt presentatiet bij elke spindel pole. C) spermiogenese. Eind meiose II, de eerste ronde spermatide heeft een centriole aan de invaginated plasmamembraan. Een grote ronde mitochondriaal derivaat wordt gevonden in de buurt van de kern en later begint te rekken langs de groeiende axoneme in latere ronde Spermatiden. Tijdens de spermatogenese, de axoneme formulieren en verlengt in het cytoplasma. Voorts wordt een nieuwe centriolar structuur bekend als de PCL (proximale centriole Like) verschijnt naast de reeds bestaande centriole 1. Eind spermatogenese, cellen die een gemeenschappelijke cyste los van elkaar volgroeid beweeglijke zaadcellen worden. De diagrammen van spermatocyt ontwikkeling (B) en spermiogenese (C) tonen slechts een cel van de 16 spermatocyten en 64 Spermatiden, respectievelijk per cyste, en niet de cyste cellen niet af te beelden. Klik hier om groot te bekijkenr figuur.
Figuur 2. De Drosophila Testikels. Overlay van een fase-contrast en GFP-fluorescentie microscoop foto van een hele-mount testis uiting van de pan-centriolar marker Ana-1-GFP. Verschillende oppervlakte die overeenkomt met platen 1-3 van figuur 1 zijn gescheiden door een onderbroken rode lijn A) stamcellen en Spermatogonia, B) en Meiose spermatocyten, C) spermiogenese.
Figuur 3. Tracks Naar Imaging Centrosomes in Drosophila Testikels.
Figuur 4. Centrosome Rek Tijdens Spermatogenese. A) Elke fase toont een fase-contrast afbeelding (links), fluorescentiebeeld (midden), en vergrote beeld van de centrosome (rechts). De fase beeld-contrast toont de bepaalde cel fase op basis van de positie en de morfologie van de cel nucleus, nucleolus, en de mitochondria. Het beeld fluorescentie toont DNA gekleurd met DAPI (blauw). Centrosome beeld toont centrosomes gelabeld door Asterless-GFP (Asl, top beelden) en Ana1-GFP (Ana1, onderste afbeelding). Een witte cirkel wijst op de celmembraan in zowel fase-contrast en fluorescentie beelden. De onderbroken witte cirkels en de grijze cirkel in beeld de fluorescentie markeert de positie van de nucleus en nucleolus, respectievelijk. Gele pijl wijst naar het Y-chromosommige lussen. Rode onderbroken cirkels geven de mitochondriën. Stages 1-6 verwijst naar 29 en podia 13-17 verwijst naar de beschrijving van de mobiele podia in 32. Fase 1: Primaire spermatocyt. Geïdentificeerd als een kleine cel een tip van de testis. Fase 2a: Polar spermatocyt. Geïdentificeerd door de aanwezigheid van mitochondria dop op een zijde van de kern. Fase 3: Apolaire spermatocyt. Geïdentificeerd door zijn relatieve grotere omvang dan de primaire spermatocyt en het ontbreken van een mitochondriën cap. Fase 4: Primaire spermatocyt. Geïdentificeerd door het verschijnen van: All 3 Y-chromosoom lussen. Fase 5: Mature Primaire spermatocyt. Grootste spermatocyte geproduceerd in spermatogenese, die door een verdere stijging kerngrootte. Fase 6: Premeiotic Primaire spermatocyt. Y-chromosoom loops desintegreren en de kern verdwijnt. Etappe 13: Ui Stage spermatide. Rond cel met even grote kern en mitochondriën. Etappe 17: Late spermatide. Geïdentificeerd als een langgerekt spermatide dat een deel van een Bundl blijfte van 64 spermatiden met kernen gevonden in de buurt van de basis van de testes., Kernen zijn iets breder dan volwassen spermatiden gevonden in de zaadblaasjes. Schaalbalken, 10 urn en 1 urn. B) grafiek toont het gemiddelde en standaarddeviatie voor elke fase zoals gemeten door Asterless-GFP (blauw) en Ana1-GFP (groen). In 6e etappe, Asterless-GFP (blauw) en Ana1-GFP (groen) gemiddelden en standaarddeviaties overlappen en alleen Asterless-GFP (blauw) is herkenbaar. Vanaf Stage 13, heeft Asterless-GFP de hele centriole niet versieren en metingen werden niet bepaald (ND).
Figuur 5. Abnormaal lange centriolen in 6e etappe spermatocyten van Aly en kan Mutants. AC) Lichtmicroscopische van hele testes en tl-panel van representatieve centrosome laBeled door Ana1-GFP. Let op de afwijkende vorm van de testes in aly en kunnen mutanten, die voortvloeit uit een gebrek aan spermatiden als gevolg van meiotische arrestatie. D) grafiek toont de gemiddelde, standaarddeviatie en data distributie van centriole lengte in wild-type, aly en kan . Sample nummer voor elk gegevenspunt is tussen haakjes. Schaal bar, 1 micrometer.
