Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

फ्लाई testes में इमेजिंग centrosomes

Published: September 20, 2013 doi: 10.3791/50938
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Toledo

Summary

ड्रोसोफिला शुक्राणुजनन दौरान centrosomal प्रोटीन की इमेजिंग तारककाय जीव विज्ञान के लिए महत्वपूर्ण नए प्रोटीन की पहचान करने के साथ ही इस प्रक्रिया में जाना जाता खिलाड़ियों का विशेष समारोह को स्पष्ट करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है.

Abstract

Centrosomes जिसका संरचना और समारोह सेल चक्र और सेल भेदभाव भर में नाटकीय रूप से बदल microtubule आधारित organelles संरक्षित कर रहे हैं. Centrosomes पिंजरे का बँटवारा दौरान कोशिका विभाजन अक्ष निर्धारित करने के लिए और अंतरावस्था दौरान सिलिया नाभिक के लिए आवश्यक हैं. इन गतिशील परिवर्तन मध्यस्थता कि प्रोटीन की पहचान केवल आंशिक रूप से जाना जाता है, और इन प्रक्रियाओं में शामिल किया गया है कि प्रोटीन के कई के समारोह अभी भी अल्पविकसित है. हाल ही में काम ड्रोसोफिला शुक्राणुजनन तारककाय से संबंधित प्रक्रियाओं में जाना जाता खिलाड़ियों का विशेष समारोह में जानकारी हासिल करने के लिए नए तारककाय समारोह और गठन के लिए महत्वपूर्ण प्रोटीन के रूप में अच्छी तरह से पहचान करने के लिए एक शक्तिशाली प्रणाली प्रदान करता है कि दिखाया गया है. ड्रोसोफिला एक स्थापित आनुवंशिक मॉडल जीव जहां म्यूटेंट में है centrosomal जीन आसानी से प्राप्त की है और आसानी से विश्लेषण किया जा सकता है. इसके अलावा, हाल ही में प्रकाश माइक्रोस्कोपी की संवेदनशीलता और संकल्प के क्षेत्र में प्रगति औरमजबूत आनुवंशिक रूप में चिह्नित centrosomal मार्करों के विकास centrosomes अध्ययन करने के लिए एक सरल और सुलभ मॉडल प्रणाली के रूप में ड्रोसोफिला वृषण उपयोग करने की क्षमता को बदल दिया है. इस पत्र में नई centrosomal म्यूटेंट के लिए आनुवंशिक स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए और नए जीनों की पहचान की विशेष समारोह में जानकारी हासिल करने के लिए आनुवंशिक रूप में चिह्नित centrosomal मार्कर के उपयोग का वर्णन करता है.

Introduction

ड्रोसोफिला वृषण सेलुलर और विकासात्मक प्रक्रियाओं की एक किस्म का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त अंग व्यवस्था कर रहे हैं और साल 1-9 से अधिक बड़े पैमाने पर समीक्षा की गई है. इस पांडुलिपि तारककाय, एक संरक्षित सेलुलर organelle अध्ययन करने के लिए ड्रोसोफिला वृषण के उपयोग पर केंद्रित है. अन्य प्रणालियों के रूप में, पिंजरे का बँटवारा, अर्धसूत्रीविभाजन, और ciliogenesis 10 में ड्रोसोफिला वृषण समारोह के तारककाय. Centrosomes रूप pericentriolar सामग्री (पीसीएम) में संदर्भित एक जटिल प्रोटीन नेटवर्क से घिरा centrioles के रूप में जाना microtubule आधारित संरचनाओं की एक जोड़ी से बना रहे हैं. तारककेंद्रक जोड़ी एक पुराने माँ तारककेंद्रक और एक छोटी बेटी तारककेंद्रक के शामिल है. सेल पिंजरे का बँटवारा करने की दिशा में प्रगति, दोनों centrioles, अलग डुप्लिकेट, और अंत में दो अलग centrosomes के लिए फार्म पीसीएम की एक बड़ी राशि प्राप्त. मूल मां तारककेंद्रक युक्त तारककाय मां तारककाय और centr के रूप में जाना जाता हैमूल बेटी तारककेंद्रक युक्त osome बेटी तारककाय के रूप में जाना जाता है.

ड्रोसोफिला वृषण कारणों की एक किस्म के लिए फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा तारककाय जीव विज्ञान के आणविक आधार के अध्ययन के लिए आदर्श होते हैं.

  1. वृषण में तारककाय जीव विज्ञान के लिए आवश्यक हैं कि ड्रोसोफिला प्रोटीन का सबसे 1,11-14 testes मनुष्य और अन्य प्रजातियों में तारककाय जीव विज्ञान के लिए प्रासंगिक अंतर्दृष्टि ड्रोसोफिला में तारककाय अध्ययन करके प्राप्त किया जा सकता है, सुझाव है कि यूकैर्योसाइटों बीच संरक्षित कर रहे हैं.
  2. ड्रोसोफिला में उत्परिवर्ती विश्लेषण प्रदर्शन कई अन्य मॉडलों के विपरीत, ड्रोसोफिला में centrosomal म्यूटेशन इस प्रकार तारककाय समारोह का शास्त्रीय आनुवांशिक विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, घातक भ्रूण नहीं कर रहे हैं, के बाद से एक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है. ड्रोसोफिला की इस अनूठी विशेषता भ्रूण विकास के महत्वपूर्ण चरणों के दौरान बनी रहती है कि मातृ योगदान की उपस्थिति की वजह से हैpment. 1,11-14. इस प्रकार, एक कर सकते हैं एक) पूरी तरह से तारककाय गठन को खत्म करने और ख) (मातृ योगदान कम होने के पश्चात एक उत्परिवर्ती संदर्भ में मातृ योगदान से जल्दी भ्रूण में गठन किया गया था कि एक सामान्य तारककाय के भाग्य का अध्ययन है कि अध्ययन म्यूटेशनों विधि का सिद्धांत ) 11 में वर्णित है.
  3. तारककाय लेबल है कि आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट टैग के साथ कार्यात्मक transgenes उपलब्ध हैं. इन लाइनों के कई मजबूत overexpression को रोकने के क्रम में transgene की प्रतिलेखन ड्राइव करने के लिए प्रोटीन की अपनी प्रमोटर का उपयोग करें. प्रोटीन की overexpression अक्सर तारककाय समारोह 1,11 के विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप कि कलाकृतियों में यह परिणाम है क्योंकि यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है.
  4. तारककेंद्रक और तारककाय इस प्रकार इमेजिंग द्वारा तारककाय का तेजी से और आसान विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, ड्रोसोफिला शुक्राणुजनन भर में विशिष्ट रूप से लंबे होते हैं.
  5. शुक्राणुजनन और तारककाय बी में लगातार कदमiology शुक्राणु स्टेम कोशिकाओं की centrosomes साथ वृषण नोक पर शुरू करने और परिपक्व शुक्राणु कोशिकाओं में कम तारककाय आकार और गतिविधि (आंकड़े 1 और 2) के साथ वृषण के तल पर समाप्त, वृषण साथ कालक्रम के अनुसार व्यवस्थित होते हैं. यह शुक्राणु विकास के विभिन्न चरणों के दौरान तारककाय समारोह की आसानी से पहचान और विश्लेषण के लिए अनुमति देता है.
  6. Testes आसानी पुरुष लार्वा, pupae, और वयस्कों के 27 से विच्छेदित कर रहे हैं.
  7. शुक्राणुजनन के दौरान, तारककाय और उसके centrioles कई compositional, संरचनात्मक और पिंजरे का बँटवारा, अर्धसूत्रीविभाजन, और पलक गठन में कार्य करने के लिए कार्यात्मक राज्यों के माध्यम से आगे बढ़ना. इन प्रक्रियाओं के दौरान सेल के विशिष्ट भागों को तारककाय assembles, डुप्लिकेट, migrates, एंकर, परिपक्व विभाजित करती है और एक पलक बनाता है. इसके अलावा, परिपक्व spermatid की तारककेंद्रक PCL 1 नाम के एक centriolar अग्रदूत को जन्म देता है. इसके अलावा परिपक्व spermatid में, तारककाय एक प्रक्रिया सी undergoesयह कई पीसीएम के घटकों और तारककेंद्रक (आंकड़े 1 और 2) खो देता है जिससे तारककाय कमी alled. इस प्रकार, वृषण में पढ़ाई एक ऐसी स्टेम कोशिकाओं में तारककाय प्रतिधारण, तारककेंद्रक दोहराव, तारककेंद्रक स्थिरता, तारककेंद्रक बढ़ाव, तारककेंद्रक जुदाई और अलगाव, पीसीएम भर्ती, ciliogenesis, PCL गठन, तारककाय कमी, और के रूप में तारककाय जीवन के कई पहलुओं को संबोधित करने की अनुमति दूसरों के बीच सूक्ष्म microtubule न्यूक्लिएशन.
  8. अंत में, तारककाय जीव विज्ञान की पढ़ाई यह बायोलॉजिकल अध्ययन के लिए एक पसंदीदा मॉडल जीव बना दिया है कि ड्रोसोफिला के अन्य प्रसिद्ध विशेषताओं द्वारा सहायता प्राप्त कर रहे हैं. ये एक छोटी पीढ़ी समय, जेनेटिक्स में आसानी, साथ ही बेतरतीब और साइट निर्देशित mutagenesis शामिल हैं.