Discussion
Bestuderen centrosome biologie in vlieg testes om genetisch gemerkte centrosomal markers is een handige methode voor het beoordelen centrosome functie en activiteit in zowel wild-type en mutant context. Vooral Spoor A is geschikt voor snelle screening van centrosomal afwijkingen zoals misvorming, misegregation, instabiliteit of abnormale lengte in een poging om nieuwe mutanten te identificeren. Bovendien spermatide cilia in levende preparaten blijven beweeglijke ongeveer 15 minuten na dissectie en het gebruik van levende testes Volg A maakt ook sperma motiliteit zij gemakkelijk aangepakt. Aangezien de activiteit van sperma beweeglijk cilia direct gerelateerd aan centrosome functie kunnen assays worden uitgevoerd om de effecten van verschillende mutaties op centrosomal ciliaire functie te bepalen. Spoor B kan voor meer specifieke waarnemingen vooral wanneer statistische gegevens vereist zoals voor het tellen van het aantal centrioles per cel en of het aantal cellen per cyste. Track C is het meest useful voor gedetailleerde observaties die kleuring nodig met antilichamen. Voorbeelden zijn kenmerken van een bepaald celtype zoals stamcellen, kleuring van een eiwit dat geen een beschikbaar tag zoals geacetyleerde tubuline, of de afwezigheid of mislocalization van een eiwit in een mutant verifiëren.
Bij beeldvorming centrosomes en-centrosome gerelateerde structuren, met behulp van genetisch-gelabelde markers dan antilichamen is niet alleen experimenteel eenvoudiger, maar biedt ook meer robuuste en reproduceerbare resultaten. Daarom is het gebruik van genetisch-gelabeld centrosomal eiwitten is een betrouwbare aanpak voor mechanistische en kwantitatieve analyses die een grote dataset nodig. Zo is het gebruik van genetisch gelabeld centrosomal merkers bijzonder waardevol voor de kwantificering van centriole lengte zijn. Een dergelijke analyse heeft aangetoond dat verschillende mutaties kunnen worden ingedeeld in twee categorieën op basis van de variabiliteit in centriole lengte. Een categorie omvat mutaties die change centriole lengte, maar beïnvloeden de standaardafwijking 1 en de andere categorie omvat mutaties die zowel centriole lengte en de standaardafwijking lengte 11 beïnvloeden. Dergelijke kwantitatieve gegevens kunnen nuttig inzicht geven in de functie van bepaalde centrosomal genen. Centrosomal mutanten die defect centriole lengte vertonen een toename in standaard afwijking kan worden veroorzaakt door destabilisatie van centriolar structuur. Echter defect centriole length met een normale standaardfout aan dat de mutatie niet structureel destabiliseren centriole en is waarschijnlijk te wijten aan een verandering in regulatiemechanisme beheersen centriole lengte. Door inconsistenties in immunokleuring, kwantitatieve analyses moeilijk met behulp van antilichaam markers alleen.
Centrosome is een grote, complexe eiwitachtige structuur en veel van de eiwitten zijn alleen te vinden in het interieur. Het gebruik van genetisch-tagged centrosomalmarkers eerder de antilichamen maakt het mogelijk om de interne onderdelen van centrosome waarvan epitopen anders ontoegankelijk antilichaam markers consequent label. Bijvoorbeeld, lokalisatie studies BLD10 gebruik van antilichamen vindt het eiwit worden verrijkt op de distale en proximale einden van de centriole 13, terwijl BLD10-GFP vertoont een meer uniforme verdeling 1. Het is echter ook belangrijk om het niveau van expressie van een bepaald genetisch gemerkt eiwit beschouwen, aangezien dit eiwit verdeling beïnvloeden. Lokalisatie van Sas-4-GFP en SAS-6-GFP expressie onder hun endogene is beperkt tot het proximale uiteinde van de centriole 1,16,35 Anderzijds, Sas-4-GFP en SAS-6-GFP expressie gebracht onder de sterke ubiquitine promoter gelokaliseerd over de gehele lengte van de centriole 12,14. Een andere belangrijke overweging is het effect van de genetische tag op eiwitfunctie. Een analyse of genetisch gemerkte eiwitten zijn functioneel kan tested door de invoering van transgeen eiwit in een mutant achtergrond en onderzoeken of het transgene eiwit redt het mutante fenotype.