साथ में, ड्रोसोफिला वृषण के ऊपर कहा विशेषताओं तारककाय, आसान तेजी से, और विस्तृत इमेजिंग द्वारा अध्ययन किया जा सकता है, जहां एक मॉडल प्रदान करता है. वर्णित तकनीकइस पत्र में तारककेंद्रक गठन 11, तारककेंद्रक दोहराव 15, पीसीएम भर्ती 16, तारककाय विनियमन 17, और ciliogenesis 18 सहित तारककाय जीव विज्ञान के कई पहलुओं की जांच करने के लिए लागू किया गया है. इन तकनीकों में भी इस तरह के meiotic विनियमन 19, धुरा विधानसभा 20, और कई अन्य लोगों के अलावा विषम स्टेम कोशिका विभाजन के 21 में तारककाय गतिविधि के रूप में जीव विज्ञान के अन्य क्षेत्रों में तारककाय अध्ययन करने के लिए लागू किया गया है.

आनुवंशिक रूप से टैग centrosomal प्रोटीन व्यक्त कि मक्खियों प्राप्त करने और पुरुष लार्वा, pupae, या वयस्क मक्खियों से वृषण अलग से तारककाय शुरू में वृषण की इमेजिंग. इन मक्खियों कई अनुसंधान समूहों से उपलब्ध हैं 1,11,15,22-25. लार्वा वृषण पूर्व अर्धसूत्रीविभाजन को शुक्राणुजनन के सभी चरणों के होते हैं और प्यूपा या वयस्क में घातक हैं कि उत्परिवर्तन का विश्लेषण करते समय उपयोगी होते हैं. बहरहाल, देर से पोटा संबंधी या युवा Aduलेफ्टिनेंट वृषण सबसे मजबूत कर रहे हैं और शुक्राणुजनन के सभी पूर्व और बाद के meiotic चरणों के होते हैं, जिससे विश्लेषण के लिए उन्हें बेहतर बना रही है. शुक्राणु कोशिकाओं की संख्या मक्खी उम्र के रूप में कम हो जाती है के बाद से, वयस्क वृषण का उपयोग भी उम्र बढ़ने. 26 के संदर्भ में तारककाय के अध्ययन के लिए उपयुक्त है. वयस्क मक्खियों से वृषण अलगाव की विधि में पहले 27 में वर्णित किया गया है.

Centrosomes और ड्रोसोफिला वृषण में उनके कार्य की इमेजिंग यहाँ (चित्रा 3) प्रस्तुत कर रहे हैं कि तीन संबंधित पटरियों के माध्यम से हासिल किया जा सकता है. ट्रैक सबसे उपयुक्त है, जिनमें से चयन अन्वेषक संबोधित कर रहा है प्रश्न की प्रकृति पर निर्भर है.

ट्रैक एक लाइव वृषण की इमेजिंग शामिल है. यह तीन पटरियों के सबसे तेजी से है लेकिन नमूनों संरक्षित करने और immunostaining जब आवश्यकता नहीं है की जरूरत नहीं है जब केवल लागू किया जा सकता है. ट्रैक एक में, वृषण स्लाइड पर (अक्षुण्ण, छेदा या कटौती) बढ़ रहे हैंऔर ध्यान से आसानी से पहचाना कोशिकाओं की एक परत के रूप में एक coverslip के तहत कुचल. कोशिकाओं तो चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी दोनों का उपयोग कर कल्पना कर रहे हैं. यह प्रेषित रोशनी के अन्य रूपों के साथ दिखाई नहीं देता है और इस प्रकार शुक्राणु विकास 28,29 के विभिन्न चरणों की जल्दी पहचान के लिए अनुमति देता है कि सेलुलर जानकारी से पता चलता है क्योंकि चरण विपरीत का उपयोग ड्रोसोफिला वृषण के विश्लेषण के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है. हालांकि, ट्रैक एक दो मुख्य नुकसान है. वृषण उठी हैं एक बार पहले, कोशिकाओं की रूपात्मक अखंडता अक्सर समझौता किया है. दूसरा, unfixed कोशिकाओं कभी कभी मुश्किल एक निर्दिष्ट क्षेत्र के भीतर कई confocal परतों की इमेजिंग, जिससे नमूना भीतर कदम. विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं का विश्लेषण को बढ़ावा देने के लिए, वृषण छेदा या वृषण ruptures ऐसे coverslip न्यूनतम तहत squashing ब्याज की सेल प्रकार की आकारिकी प्रभावित करता है कि जिस तरह से निर्देशित करने के क्रम में कटौती हो सकती है.

ट्रैक बी वृषण की रासायनिक निर्धारण शामिल है. इस ट्रैक नमूना तैयार करने के लिए समय की एक मध्यवर्ती राशि की आवश्यकता है और तय नमूनों बाद में विश्लेषण के लिए बचाया जा सकता है कि लाभ है. इसके अलावा, निर्धारण इमेजिंग के दौरान नमूना के आंदोलन को कम करने, सेलुलर संरचनाओं और अधिक कठोर बनाने के लिए कार्य करता है. हालांकि, चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी पहचान मुश्किल शुक्राणु विकास के कुछ चरणों बनाने, रासायनिक निर्धारण के बाद बहुत कम जानकारीपूर्ण हो जाता है.

ट्रैक सी है समय लेने वाला सबसे अधिक है, लेकिन उचित आनुवंशिकी टैग के साथ उपलब्ध नहीं हैं कि प्रोटीन के दृश्य के लिए अनुमति देता है, सेलुलर संरचनाओं तय की और immunostained रहे हैं कि अतिरिक्त लाभ है. ड्रोसोफिला वृषण में centrosomes और तारककाय से संबंधित संरचनाओं immunostaining के लिए उपलब्ध कई एंटीबॉडी दोनों वाणिज्यिक और विभिन्न अनुसंधान समूहों से कर रहे हैं.

Protocol

1. लाइव वृषण की ट्रैक ए तैयारी

  1. 8.0 छ NaCl, 0.2 ग्राम KCl, 1.44 जी 2 4 HPO, 0.24 ग्राम के.एच. 2 आसुत पानी की 800 मिलीलीटर में 4 पीओ ना भंग करके पीबीएस तैयार है और 7.4 पीएच को समायोजित करें. 1 एल मात्रा लाओ और autoclaving द्वारा बाँझ.
  2. पहले से वर्णित के रूप में 27 वृषण अलग.
  3. पीबीएस में 1 ग्राम / मिलीलीटर के लिए 1 मिलीग्राम / एमएल शेयर गिराए द्वारा DAPI धुंधला बफर तैयार करें. -20 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश और दुकान से ट्यूब की रक्षा के लिए एल्यूमीनियम पन्नी का प्रयोग करें
  4. वृषण अलग करने के बाद, 10 मिनट के लिए एक सकारात्मक आरोप लगाया गिलास खुर्दबीन स्लाइड के शीर्ष पर DAPI धुंधला बफर के 6 μl में नमूना विसर्जित कर दिया. Testes नमूना के लिए आसान हेरफेर के लिए अनुमति देता है, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सकारात्मक आरोप लगाया स्लाइड्स के लिए अच्छी तरह से पालन करें. सकारात्मक आरोप लगाया स्लाइड्स covalently कांच की सतह के लिए एक स्थिर सकारात्मक आरोप प्रदान करने के लिए संशोधित कर रहे हैं. Polylysine कोटिंग की तरह, इस वृषण वाई की बातचीत को बढ़ावा देता हैस्लाइड की सतह वें.
  5. पीबीएस के 6 μl के साथ दो बार धुंधला बफर जगह से अतिरिक्त DAPI धो लें. प्रत्येक धोने कदम के बाद बफर दूर बाती को फिल्टर पेपर के एक टुकड़े का उपयोग करें. गलती से प्रत्येक धोने के दौरान बफर के साथ वृषण को दूर नहीं करने के रूप में सावधानी बरतें.
  6. नमूना पीबीएस के 6 μl जोड़ें. इस्तेमाल किया बफर की राशि coverslip के आकार के लिए समायोजित किया जाना चाहिए. इस प्रोटोकॉल में प्रदान की मात्रा में एक 18 x 18 मिमी coverslip के लिए कर रहे हैं. वैकल्पिक: यह ब्याज की सेल प्रकार के सापेक्ष स्थान के पास वृषण बेध की सलाह दी जाती है. इस जिससे उनकी संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखने, squashing चरण के दौरान इन कोशिकाओं पर न्यूनतम दबाव है कि यह सुनिश्चित करेंगे. वृषण का भेदी एक तेज, स्वच्छ स्केलपेल का उपयोग किया जा सकता है.
  7. ध्यान से नमूना के शीर्ष पर एक coverslip जगह.
  8. बफर लाइव नमूना से लुप्त हो जाना नहीं है यह सुनिश्चित करने के लिए स्पष्ट नेल पॉलिश का उपयोग coverslip के किनारों को सील करते हुए Imउम्र बढ़ने.
  9. स्लाइड पर नमूना लगाने में आसानी के लिए वृषण की स्थिति निर्धारित करते हैं और इमेजिंग के लिए आगे बढ़ने के लिए एक मार्कर का उपयोग करें.
  10. पीबीएस के 6 μl के साथ दो बार बफर जगह से अतिरिक्त DAPI धुंधला बफर धो लें. प्रत्येक धोने कदम के बाद बफर दूर बाती को फिल्टर पेपर के एक टुकड़े का उपयोग करें. गलती से प्रत्येक धोने के दौरान बफर के साथ नमूना निकालने के लिए नहीं सावधान रहना.

2. फिक्स्ड वृषण की ट्रैक बी तैयारी

  1. 1x पीबीएस में 3.7% formaldehyde के अंतिम एकाग्रता के लिए पीबीएस में 37% formaldehyde के शेयर समाधान गिराए द्वारा फिक्स बफर तैयार
  2. पीबीएस में 1 ग्राम / मिलीलीटर के लिए 1 मिलीग्राम / एमएल DAPI शेयर गिराए द्वारा DAPI धुंधला बफर तैयार करें.
  3. एक सकारात्मक आरोप लगाया गिलास खुर्दबीन स्लाइड के शीर्ष पर पीबीएस की एक 6 μl ड्रॉप में वृषण विसर्जित कर दिया.
  4. मैन्युअल एक रैखिक फैशन में या के रूप में अन्यथा वरीय वृषण पूरबी.
  5. पीबीएस दूर बाती और फिक्स की 6 μl के साथ इसे बदलने के लिए फिल्टर पेपर के एक टुकड़े का उपयोग5 मिनट के लिए बफर.
  6. फिक्स बफर दूर बाती और 10 मिनट के लिए DAPI धुंधला बफर के 6 μl में नमूना विसर्जित करने के लिए फिल्टर पेपर के एक टुकड़े का उपयोग करें.
  7. ध्यान से नमूना के शीर्ष पर एक 18 x 18 मिमी coverslip जगह.
  8. इमेजिंग जबकि बफर नमूना से लुप्त हो जाना नहीं है यह सुनिश्चित करने के लिए स्पष्ट नेल पॉलिश का उपयोग coverslip के किनारों को सील.
  9. स्लाइड पर नमूना लगाने में आसानी के लिए वृषण की स्थिति निर्धारित करते हैं और इमेजिंग के लिए आगे बढ़ने के लिए एक मार्कर का उपयोग करें.

3. Immunostained वृषण की ट्रैक सी. तैयारी

Coverslip siliconization: siliconizing समाधान युक्त एक छोटी सी ट्रे में एकाधिक 18 x 18 मिमी coverslips विसर्जित कर दिया और एक धूआं हुड के नीचे कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए सेते हैं. Coverslips पूरी तरह से उजागर कर रहे हैं और एक दूसरे के ऊपर खड़ी नहीं कर रहे हैं सुनिश्चित करें.