Fixatie van Drosophila testes kan worden uitgevoerd met verschillende chemische fixatieven. We beschrijven hier fixatie zowel formaldehyde (spoor B) en methanol-aceton (Track C). Echter, zowel fixatief elkaar gebruikt en aangezien verschillende fixatieven kunnen chemisch verstoren natief antilichaam epitopen, moet de selectie van de geschikte fixatief immunokleuring proefondervindelijk bepaald. De volgende fixatieven en incubatie-omstandigheden worden gebruikt zijn: 3.7% formaldehyde, 5 min bij kamertemperatuur, methanol, 15 minuten bij -20 ° C, aceton, 10 minuten bij -20 ° C, methanol, 15 minuten bij -20 ° C. gevolgd door aceton, 30 seconden bij -20 ° C, ethanol, 20 min bij -20 ° C. Hoewel fixatie met aceton, methanol, ethanol en geen langere permeabilisatie stap voor immunokleuring, fixatie wi vereisene formaldehyde moet worden gevolgd door een 1 uur incubatie in PBST-B bij kamertemperatuur celmembranen doorlaatbaar en laat antilichaam toegang tot intracellulaire epitopen. Bovendien zijn bepaalde fixeermiddelen zijn meer geschikt voor specifieke antigenen. Bijvoorbeeld, formaldehyde functioneert voor bevestiging van kleine eiwitten, terwijl methanol en aceton zijn goed geschikt voor de fixatie van grote moleculaire complexen 36.
Immunokleuring van Drosophila testes is eerder beschreven voor het waarnemen chromatine structuren en de microtubuli cytoskelet 29,37. Here (Track C), is de procedure geoptimaliseerd voor de analyse van centrosomal structuren die genetisch gemerkte eiwitten. Wij bieden een uitgebreide beschrijving van deze procedure aan personen die geen ervaring heeft in Drosophila testes begeleiden. Deze procedure omvat ook wijzigingen in het behoud en de morfologie van de testes, zoals het verbeteren door siliconized coverslips en positief geladen glas microscoop dia's.
Disclosures
Gratis toegang tot deze publicatie werd ondersteund door Leica Microsystems.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een subsidie (R01GM098394) van NIH en Nationale Instituut van Algemene Medische Wetenschappen evenals subsidie 1.121.176 van National Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Positively Charged Slides | AZER Scientific | EMS200A+ | |
| Feather Microscalpel | Electron Microscopy Sciences | 72045-30 | |
| 37% Formaldehyde or Paraformaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Boston Bioproducts | BM-220 | |
| 18x18 mm coverslips number 1.5 | VWR | 48366 205 | |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100 ml | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| Acetone | Fisher Scientific | A949-1 | |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T9284-100ML | |
| BSA | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| RNAse A | 5 prime | 2900142 | |
| Filter paper | Whatman | 1001-055 | |
| Glass engraver | Dremel | 290-01 | |
| TCS SP5 confocal microscope | Leica | ||
| Mounting Media | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
| Immuno Stain Moisture Chamber, Black | Electron Microscopy Sciences | 62010-37 | |
| Glass Coplin Staining Jar, Screw Cap | Electron Microscopy Sciences | 70315 |
References
- Blachon, S., et al. A proximal centriole-like structure is present in Drosophila spermatids and can serve as a model to study centriole duplication. Genetics. 182, 133-144 (2009).
- Hennig, W. Spermatogenesis in Drosophila. The International journal of developmental biology. 40, 167-176 (1996).
- Fabian, L., Brill, J. A. Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages. Spermatogenesis. 2, 197-212 (2012).
- White-Cooper, H. Molecular mechanisms of gene regulation during Drosophila spermatogenesis. Reproduction. 139, 11-21 (2010).
- Davies, E. L., Fuller, M. T. Regulation of self-renewal and differentiation in adult stem cell lineages: lessons from the Drosophila male germ line. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 73, 137-145 (2008).
- Belote, J. M., Zhong, L. Duplicated proteasome subunit genes in Drosophila and their roles in spermatogenesis. Heredity. 103, 23-31 (2009).
- Xiao, X., Yang, W. X. Actin-based dynamics during spermatogenesis and its significance. Journal of Zhejiang University. Science. B. 8, 498-506 (2007).
- Hennig, W. Chromosomal proteins in the spermatogenesis of Drosophila. Chromosoma. 111, 489-494 (2003).
- Wakimoto, B. T. Doubling the rewards: testis ESTs for Drosophila gene discovery and spermatogenesis expression profile analysis. Genome research. 10, 1841-1842 (2000).
- Avidor-Reiss, T., Gopalakrishnan, J. Building a centriole. Curr Opin Cell Biol. , (2012).
- Blachon, S., et al. Drosophila asterless and vertebrate Cep152 Are orthologs essential for centriole duplication. Genetics. 180, 2081-2094 (2008).
- Basto, R., et al. Flies without Centrioles. Cell. 125, 1375-1386 (2006).