  1. Siliconized coverslip पर पीबीएस के 5 μl ड्रॉप में नमूना रखें. पूरबीवृषण वांछित और एक तेज स्केलपेल का उपयोग वृषण पियर्स के रूप में. धीरे पीबीएस समान रूप से coverslip और स्लाइड के बीच छितरी बनने के लिए अनुमति, coverslip पर एक सकारात्मक आरोप लगाया गिलास खुर्दबीन स्लाइड जगह. Coverslip और स्लाइड के बीच अतिरिक्त बफर दूर बाती को फिल्टर पेपर के एक छोटे से टुकड़े का उपयोग करें. बफर फिल्टर पेपर से हटा दिया जाता है, दबाव में वृद्धि वृषण स्क्वैश जाएगा. कुछ प्रोटोकॉल के पाठ्यक्रम पर खो दिया है या क्षतिग्रस्त हो सकता है के रूप में कई नमूनों, एक साथ तैयार किया जाना चाहिए. नमूनों के विभिन्न प्रकार के एक साथ तैयार हो जाएगा, तो एक गिलास उकेरक स्लाइड लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
    1. 1 70% इथेनॉल में 1 मिनट प्रत्येक के लिए 3x द्वारा पीछा पानी में मिनट प्रत्येक,, और पानी में 1 मिनट के लिए एक अंतिम धोने के लिए coverslips 3x धो लें. एक धूआं हुड के नीचे हवा शुष्क siliconized coverslips की अनुमति दें.
  2. तरल नाइट्रोजन में स्लाइड ड्रॉप और नमूना 5-10 मिनट के लिए फ्रीज करने के लिए अनुमति देते हैं.
  3. एल से स्लाइड्स निकालेंएक बड़े संदंश का उपयोग नाइट्रोजन iquid. जल्दी coverslip दूर करने के लिए एक छुरी का प्रयोग करें. नमूना स्लाइड पर रहना चाहिए. स्लाइड के साथ coverslip फिसलने से इस प्रक्रिया के दौरान नमूना धब्बा नहीं सावधान रहो.
  4. 15 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर एक गिलास Coplin धुंधला जार में prechilled मेथनॉल में स्लाइड्स सेते हैं.
  5. 30 सेकंड के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर prechilled एसीटोन युक्त एक गिलास Coplin धुंधला जार करने के लिए स्लाइड स्थानांतरण.
  6. एक गिलास Coplin धुंधला जार का उपयोग कर कमरे के तापमान पर पीबीएस में 1 मिनट के लिए स्लाइड धो लें.
  7. 0.1% ट्राइटन-X100 और 1% गोजातीय सीरम अंडे की सफ़ेदी (बीएसए) के साथ पीबीएस सप्लीमेंट द्वारा PBST बी तैयार करें. (कदम 3.14 से) माध्यमिक एंटीबॉडी के रूप में एक ही मेजबान प्रजातियों से 5% सामान्य सीरम बाध्यकारी अविशिष्ट माध्यमिक एंटीबॉडी से उत्पादित पृष्ठभूमि शोर को कम करने के बजाय बीएसए का इस्तेमाल किया जा सकता है.
  8. अविशिष्ट साइटों को ब्लॉक करने के लिए एक गिलास Coplin धुंधला जार में PBST बी में 10 मिनट के लिए स्लाइड सेते हैं.
  9. के कुओं भरेंपानी से नमी चैंबर. कक्ष के अंदर आर्द्रता ऊष्मायन चरणों के दौरान नमूना से एंटीबॉडी समाधान के वाष्पीकरण कम कर देंगे.
  10. 100 माइक्रोग्राम / एमएल RNase ए RNase एक नमूना में शाही सेना degrades और भी कांच की सतह के लिए दृढ़ता से अवशोषित द्वारा एक अतिरिक्त अवरुद्ध एजेंट के रूप में कार्य करता है के साथ PBST बी सप्लीमेंट द्वारा PBST -बी.आर. तैयार करें.
    1. समान रूप से एंटीबॉडी समाधान फैला है और वाष्पन से एंटीबॉडी समाधान की रक्षा के लिए नमूना के शीर्ष पर Parafilm के एक लगभग 1x1 सेमी टुकड़ा रखें. नमी चैम्बर बंद और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी में नमूना सेते हैं.
  11. PBST बी से स्लाइड्स निकालें. नमूना ही सुखाने के लिए नहीं सावधानी का उपयोग कर, नमूना स्लाइड के आसपास के क्षेत्र सूखे के लिए फिल्टर पेपर के एक टुकड़े का उपयोग करें. अंत में, नमूना सामना करना पड़ के साथ नमी कक्ष में स्लाइड जगह
  12. धीरे कल्पना के शीर्ष पर PBST -बी.आर. में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के 100 μl जोड़नेimen (1:200 आम तौर पर uncharacterized एंटीबॉडी के लिए एक अच्छा प्रारंभिक एकाग्रता है).
    1. Parafilm के एक लगभग 1 एक्स 1 सेमी टुकड़े के साथ नमूना कवर और नमी चैम्बर बंद. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी में नमूना सेते हैं.
  13. नमी कक्ष खोलें और धीरे स्लाइड से Parafilm दूर करने के लिए संदंश का उपयोग करें. धोने के लिए कमरे के तापमान पर एक गिलास Coplin धुंधला जार में PBST में 5 मिनट के लिए स्लाइड्स सेते हैं. तीन washes के एक कुल के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं.
  14. PBST बी से स्लाइड्स निकालें और नमूना का सामना करना पड़ के साथ नमी कक्ष में उन्हें जगह है. धीरे नमूना के शीर्ष पर PBST -बी.आर. में पतला एंटीबॉडी के 100 μl जोड़ें.
  15. नमी कक्ष खोलें और धीरे स्लाइड से Parafilm दूर करने के लिए संदंश का उपयोग करें. फिर, पीबीएस में 5 मिनट प्रत्येक के लिए 3x के बाद एक गिलास Coplin धुंधला जार में PBST में 5 मिनट प्रत्येक के लिए नमूना 3x धो लो.
  16. एक Kimwipe और फिल्टर पेपर का प्रयोग करें ध्यान से छूने या नमूना सुखाने से बचने के लिए सावधान किया जा रहा है, स्लाइड की सतह सूखी.
  17. , नमूना बढ़ते मीडिया की 6 μl जोड़ें (सिलिकॉन के साथ लेपित नहीं) एक स्वच्छ coverslip के साथ कवर किया, और सील नेल पॉलिश के साथ किनारों.
  18. स्लाइड पर नमूना लगाने में आसानी के लिए वृषण की स्थिति निर्धारित करते हैं और इमेजिंग के लिए आगे बढ़ने के लिए एक मार्कर का उपयोग करें.

4. इमेजिंग नोट्स

इमेजिंग एक ईमानदार या उल्टे नियमित रूप से प्रकाश माइक्रोस्कोप या confocal खुर्दबीन का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है. यह माइक्रोस्कोप विशेष रूप से रहते वृषण नमूनों (ट्रैक ए) की इमेजिंग के लिए, चरण विपरीत के साथ सुसज्जित किया जाना जरूरी है. यह सुविधा हाल ही में confocal सूक्ष्मदर्शी पर उपलब्ध हो गया है.

वृषण अनायास (ट्रैक ए) तोड़ने, टिप (सेल क्षेत्र स्टेम) आम ​​तौर पर शुरू में पता लगाने और उन्मुखीकरण के लिए उपयोग करने के लिए एक अच्छा मार्कर उपलब्ध कराने बरकरार रखा और आसानी से पहचाना जाता है.

_content "> centrioles काफी छोटे संरचनाओं हैं और छवियों इसलिए 63X या 100X उद्देश्यों, 4-6X का एक कारक ज़ूम का उपयोग कर लिया जाना चाहिए, और संभव है जब कम से कम 512 x 512 पिक्सल के एक संकल्प.

Representative Results

Centrosomes शुक्राणुजनन के पाठ्यक्रम पर कई रूपात्मक और कार्यात्मक परिवर्तनों से गुजरना. शुक्राणुजनन की यह विशेषता वृषण तारककाय जीव विज्ञान के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी प्रणाली बनाता है. ऐसा ही एक तत्काल मनाया प्रक्रिया तारककाय बढ़ाव है. Spermatogonia में, centriolar मार्कर Ana1-GFP 0.6 माइक्रोन लंबे तारककेंद्रक (चित्रा -4 ए) के निशान. इस तारककेंद्रक शुक्राणुजनन दौरान elongates और लगभग परिपक्व spermatids में 2.5 माइक्रोन की लंबाई तक पहुँचता है. ड्रोसोफिला शुक्राणु में centrioles अनोखे लंबे होते हैं, इमेजिंग तारककाय बढ़ाव (चित्रा 4 बी) के बारे में मात्रात्मक बयान बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. तारककेंद्रक लंबाई का विश्लेषण भी एक उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि में किया जा सकता है और विभिन्न म्यूटेंट तारककेंद्रक विकास (चित्रा 5) में परिवर्तन को पहचान लिया गया है. उदाहरण (अली) जल्दी हमेशा से रहे हैं और तोप का गोला (कर सकते हैं), म्यूटेशन कि arresटी शुक्राणुजनन अर्धसूत्रीविभाजन 30 के शुरू होने से पहले, लेकिन तारककेंद्रक बढ़ाव ब्लॉक नहीं है. इन म्यूटेंट में, परिपक्व spermatocyte की centrioles 1.8 माइक्रोन की एक अधिकतम तक पहुँचने जो नियंत्रण कक्षों की centrioles की तुलना में के बारे में ~ 2.4 माइक्रोन तक हो जाना.

चित्रा 1
चित्रा 1. शुक्राणुजनन और सेंट्रोसोम जीवविज्ञान. स्टेम सेल और spermatogonia की ए) विकास. सभी शुक्राणु कोशिकाओं वृषण के शिखर नोक पर पाया स्टेम कोशिकाओं से उत्पन्न. प्रत्येक स्टेम सेल माँ तारककाय और बेटी तारककाय 31 संभालते कि एक पूर्वज spermatogonium संभालते कि एक स्टेम सेल के लिए फार्म asymmetrically बिताते हैं. Spermatogonia फार्म के रूप में, वे शुक्राणुजनन भर Spermatocytes और Spermatids घेर जारी रखने के लिए जो 2 पुटी कोशिकाओं से घिरा हो जाते हैं. Spermatogonia डिवाइड 4 बार प्रत्येक दो centrioles. बी युक्त 16 spermatogonia,) Spermatocytes और अर्धसूत्रीविभाजन के विकास के उत्पादन के लिए. Spermatocyte विकास के दौरान, centrioles सेल प्रति दो जोड़े और पुटी प्रति 64 centrioles में आयोजित चार centrioles उत्पन्न करने के लिए एक बार फिर नकली. प्रारंभिक Spermatocyte विकास के दौरान, प्रत्येक तारककेंद्रक यह प्लाज्मा झिल्ली, नाव को ले जाता है, और एक प्राथमिक cilium 18,32-34 जैसा एक संरचना के रूप में elongates. परिपक्व Spermatocytes में, तारककेंद्रक लंबाई ~ 1.8 माइक्रोन तक पहुँचता है. centrosomes अर्धसूत्रीविभाजन में एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं. अर्धसूत्रीविभाजन दौरान, अभी भी सेल के केंद्र की ओर प्लाज्मा झिल्ली चाल से जुड़ी है और उनके बाहर का टिप में कोशिका झिल्ली invaginations बना रहे हैं कि तारककेंद्रक जोड़े. Centrioles चारों ओर पीसीएम, बढ़ता सूक्ष्म सूक्ष्मनलिकाएं nucleates, और धुरी पोल के साथ colocalizes. केवल एक ही तारककेंद्रक presen है कि इतनी अर्धसूत्रीविभाजन II के संक्रमण के दौरान, तारककेंद्रक जोड़ी अलग करती हैप्रत्येक धुरी पोल. सी) Spermiogenesis में टी. अर्धसूत्रीविभाजन के अंत में द्वितीय, अर्ली दौर Spermatid invaginated प्लाज्मा झिल्ली से जुड़ी एक भी तारककेंद्रक है. एक बड़े दौर mitochondrial व्युत्पन्न नाभिक के पास पाया और बाद में बाद में गोल Spermatids में बढ़ गुणसूत्र का अक्षीय धागा साथ बढ़ाना शुरू होता है. शुक्राणुजनन के दौरान, कोशिका द्रव्य अंदर गुणसूत्र का अक्षीय धागा रूपों और elongates. इसके अलावा PCL (समीपस्थ Centriole की तरह) के रूप में जाना एक नया centriolar संरचना preexisting तारककेंद्रक 1 के पास दिखाई देता है. शुक्राणुजनन के अंत में, एक आम पुटी बांटने कोशिकाओं को पूरी तरह परिपक्व गतिशील शुक्राणु बनने के लिए एक दूसरे से अलग. Spermatocyte विकास (बी) और Spermiogenesis (सी) के चित्र क्रमशः पुटी प्रति, 16 Spermatocytes में से केवल एक कक्ष और 64 Spermatids को दर्शाती है, और पुटी कोशिकाओं को चित्रित नहीं है. बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करेंआर आंकड़ा.

चित्रा 2
चित्रा 2. ड्रोसोफिला Testes. अखिल centriolar मार्कर एना-1-GFP व्यक्त एक पूरे माउंट वृषण का एक चरण विपरीत और GFP प्रतिदीप्ति माइक्रोग्राफ की ओवरले. पैनल चित्रा 1 के 1-3 इसी को अलग क्षेत्र कोशिकाओं और spermatogonia, बी) Spermatocytes और अर्धसूत्रीविभाजन, सी) Spermiogenesis स्टेम) एक धराशायी लाल रेखा एक से अलग हो रहे हैं.

चित्रा 3
चित्रा 3. ड्रोसोफिला testes में इमेजिंग centrosomes की ओर ट्रैक करता है.