- Mottier-Pavie, V., Megraw, T. L. Drosophila bld10 is a centriolar protein that regulates centriole, basal body, and motile cilium assembly. Mol Biol Cell. 20, 2605-2614 (2009).
- Rodrigues-Martins, A., et al. DSAS-6 Organizes a Tube-like Centriole Precursor, and Its Absence Suggests Modularity in Centriole Assembly. Curr Biol. 17, 1465-1472 (2007).
- Stevens, N. R., Dobbelaere, J., Brunk, K., Franz, A., Raff, J. W. Drosophila Ana2 is a conserved centriole duplication factor. J Cell Biol. 188, 313-323 (2010).
- Gopalakrishnan, J., et al. Sas-4 provides a scaffold for cytoplasmic complexes and tethers them in a centrosome. Nat Commun. 2, 359 (2011).
- Gopalakrishnan, J., et al. Tubulin nucleotide status controls Sas-4-dependent pericentriolar material recruitment. Nat Cell Biol. 14, 865-873 (2012).
- Riparbelli, M. G., Callaini, G., Megraw, T. L. Assembly and persistence of primary cilia in dividing Drosophila spermatocytes. Dev Cell. 23, 425-432 (2012).
- Maines, J. Z., Wasserman, S. A. Post-transcriptional regulation of the meiotic Cdc25 protein Twine by the Dazl orthologue Boule. Nat Cell Biol. 1, 171-174 (1999).
- Herrmann, S., Amorim, I., Sunkel, C. E. The POLO kinase is required at multiple stages during spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Chromosoma. 107, 440-451 (1998).
- Yamashita, Y. M., Jones, D. L., Fuller, M. T. Orientation of asymmetric stem cell division by the APC tumor suppressor and centrosome. Science. 301, 1547-1550 (2003).
- Dix, C. I., Raff, J. W. Drosophila Spd-2 Recruits PCM to the Sperm Centriole, but Is Dispensable for Centriole Duplication. Curr Biol. , (2007).
- Stevens, N. R., Dobbelaere, J., Wainman, A., Gergely, F., Raff, J. W. Ana3 is a conserved protein required for the structural integrity of centrioles and basal bodies. J Cell Biol. 187, 355-363 (2009).
- Giansanti, M. G., Bucciarelli, E., Bonaccorsi, S., Gatti, M. Drosophila SPD-2 Is an Essential Centriole Component Required for PCM Recruitment and Astral-Microtubule Nucleation. Curr Biol. , (2008).
- Januschke, J., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Drosophila neuroblasts retain the daughter centrosome. Nat Commun. 2, 243 (2011).
- Cheng, J., et al. Centrosome misorientation reduces stem cell division during ageing. Nature. 456, 599-604 (2008).
- Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster testes. J. Vis. Exp. , e2641 (2011).
- Fuller, M. T. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-174 (1993).
- Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis. J Cell Sci. . 107 (Pt. 12), 3521-3534 (1994).
- White-Cooper, H., Schafer, M. A., Alphey, L. S., Fuller, M. T. Transcriptional and post-transcriptional control mechanisms coordinate the onset of spermatid differentiation with meiosis I in Drosophila. Development. 125, 125-134 (1998).
- Yamashita, Y. M., Mahowald, A. P., Perlin, J. R., Fuller, M. T. Asymmetric inheritance of mother versus daughter centrosome in stem cell division. Science. 315, 518-521 (2007).
- Tates, A. D. Cytodifferentiation during Spermatogenesis in Drosophila melanogaster: An Electron Microscope Study. , Rijksuniversiteit de Leiden. Leiden, Netherlands. (1971).
- Baker, J. D., Adhikarakunnathu, S., Kernan, M. J. Mechanosensory-defective, male-sterile unc mutants identify a novel basal body protein required for ciliogenesis in Drosophila. Development. 131, 3411-3422 (2004).
- Avidor-Reiss, T., Gopalakrishnan, J., Blachon, S., Polyanovsky, A. The Centrosome: Cell and Molecular Mechanisms of Functions and Dysfunctions in Disease. Schatten, H. , Humana Press. (2012).
- Gopalakrishnan, J., et al. Self-assembling SAS-6 multimer is a core centriole building block. J Biol Chem. 285, 8759-8770 (2010).
- Hassell, J., Hand, A. R. Tissue fixation with diimidoesters as an alternative to aldehydes. I. Comparison of cross-linking and ultrastructure obtained with dimethylsuberimidate and glutaraldehyde. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 22, 223-229 (1974).
- Pisano, C., Bonaccorsi, S., Gatti, M. The kl-3 loop of the Y chromosome of Drosophila melanogaster binds a tektin-like protein. Genetics. 133, 569-579 (1993).