चित्रा 4. सेंट्रोसोम बढ़ाव शुक्राणुजनन के दौरान. क) प्रत्येक चरण में एक चरण विपरीत छवि (बाएं), प्रतिदीप्ति छवि (मध्य), और तारककाय का बढ़ाया छवि (दाएं) से पता चलता है. चरण विपरीत छवि सेल, नाभिक, nucleolus, और mitochondria की स्थिति और आकारिकी पर आधारित विशेष सेल चरण को दर्शाता है. प्रतिदीप्ति छवि DAPI (नीला) के साथ दाग डीएनए से पता चलता है. तारककाय छवि Asterless-GFP (एएसएल, ऊपर चित्र) और Ana1-GFP (Ana1, नीचे छवि) द्वारा लेबल centrosomes से पता चलता है. एक सफेद सर्कल दोनों चरण विपरीत और प्रतिदीप्ति छवियों में कोशिका झिल्ली पर प्रकाश डाला गया. धराशायी सफेद हलकों और प्रतिदीप्ति छवि में ग्रे वृत्त क्रमशः, नाभिक और nucleolus की स्थिति पर प्रकाश डाला. वाई chromo को पीले तीर अंककुछ छोरों. लाल हलकों mitochondria निशान टकराया. चरणों 1-6 29 को संदर्भित करता है और 13-17 में 32 में सेल चरणों का वर्णन करने के लिए संदर्भित चरणों. चरण 1: प्राथमिक Spermatocyte. एक छोटी सी कोठरी वृषण की एक टिप के रूप में पहचान की. स्टेज 2A: ध्रुवीय Spermatocyte. नाभिक के एक तरफ एक mitochondria टोपी की मौजूदगी से पहचान की. चरण 3: अध्रुवी Spermatocyte. प्राथमिक spermatocyte और एक mitochondria टोपी की कमी से उसके रिश्तेदार बड़े आकार के द्वारा की पहचान की. स्टेज 4: प्राथमिक Spermatocyte. सभी 3 वाई गुणसूत्र छोरों: सभी की उपस्थिति द्वारा की पहचान की. चरण 5: परिपक्व प्राथमिक Spermatocyte. परमाणु के आकार में एक और वृद्धि से पहचान शुक्राणुजनन में उत्पादित सबसे बड़ा Spermatocyte,. स्टेज 6: Premeiotic प्राथमिक Spermatocyte. वाई गुणसूत्र छोरों बिखर और नाभिक गायब. स्टेज 13: प्याज स्टेज Spermatid. समान रूप से आकार के नाभिक और mitochondria युक्त दौर सेल. स्टेज 17: स्वर्गीय spermatid. एक bundl का हिस्सा बनी हुई है कि एक लम्बी spermatid के रूप में पहचानवृषण के आधार के पास पाया नाभिक के साथ 64 spermatids के ए., नाभिक लाभदायक पुटिका में पाया परिपक्व spermatids से थोड़ा व्यापक हैं. स्केल सलाखों, 10 माइक्रोन और 1 माइक्रोन. बी) ग्राफ़ Asterless-GFP (नीला) और Ana1-GFP (हरा) द्वारा मापा के रूप में प्रत्येक चरण के लिए औसत और मानक विचलन को दर्शाया गया है. स्टेज 6 में, Asterless-GFP (नीला) और Ana1-GFP (हरा) औसत और मानक विचलन ओवरलैप और केवल Asterless-GFP (नीला) स्पष्ट है. स्टेज 13 में शुरू, Asterless-GFP पूरे तारककेंद्रक सजाने नहीं है और माप (एनडी) निर्धारित नहीं किया गया.

चित्रा 5
चित्रा 5. स्टेज में असामान्य रूप से लंबी centrioles 6 अली की Spermatocytes कर सकते हैं और म्यूटेंट. पूरे वृषण और प्रतिनिधि तारककाय ला के फ्लोरोसेंट पैनल के एसी) लाइट माइक्रोग्राफAna1-GFP द्वारा Beled. अली में वृषण के असामान्य आकार नोट कर सकते हैं और ग्राफ़ औसत, मानक विचलन को दर्शाया गया है, और जंगली प्रकार में तारककेंद्रक लंबाई के डेटा वितरण, अली और कर सकते हैं) meiotic गिरफ्तारी का एक परिणाम. डी के रूप में spermatids की कमी से जो परिणाम म्यूटेंट, . प्रत्येक डेटा बिंदु के लिए नमूना संख्या कोष्ठकों में है. स्केल बार, 1 माइक्रोन.

Discussion

आनुवंशिक रूप में चिह्नित centrosomal मार्कर का उपयोग कर मक्खी वृषण में तारककाय जीव विज्ञान का अध्ययन एक जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती संदर्भ में दोनों तारककाय समारोह और गतिविधि का आकलन करने के लिए एक उपयोगी तरीका है. विशेष रूप से, ट्रैक एक ऐसी कुरूपता, misegregation, अस्थिरता, या नई म्यूटेंट की पहचान करने के प्रयास में असामान्य लंबाई के रूप में centrosomal असामान्यताएं की तेजी से जांच के लिए उपयुक्त है. इसके अलावा, लाइव तैयारी में spermatid सिलिया लगभग 15 विच्छेदन के बाद मिनट और शुक्राणु गतिशीलता आसानी से संबोधित होने के लिए ट्रैक एक में रहते वृषण का उपयोग भी अनुमति देता है के लिए गतिशील रहते हैं. शुक्राणु चलता - फिरता सिलिया की गतिविधि सीधे तारककाय समारोह से संबंधित है के बाद से, assays सिलिअरी समारोह पर विभिन्न centrosomal परिवर्तन के प्रभाव का निर्धारण किया जा सकता है. ट्रैक बी सांख्यिकीय डेटा जैसे सेल और या पुटी प्रति कोशिकाओं की संख्या प्रति centrioles की संख्या की गणना के लिए के रूप में की आवश्यकता है, खासकर जब अधिक विशिष्ट टिप्पणियों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ट्रैक सी सबसे usefu हैएंटीबॉडी के साथ धुंधला की आवश्यकता है कि विस्तृत टिप्पणियों के लिए एल. उदाहरण ऐसे स्टेम सेल, ऐसे acetylated ट्यूबिलिन के रूप में एक उपलब्ध टैग नहीं है, या एक उत्परिवर्ती में एक प्रोटीन के अभाव या mislocalization सत्यापित करने के लिए कि एक प्रोटीन का धुंधला के रूप में एक विशेष सेल प्रकार की लेबलिंग में शामिल हैं.

आनुवंशिक रूप से टैग मार्करों के बजाय एंटीबॉडी का उपयोग, centrosomes और तारककाय से संबंधित संरचनाओं जब इमेजिंग न केवल प्रयोगात्मक आसान है, लेकिन यह भी अधिक मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्रदान करता है. इसलिए, आनुवंशिक रूप में चिह्नित centrosomal प्रोटीन के उपयोग के एक बड़े डेटा सेट की आवश्यकता होती है कि यंत्रवत और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक विश्वसनीय तरीका है. उदाहरण के लिए, आनुवंशिक रूप में चिह्नित centrosomal मार्कर का उपयोग तारककेंद्रक लंबाई की मात्रा का ठहराव के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो गया है. इस तरह के विश्लेषण विभिन्न म्यूटेशनों तारककेंद्रक लंबाई में परिवर्तनशीलता के आधार पर दो श्रेणियों में वर्गीकृत किया जा सकता है कि पता चला है. एक श्रेणी म्यूटेशन भी शामिल है कि चानजीई तारककेंद्रक लंबाई लेकिन मानक विचलन 1 और अन्य वर्ग को प्रभावित नहीं करते तारककेंद्रक लंबाई और लंबाई 11 में मानक विचलन दोनों को प्रभावित करने वाले म्यूटेशन भी शामिल है. इस तरह की मात्रात्मक डेटा विशेष centrosomal जीन के समारोह में उपयोगी अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं. मानक विचलन में वृद्धि के साथ दोषपूर्ण तारककेंद्रक लंबाई है कि प्रदर्शन Centrosomal म्यूटेंट centriolar संरचना की अस्थिरता की वजह से हो सकता है. हालांकि, एक सामान्य मानक त्रुटि के साथ दोषपूर्ण तारककेंद्रक लंबाई उत्परिवर्तन structurally तारककेंद्रक को अस्थिर और कारण तारककेंद्रक लंबाई को नियंत्रित करने के लिए नियामक तंत्र में बदलाव के लिए होने की संभावना है नहीं है कि संकेत मिल सकता है. कारण immunostaining में विसंगतियों को, मात्रात्मक विश्लेषण अकेले एंटीबॉडी मार्कर के उपयोग के साथ मुश्किल हो जाता है.

तारककाय एक बड़े, जटिल प्रोटीन संरचना है और इसकी प्रोटीन के कई केवल अपने इंटीरियर के भीतर पाए जाते हैं. आनुवंशिक रूप से टैग centrosomal का प्रयोगएंटीबॉडी बल्कि मार्कर एक लगातार जिसका epitopes एंटीबॉडी मार्करों के लिए अन्यथा दुर्गम हो सकता है तारककाय के आंतरिक घटकों लेबल करने के लिए अनुमति देता है. Bld10-GFP एक और अधिक समान वितरण 1 से पता चलता है, जबकि उदाहरण के लिए, Bld10 एंटीबॉडी का उपयोग करने का स्थानीयकरण पढ़ाई, प्रोटीन तारककेंद्रक 13 के बाहर का और प्रॉक्सिमल सिरों पर समृद्ध हो पाता है. हालांकि, यह इस प्रोटीन वितरण को प्रभावित कर सकते हैं, जैसा कि एक विशेष आनुवांशिक रूप से टैग प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर पर विचार करने के लिए भी महत्वपूर्ण है. एस ए एस-4-GFP और एसएएस-6-GFP के स्थानीयकरण उनके अंतर्जात के तहत व्यक्त दूसरी ओर तारककेंद्रक 1,16,35 के समीपस्थ छोर तक ही सीमित है, एस ए एस-4-GFP और एसएएस-6-GFP के तहत व्यक्त मजबूत ubiquitin प्रमोटर तारककेंद्रक 12,14 की पूरी लंबाई के साथ स्थानीयकृत हैं. एक अन्य महत्वपूर्ण विचार प्रोटीन समारोह पर आनुवंशिक टैग का प्रभाव है. आनुवंशिक रूप से टैग प्रोटीन कार्य कर रहे हैं अगर विश्लेषण हो tes हो सकता हैटेड एक उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि में ट्रांसजेनिक प्रोटीन शुरू और ट्रांसजेनिक प्रोटीन उत्परिवर्ती phenotype बचाता अगर परीक्षण करके.

ड्रोसोफिला वृषण की फिक्सेशन रासायनिक fixatives की एक किस्म का उपयोग किया जा सकता है. यहाँ, हम formaldehyde (ट्रैक बी) और मेथनॉल एसीटोन (ट्रैक सी) के साथ दोनों निर्धारण का वर्णन. हालांकि, लगानेवाला या तो इस्तेमाल किया जा सकता है और विभिन्न fixatives रासायनिक देशी एंटीबॉडी epitopes बाधित कर सकते हैं के बाद से, immunostaining के लिए उपयुक्त लगानेवाला का चयन प्रयोगात्मक निर्धारित किया जाना चाहिए. निम्नलिखित fixatives और ऊष्मायन शर्तों आमतौर पर कार्यरत हैं: 3.7% formaldehyde, कमरे के तापमान पर 5 मिनट, मेथनॉल, -20 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट, एसीटोन, -20 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट, मेथनॉल, 15 मिनट -20 पर डिग्री सेल्सियस एसीटोन, -20 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड के बाद; इथेनॉल, 20 मिनट -20 पर डिग्री सेल्सियस एसीटोन, मेथनॉल, और इथेनॉल के साथ नियतन immunostaining, निर्धारण वाई के लिए एक विस्तारित permeabilization कदम की आवश्यकता नहीं हैवें formaldehyde कोशिका झिल्ली permeabilize और intracellular epitopes के लिए एंटीबॉडी का उपयोग की अनुमति के लिए कमरे के तापमान पर PBST बी में एक 1 घंटे ऊष्मायन के बाद किया जाना चाहिए. इसके अलावा, कुछ fixatives विशेष एंटीजन के लिए अधिक उपयुक्त हैं. उदाहरण के लिए, formaldehyde के कार्यों में अच्छी तरह से छोटे प्रोटीन के निर्धारण के लिए, जबकि मेथनॉल और एसीटोन बड़ी आणविक परिसरों 36 के निर्धारण के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है.

ड्रोसोफिला वृषण के immunostaining पहले chromatin संरचना और 29,37 cytoskeleton microtubule के अवलोकन के लिए वर्णित किया गया है. यहाँ (ट्रैक सी), प्रक्रिया आनुवंशिक रूप से टैग प्रोटीन युक्त centrosomal संरचनाओं के विश्लेषण के लिए अनुकूलित किया गया है. हम ड्रोसोफिला वृषण में काम करने में अनुभवहीन हैं व्यक्तियों, जो मार्गदर्शन करने के लिए इस प्रक्रिया का विस्तृत विवरण उपलब्ध कराते हैं. यह प्रक्रिया भी है का उपयोग करके जैसे वृषण, के संरक्षण और आकृति विज्ञान में सुधार के लिए संशोधन शामिलcoverslips और सकारात्मक आरोप लगाया गिलास खुर्दबीन स्लाइड iliconized.

Disclosures

इस प्रकाशन के लिए नि: शुल्क प्रवेश Leica माइक्रोसिस्टम्स द्वारा समर्थित किया गया.

Acknowledgments

यह काम एक एनआईएच और जनरल मेडिकल साइंसेज के राष्ट्रीय संस्थान से अनुदान (R01GM098394) के साथ ही राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन से अनुदान 1121176 द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DAPI Invitrogen D1306
Positively Charged Slides AZER Scientific EMS200A+
Feather Microscalpel Electron Microscopy Sciences 72045-30
37% Formaldehyde or Paraformaldehyde Fisher Scientific BP531-500
Phosphate Buffered Saline (PBS) Boston Bioproducts BM-220
18x18 mm coverslips number 1.5 VWR 48366 205
Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180
Sigmacote Sigma-Aldrich SL2-100 ml
Methanol Fisher Scientific A412-4
Acetone Fisher Scientific A949-1
Triton-X100 Sigma-Aldrich T9284-100ML
BSA Jackson ImmunoResearch 001-000-162
RNAse A 5 prime 2900142
Filter paper Whatman 1001-055
Glass engraver Dremel 290-01
TCS SP5 confocal microscope Leica
Mounting Media Electron Microscopy Sciences 17985-10
Immuno Stain Moisture Chamber, Black Electron Microscopy Sciences 62010-37
Glass Coplin Staining Jar, Screw Cap Electron Microscopy Sciences 70315

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blachon, S., et al. A proximal centriole-like structure is present in Drosophila spermatids and can serve as a model to study centriole duplication. Genetics. 182, 133-144 (2009).
  2. Hennig, W. Spermatogenesis in Drosophila. The International journal of developmental biology. 40, 167-176 (1996).
  3. Fabian, L., Brill, J. A. Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages. Spermatogenesis. 2, 197-212 (2012).
  4. White-Cooper, H. Molecular mechanisms of gene regulation during Drosophila spermatogenesis. Reproduction. 139, 11-21 (2010).
  5. Davies, E. L., Fuller, M. T. Regulation of self-renewal and differentiation in adult stem cell lineages: lessons from the Drosophila male germ line. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 73, 137-145 (2008).
  6. Belote, J. M., Zhong, L. Duplicated proteasome subunit genes in Drosophila and their roles in spermatogenesis. Heredity. 103, 23-31 (2009).
  7. Xiao, X., Yang, W. X. Actin-based dynamics during spermatogenesis and its significance. Journal of Zhejiang University. Science. B. 8, 498-506 (2007).
  8. Hennig, W. Chromosomal proteins in the spermatogenesis of Drosophila. Chromosoma. 111, 489-494 (2003).
  9. Wakimoto, B. T. Doubling the rewards: testis ESTs for Drosophila gene discovery and spermatogenesis expression profile analysis. Genome research. 10, 1841-1842 (2000).
  10. Avidor-Reiss, T., Gopalakrishnan, J. Building a centriole. Curr Opin Cell Biol. , (2012).
  11. Blachon, S., et al. Drosophila asterless and vertebrate Cep152 Are orthologs essential for centriole duplication. Genetics. 180, 2081-2094 (2008).
  12. Basto, R., et al. Flies without Centrioles. Cell. 125, 1375-1386 (2006).
  13. Mottier-Pavie, V., Megraw, T. L. Drosophila bld10 is a centriolar protein that regulates centriole, basal body, and motile cilium assembly. Mol Biol Cell. 20, 2605-2614 (2009).
  14. Rodrigues-Martins, A., et al. DSAS-6 Organizes a Tube-like Centriole Precursor, and Its Absence Suggests Modularity in Centriole Assembly. Curr Biol. 17, 1465-1472 (2007).
  15. Stevens, N. R., Dobbelaere, J., Brunk, K., Franz, A., Raff, J. W. Drosophila Ana2 is a conserved centriole duplication factor. J Cell Biol. 188, 313-323 (2010).
  16. Gopalakrishnan, J., et al. Sas-4 provides a scaffold for cytoplasmic complexes and tethers them in a centrosome. Nat Commun. 2, 359 (2011).
  17. Gopalakrishnan, J., et al. Tubulin nucleotide status controls Sas-4-dependent pericentriolar material recruitment. Nat Cell Biol. 14, 865-873 (2012).
  18. Riparbelli, M. G., Callaini, G., Megraw, T. L. Assembly and persistence of primary cilia in dividing Drosophila spermatocytes. Dev Cell. 23, 425-432 (2012).
  19. Maines, J. Z., Wasserman, S. A. Post-transcriptional regulation of the meiotic Cdc25 protein Twine by the Dazl orthologue Boule. Nat Cell Biol. 1, 171-174 (1999).
  20. Herrmann, S., Amorim, I., Sunkel, C. E. The POLO kinase is required at multiple stages during spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Chromosoma. 107, 440-451 (1998).
  21. Yamashita, Y. M., Jones, D. L., Fuller, M. T. Orientation of asymmetric stem cell division by the APC tumor suppressor and centrosome. Science. 301, 1547-1550 (2003).
  22. Dix, C. I., Raff, J. W. Drosophila Spd-2 Recruits PCM to the Sperm Centriole, but Is Dispensable for Centriole Duplication. Curr Biol. , (2007).
  23. Stevens, N. R., Dobbelaere, J., Wainman, A., Gergely, F., Raff, J. W. Ana3 is a conserved protein required for the structural integrity of centrioles and basal bodies. J Cell Biol. 187, 355-363 (2009).
  24. Giansanti, M. G., Bucciarelli, E., Bonaccorsi, S., Gatti, M. Drosophila SPD-2 Is an Essential Centriole Component Required for PCM Recruitment and Astral-Microtubule Nucleation. Curr Biol. , (2008).
  25. Januschke, J., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Drosophila neuroblasts retain the daughter centrosome. Nat Commun. 2, 243 (2011).
  26. Cheng, J., et al. Centrosome misorientation reduces stem cell division during ageing. Nature. 456, 599-604 (2008).
  27. Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster testes. J. Vis. Exp. , e2641 (2011).
  28. Fuller, M. T. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-174 (1993).
  29. Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis. J Cell Sci. . 107 (Pt. 12), 3521-3534 (1994).
  30. White-Cooper, H., Schafer, M. A., Alphey, L. S., Fuller, M. T. Transcriptional and post-transcriptional control mechanisms coordinate the onset of spermatid differentiation with meiosis I in Drosophila. Development. 125, 125-134 (1998).
  31. Yamashita, Y. M., Mahowald, A. P., Perlin, J. R., Fuller, M. T. Asymmetric inheritance of mother versus daughter centrosome in stem cell division. Science. 315, 518-521 (2007).
  32. Tates, A. D. Cytodifferentiation during Spermatogenesis in Drosophila melanogaster: An Electron Microscope Study. , Rijksuniversiteit de Leiden. Leiden, Netherlands. (1971).
  33. Baker, J. D., Adhikarakunnathu, S., Kernan, M. J. Mechanosensory-defective, male-sterile unc mutants identify a novel basal body protein required for ciliogenesis in Drosophila. Development. 131, 3411-3422 (2004).
  34. Avidor-Reiss, T., Gopalakrishnan, J., Blachon, S., Polyanovsky, A. The Centrosome: Cell and Molecular Mechanisms of Functions and Dysfunctions in Disease. Schatten, H. , Humana Press. (2012).
  35. Gopalakrishnan, J., et al. Self-assembling SAS-6 multimer is a core centriole building block. J Biol Chem. 285, 8759-8770 (2010).
  36. Hassell, J., Hand, A. R. Tissue fixation with diimidoesters as an alternative to aldehydes. I. Comparison of cross-linking and ultrastructure obtained with dimethylsuberimidate and glutaraldehyde. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 22, 223-229 (1974).
  37. Pisano, C., Bonaccorsi, S., Gatti, M. The kl-3 loop of the Y chromosome of Drosophila melanogaster binds a tektin-like protein. Genetics. 133, 569-579 (1993).

Tags

विकास जीवविज्ञान अंक 79 जीव विज्ञान (सामान्य) जेनेटिक्स (पौधे और पशु) पशु जीव विज्ञान पशु मॉडल जीवन विज्ञान (सामान्य) सेंट्रोसोम शुक्राणुजनन Spermiogenesis, Centriole पलक सूत्रीविभाजन अर्धसूत्रीविभाजन
फ्लाई testes में इमेजिंग centrosomes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Basiri, M. L., Blachon, S., Chim, Y. … More

Basiri, M. L., Blachon, S., Chim, Y. C. F., Avidor-Reiss, T. Imaging Centrosomes in Fly Testes. J. Vis. Exp. (79), e50938, doi:10.3791/50938 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter