Summary
초파리의 정자 중 centrosomal 단백질의 영상은 중심체 생물학에 중요한 새로운 단백질을 식별 할뿐만 아니라이 과정에서 알려진 선수의 특정 기능을 명료하게하는 강력한 방법입니다.
Abstract
중심체는 그 구조와 기능 세포주기 및 세포 분화에 걸쳐 극적으로 변화 미세 소관 기반의 세포 기관을 보존하고 있습니다. 중심체는 유사 분열 동안 세포 분열 축을 결정하고 계면 동안 속눈썹을 핵에 필수적입니다. 이러한 동적 변화를 매개 단백질의 아이덴티티는 부분적으로 만 알려져 남아 있고, 이러한 과정에 연루되어있는 다양한 단백질의 기능은 여전히 초보이다. 최근 작품은 초파리의 정자는 중심체 관련 프로세스의 알려진 선수의 특정 기능에 대한 통찰력을 얻기 위해 새로운 중심체 기능과 형성에 중요한 단백질 등을 식별 할 수있는 강력한 시스템을 제공하는 것으로 나타났습니다. 초파리는 설립 유전 모델 생물 돌연변이 체입니다 centrosomal 유전자를 용이하게 얻을 쉽게 분석 할 수 있습니다. 또한, 최근 광학 현미경의 감도 및 해상도의 발전과강력한 유전 태그 centrosomal 마커의 개발은 중심체를 연구하는 간단한 액세스 모델 시스템으로 초파리 고환을 사용하는 능력을 형질 전환했다. 이 논문은 새로운 centrosomal 돌연변이에 대한 유전 화면을 수행하고 새로 확인 된 유전자의 특정 기능에 대한 통찰력을 얻기 위해 유전자 태그 centrosomal 마커를 사용하는 방법을 설명한다.
Introduction
초파리 고환 세포 및 발달 과정의 다양성을 연구하기에 적합한 기관 시스템이며 년 1-9에 걸쳐 광범위하게 검토하고 있습니다.이 원고는 중심체, 보존 세포 소기관을 연구하는 초파리 고환의 사용에 초점을 맞추고 있습니다. 다른 시스템들에서와 같이, 유사 분열 세포의 감수 분열 및 ciliogenesis 10 초파리 고환 기능의 중심체. 중심체는 같은 pericentriolar 물질 (PCM)이라고 복잡한 단백질 네트워크에 의해 둘러싸인 중심 소체라고도 미세 소관 기반 구조의 쌍으로 구성된다. 중심 소체 쌍은 이전 어머니 중심 소체와 젊은 딸의 중심 소체로 구성되어 있습니다. 세포는 유사 분열을 향해 진행되면서 모두 중심 소체에는 분리 중복 궁극적 개의 별개 중심체를 형성 PCM의 다량 확보. 일본어 머더 중심 소체를 함유 중심체는 머더 중심체와 원심이라고원래 딸의 중심 소체를 포함 osome는 딸 중심체이라고합니다.
초파리의 고환은 여러 가지 이유로 형광 현미경으로 중심체 생물학의 분자 기초 연구에 이상적입니다.
- 고환의 중심체 생물학에 필요한 초파리 단백질의 대부분은 1,11-14을 고환은 인간과 다른 종의 중심체 생물학에 관련된 통찰력이 초파리의 중심체 연구를 통해 얻을 수 있다고 제안, 진핵 생물 사이에 보존되어있다.
- 초파리의 돌연변이 분석을 수행하면 많은 다른 모델과는 달리, 초파리 centrosomal 돌연변이가 이렇게 중심체 기능의 고전적인 유전자 분석을 허용, 치명적인 배아 없습니다, 이후 상당한 이점을 제공한다. 초파리의이 독특한 기능은 배아 개발까지의 중요한 단계에서 지속 산모 공헌의 존재로 인해의 pment. 1,11-14. 따라서, 하나는 할 수있다) 완전히 중심체 형성을 제거하고 B) (임산부 기여 소진 된 후 돌연변이 상황에서 산모의 기여에 의해 초기 배아에서 형성된 정상 중심체의 운명을 연구 연구 돌연변이 방법의 원리 ) 11에 설명되어 있습니다.
- 중심체 레이블 유전자 인코딩 형광 태그 기능 형질 전환 유전자를 사용할 수 있습니다. 이러한 라인의 대부분은 강한 과발현을 방지하기 위해 도입 유전자의 전사를 구동하는 단백질 자체의 프로모터를 사용한다. 단백질의 과발현은 종종 중심체 1,11 함수의 분석을 방해 아티팩트가 발생하기 때문에 특히 중요하다.
- 중심 소체와 중심체 따라서 영상으로 중심체의 신속하고 쉬운 분석을 허용, 초파리의 정자를 통해 고유 깁니다.
- 정자와 중심체 B의 연속 단계iology은 정자 줄기 세포의 중심체와 고환의 끝에서 시작하여 성숙한 정자 세포의 감소 중심체의 크기와 활동 (그림 1, 2)와 고환의 맨 아래 끝, 고환 따라 연대순으로 구성되어 있습니다. 이 정자 발달의 여러 단계 중 중심체 기능을 쉽게 식별 및 분석 할 수 있습니다.
- 고환은 쉽게 남성 유충, 번데기, 어른 (27) 해부된다.
- 정자 중, 중심체와 그 중심 소체는 다수의 조성, 구조 및 유사 분열, 감수 분열, 그리고 섬모의 형성에 작용하는 기능 상태를 통해 진행합니다. 이러한 과정에서, 세포의 특정 부분에 중심체 조립, 중복, 마이그레이션합니다, 앵커, 성숙 분할하고, 섬모를 만듭니다. 또한, 성숙한 spermatid의 중심 소체는 PCL 1이라는 centriolar 전구체에 상승을 제공합니다. 또한 성숙한 spermatid에서, 중심체는 공정 C를 거쳐그것은 많은 PCM의 구성 요소 및 중심 소체 (그림 1과 2)을 잃게된다 중심체 감소를 alled. 따라서, 고환의 연구는 하나는 줄기 세포의 중심체 유지, 중심 소체 복제, 중심 소체 안정성, 중심 소체 신장, 중심 소체 분리 및 분리, PCM 모집, ciliogenesis, PCL 형성 중심체 감소 등의 중심체 삶의 여러 측면을 해결하기 위해 수 다른 사람의 사이에서 별이 미세 소관의 핵.
- 마지막으로, 중심체 생물학의 연구는 그 생물학적 연구를위한 바람직한 모델 생물 만든 초파리의 다른 잘 알려진 특성에 힘 입어있다. 이들은 짧은 생성 시간, 유전학의 용이성뿐만 아니라, 무작위 부위 특이 적 변이 (가) 있습니다.
함께, 초파리 고환의 상술 된 특성이 중심체가 쉽고 빠르게하고, 상세한 촬상에 의해 연구 할 수있는 모델을 제공한다. 설명 된 기술이 논문에서 중심 소체 형성 11, 중심 소체 중복 15, PCM 모집 16 중심체 규제 (17) 및 ciliogenesis 18 등의 중심체 생물학의 여러 측면을 조사하기 위해 적용되었습니다. 이 기술은 또한 감수 규제 19, 스핀들 어셈블리 (20), 그리고 많은 다른 사람의 사이에서 비대칭 줄기 세포 분열 21 중심체 활동으로 생물학의 다른 분야에서 중심체 연구에 적용되었다.
유전자 태그 centrosomal 단백질을 표현 파리를 획득하고 남성 유충, 번데기, 또는 성인 파리에서 고환에 격리와 함께 중심체 시작에있는 고환의 영상. 이 파리는 여러 연구 그룹에서 사용할 수 있습니다 1,11,15,22-25. 애벌레 고환 이전 감수 분열에 정자의 모든 단계를 포함 번데기 또는 성인에 치명적인 변이를 분석 할 때 유용합니다. 그러나, 늦은 번데기 또는 젊은 ADU이건 고환은 가장 강력하고 정자의 모든 사전 및 사후 감수 단계를 포함하여 분석하기에 바람직하고. 정자 세포의 수가 플라이 연령에 따라 감소하기 때문에, 성인 고환의 사용은 또한 노화. (26)의 맥락에서 중심체 공부에 적합하다. 성인 파리에서 고환 분리하는 방법은 이전에 27을 설명하고있다.
중심체와 초파리의 고환에있는 그들의 기능의 영상은 여기 (그림 3) 제시하는 세 개의 관련 트랙을 통해 달성 될 수있다. 트랙이 가장 적합한있는 선택은 조사가 해결되는 문제의 성격에 따라 달라집니다.
트랙은 라이브 고환의 영상을 포함한다. 그것은 세 개의 트랙의 가장 빠른이지만 표본 유지하고 면역 염색 할 때 필요하지 않은 필요가없는 경우에만 적용 할 수있다. 트랙에서 고환은 슬라이드에 (그대로, 피어싱, 절단 등) 장착정중 쉽게 식별 세포의 단일 층을 형성하는 커버 슬립하에 찌그러져. 세포는 그 다음 위상차 현미경 및 형광 현미경을 모두 사용하여 시각화 하였다. 그것은 전송 조명의 다른 형태로 볼 수없고, 따라서 정자 개발 (28, 29)의 여러 단계를 신속하게 식별 할 수있는 휴대 정보를 알 수 있기 때문에 위상차의 사용은 초파리 고환의 분석에 특히 중요합니다. 그러나 트랙은 두 가지 주요 단점이 있습니다. 고환이 파열 일단 첫째, 세포의 형태 학적 무결성이 자주 노출된다. 둘째, 고정되지 않은 세포는 때때로 어려운 지정된 영역 내에서 여러 공 초점 층의 영상을 만들고, 표본 내에서 이동합니다. 특정 세포 유형의 분석을 촉진하기 위해, 고환 피어싱이나 고환 파열 등의 coverslip의 법 아래에 부수하는 것은 관심의 세포 유형의 형태에 영향을 미치는 방법을 지시하기 위해 절단 될 수있다.
트랙 B는 고환의 화학 고정을 포함한다. 이 트랙은 시편 준비를위한 시간의 중간 금액을 필요로 고정 표본 저장하여 나중에 분석 할 수있는 장점이있다. 또한, 고정 이미징 동안 시편의 움직임을 최소화, 세포 구조가 더 엄격한 수 있도록하는 역할을한다. 그러나, 위상차 현미경을 찾는 것이 쉽지 정자 개발의 몇 가지 단계를 만드는 화학 고정 후 훨씬 더 유익한 정보가됩니다.
트랙 C는 시간이 많이 대부분,하지만 적절한 유전학 태그를 사용할 수없는 단백질의 시각화를 허용, 세포 구조가 고정 및 면역 염색 있다는 이점이 있습니다. 초파리 고환의 중심체와 중심체 관련 구조를 면역 염색을 위해 사용할 수있는 여러 가지 항체 모두 상업적으로 여러 연구 그룹에서 있습니다.
Protocol
1. 라이브 고환의 트랙 A. 준비
- 8.0 g의 NaCl, 0.2 g의 KCl, 1.44 g 2 HPO 4, 0.24 g의 KH 2 증류수 800 ㎖의에서 PO 4 나 용해하여 PBS를 준비하고 7.4로 pH를 조정합니다. 1 L에 볼륨을 가져와 고압 증기 멸균에 의해 소독.
- 앞에서 설명한 27로 고환을 분리합니다.
- PBS에 1 ㎍ / ml로 1 ㎎ / ㎖ 주식을 희석 DAPI 염색 버퍼를 준비합니다. -20 ° C에서 빛과 매장에서 튜브를 보호하기 위해 알루미늄 호일을 사용하여
- 고환을 분리 한 후, 10 분 동안 적극적으로 청구 유리 현미경 슬라이드 위에 DAPI 염색 버퍼의 6 μL의 시료를 체험. 고환은 시편의 쉬운 조작을 허용, 상업적으로 이용 가능한 양으로 대전 된 슬라이드에 잘 고착. 양전하 슬라이드는 공유 유리면에 정적 양전하를 부여하도록 수정된다. 폴리 리신 코팅과 유사하게, 이는 고환 WI의 상호 작용을 촉진슬라이드의 표면을 토륨.
- PBS의 10 μL로 두 번 염색 버퍼를 대체하여 초과 DAPI을 씻으십시오. 각 세척 단계 후 완충액을 얻어 윅 필터 종이를 사용한다. 실수로 각각 세척하는 동안 버퍼와 함께 고환을 제거하지 않는 등주의해야합니다.
- 시편에 PBS의 10 μl를 추가합니다. 사용 된 버퍼의 양을 커버 슬립의 크기에 따라 조정되어야한다. 이 프로토콜에서 제공하는 볼륨은 18 X 18mm의 coverslip에 대한 것입니다. 선택 사항 : 그것은 관심의 세포 유형의 상대적 위치 근처에 고환을 관통하는 것이 좋습니다. 이것에 의해 구조적 무결성을 유지, 부수 단계에서이 세포에 미치는 압력이 있는지 확인합니다. 고환의 피어싱 날카로운 깨끗한 메스를 사용하여 수행 될 수있다.
- 조심스럽게 시편의 상단에 커버 슬립을 배치합니다.
- 버퍼가 살아있는 검체에서 증발하지 않도록 명확 매니큐어를 사용하는 커버 슬립의 가장자리를 밀봉하는 동안 IM노화.
- 슬라이드 표본을 찾기 쉽 고환의 위치를 지정하고 영상으로 진행 마커를 사용합니다.
- PBS의 10 μL로 두 번 버퍼를 대체하여 초과 DAPI 염색 버퍼를 씻으십시오. 각 세척 단계 후 완충액을 얻어 윅 필터 종이를 사용한다. 실수로 각각 세척하는 동안 버퍼와 함께 표본을 제거하지 않도록주의하십시오.
2. 고정 고환의 트랙 B. 준비
- 1X PBS에서 3.7 % 포름 알데히드의 최종 농도로 PBS에 37 % 포름 알데히드 원액을 희석함으로써 수정 버퍼를 준비
- PBS에 1 ㎍ / ml로 1 ㎎ / ㎖ DAPI의 주식을 희석 DAPI 염색 버퍼를 준비합니다.
- 양으로 대전 된 유리 현미경 슬라이드 위에 PBS의 6 μL 강하 고환을 담가.
- 수동으로 선형 또는 달리 선호하는 고환의 방향.
- PBS를 멀리 심지와 수정의 6 μL로 교체 필터 종이를 사용5 분 동안 버퍼.
- 수정 버퍼를 멀리 심지 10 분 DAPI 염색 버퍼의 6 μL의 시료를 체험하기 위해 필터 종이를 사용합니다.
- 조심스럽게 시편의 상단에 18 X 18mm의 coverslip에 배치합니다.
- 이미지하면서 버퍼 시편에서 증발하지 않도록 명확 매니큐어를 사용하는 커버 슬립의 가장자리를 밀봉.
- 슬라이드 표본을 찾기 쉽 고환의 위치를 지정하고 영상으로 진행 마커를 사용합니다.
3. 면역 염색 고환의 트랙 C. 준비
coverslip에 siliconization : siliconizing 솔루션을 포함하는 작은 트레이에 여러 18 X 18mm 커버 슬립을 담그고 흄 후드에서 실온에서 1 분 동안 품어. 커버 슬립이 완전히 노출되어 서로의 상부에 적층되지 않았는지 확인합니다.
- 실리콘 처리 된 커버 슬립에 PBS의 5 μl의 드롭의 표본을 놓습니다. 동양고환 원하는과 날카로운 메스를 사용하여 고환을 관통로. 부드럽게 PBS가 고르게 커버 슬립 및 슬라이드 사이에 분산 될 수 있도록, 커버 슬립을 통해 적극적으로 청구 유리 현미경 슬라이드를 놓습니다. 커버 슬립 및 슬라이드 사이의 여분의 버퍼를 멀리 윅 필터 종이의 작은 조각을 사용합니다. 버퍼 여과지에 의해 제거 될 때, 압력의 증가는 고환 스쿼시 것이다. 일부 프로토콜의 과정을 통해 손실되거나 손상 될 수 있으므로 많은 시편을 동시에 준비해야한다. 표본의 종류를 동시에 준비 할 경우 유리 조각사 슬라이드에 라벨을 사용할 수 있습니다.
- 1 70 % 에탄올에 1 분마다 3 배 뒤에 물에 분마다, 물에 1 분에 대한 최종 세척을 위해 커버 슬립 배를 씻으십시오. 흄 후드에서 건조시킨 실리콘 처리 된 커버 슬립을 허용합니다.
- 액체 질소로 슬라이드를 삭제하고 시료 5 ~ 10 분 동안 정지 할 수 있습니다.
- L에서 슬라이드를 제거큰 집게를 사용하여 질소를 iquid. 빠르게 커버 슬립을 제거하기 위해 메스를 사용합니다. 표본은 슬라이드에 남아 있어야합니다. 슬라이드를 따라 커버 슬립을 밀어이 과정에서 표본이 묻지 않도록주의하십시오.
- 15 분 -20 ° C에서 유리 코 플린 염색 항아리에 prechilled 메탄올의 슬라이드를 품어.
- 30 초 -20 ° C에서 prechilled 아세톤을 함유하는 유리 코 플린 염색 항아리에 슬라이드를 전송합니다.
- 유리 코 플린 염색 항아리를 사용하여 실온에서 PBS에 1 분 동안 슬라이드를 씻으십시오.
- 0.1 % 트리톤 - X100, 1 % 소 혈청 알부민 (BSA)과 PBS를 보완하여 PBST-B를 준비합니다. (단계 3.14에서) 이차 항체와 같은 숙주 종에서 5 % 정상 혈청 비특이적 차 항체로부터 제조 배경 잡음을 줄이기 위해 BSA 대신 사용될 수있다.
- 비 특정 사이트를 차단하기위한 유리 코 플린 염색 항아리에 PBST-B에서 10 분 동안 슬라이드를 품어.
- 의 우물을 채우기물과 습기 챔버. 챔버 내부의 습도는 배양 단계 동안 시료로부터 항체 용액의 증발을 최소화 할 것이다.
- 100 ㎍ / ㎖의 RNA 분해 효소 A. RNA 분해 효소가 시편에서 RNA를 저하 또한 유리 표면에 강하게 흡수하여 추가 차단 에이전트의 역할에 PBST-B를 보완하여 PBST-BR을 준비합니다.
- 균등 항체 용액 깔아 증발 항체 용액을 보호하기 위하여 시험편의 위에 파라 필름의 약 1 × 1 cm 조각을 배치. 습기 챔버를 닫고, 실온에서 1 시간 동안 일차 항체에 시편을 배양한다.
- PBST-B에서 슬라이드를 제거합니다. 시편 자체를 건조하지 않도록주의를 사용하여 시편 주위에 슬라이드의 영역을 건조 필터 종이를 사용합니다. 마지막으로, 표본 향 수분 챔버에서 슬라이드를 배치
- 조심스럽게 사양의 상단에 PBST-BR에 희석 차 항체 100 μl를 추가imen (1:200은 일반적으로 특성화되지 않은 항체를위한 좋은 시작 농도).
- 파라 필름의 약 1 × 1cm 조각으로 표본을 커버하고 수분 챔버를 닫습니다. 실온에서 1 시간 동안 차 항체에 시편을 배양한다.
- 습기 챔버를 열고 부드럽게 슬라이드에서 파라 필름을 제거하는 집게를 사용합니다. 씻어 상온에서 유리 코 플린 염색 항아리에 PBST로 5 분 슬라이드를 품어. 총 3 회 세척에 대해이 과정을 반복합니다.
- PBST-B에서 슬라이드를 제거하고 표본 향 습기 챔버에 배치. 부드럽게 시편의 상단에 PBST-BR에 희석 차 항체 100 μl를 추가합니다.
- 습기 챔버를 열고 부드럽게 슬라이드에서 파라 필름을 제거하는 집게를 사용합니다. 다시 PBS에서 5 분마다 3 배 뒤에 유리 코 플린 염색 항아리에 PBST에서 5 분마다 시편 3 회 세척한다.
- 킴 와이프 및 필터 종이를 사용 조심스럽게 만지거나 표본을 건조되지 않도록주의하면서, 슬라이드의 표면을 건조.
- , 시편에 설치 미디어의 10 μl를 추가합니다 (실리콘 코팅되지 않음) 깨끗한 커버 슬립 커버 및 인감 매니큐어 가장자리.
- 슬라이드 표본을 찾기 쉽 고환의 위치를 지정하고 영상으로 진행 마커를 사용합니다.
4. 영상 노트
이미징 세우거나 거꾸로 일반 광학 현미경이나 공 초점 현미경을 사용하여 달성 될 수있다. 이 현미경은 특히 실시간 고환 시험편 (트랙 A)의 촬상을 위해, 위상차를 탑재하는 것이 중요하다. 이 기능은 최근 공 초점 현미경에 사용할 수있게되었다.
고환이 자발적으로 (트랙 A) 휴식 할 때, 팁 (셀 영역을 줄기)는 일반적으로 초기 위치와 방향에 사용할 수있는 좋은 마커를 제공하고, 그대로 유지하고 쉽게 식별 할 수 있습니다.
_content "> 중심 소체는 매우 작은 구조입니다 및 이미지 때문에 63X 나 100X 목표, 4-6X의 줌 계수를 사용하여 촬영해야하며, 가능한 한 최소한 512 X 512 픽셀의 해상도.Representative Results
중심체는 정자의 과정을 통해 여러 형태와 기능 변환을 받고있다. 정자의 이러한 특성은 고환 중심체 생물학의 다양한 측면을 연구 할 수있는 유용한 시스템이 있습니다. 그 중 하나가 쉽게 관찰 과정은 중심체 신장입니다. 정조 세포에서 centriolar 마커 ANA1-GFP는 0.6 μm의 긴 중심 소체 (그림 4a)를 표시합니다. 이 중심 소체는 정자 동안 길게하는 거의 성숙 정자 2.5 ㎛의 길이에 도달한다. 초파리 정자 중심 소체 고유 길기 때문에, 영상은 중심체 연신율 (도 4b)에 관한 정량적 인 설명은 할 수 있습니다. 중심 소체의 길이의 분석은 또한 돌연변이 백그라운드에서 수행 할 수있는 다양한 돌연변이 체는 중심 소체 성장 (그림 5) 변경 확인되었습니다. 예를 들면 (ALY) 일찍 항상과 대포 (수), 돌연변이가 arresT의 정자 세포의 감수 분열 (30)의 발병하기 전에 그러나 중심 소체 신장을 차단하지 않습니다. 이러한 돌연변이 체에서 성숙한 spermatocyte의 중심 소체는 1.8 ㎛의 최대에 도달 제어 세포의 중심 소체에 비해 약 ~ 2.4 μm의 성장합니다.
그림 1. 정자와 중심체 생물학. 줄기 세포와 정조 세포의) 개발. 모든 정자 세포는 고환의 꼭대기 끝에서 발견 줄기 세포에서 유래. 각각의 줄기 세포는 어머니의 중심체와 딸 중심체 (31)를 상속하는 전구 spermatogonium를 상속하는 줄기 세포를 형성하기 위해 비대칭 적으로 분할한다. 정조 세포 형태로, 그들은 정자를 통해 정모 세포와 정자를 둘러싸고 계속 2 낭종 세포에 의해 포위 될. 정조 세포 분열 4 회 각각 두 개의 중심 소체. B를 포함하는 16 정조 세포) 정모 세포 및 세포핵의 감수 분열의 개발 생산. Spermatocyte 개발하는 동안, 중심 소체는 세포 당 두 쌍 낭종 당 64 개의 중심 소체로 구성 네 개의 중심 소체를 생성하기 위해 한 번 더 복제. 조기 Spermatocyte 개발 중에, 각 중심 소체 그것에 원형질막, 선창으로 이동하고, 일차 섬모 18,32-34 유사한 구조를 형성하도록 길게한다. 성숙 정모 세포에서, 중심 소체의 길이는 ~ 1.8 μm의에 도달한다. 중심체는 세포의 감수 분열에 필수적인 역할을한다. 감수 분열 I 중, 여전히 셀의 중심을 향해 세포막 이동에 부착되고 그 말단 팁에서 세포막 함입을 생성하는 중심 소체 쌍. 중심 소체 주변의 PCM은, 성장 별이 미세 소관을 nucleates, 스핀들 극 colocalizes. 단 하나의 중심 소체가 프리젠되도록 감수 분열 II로 전환하는 동안, 중심 소체 쌍 분리각 스핀들 극. C) Spermiogenesis에서 t. 감수 분열 II의 끝에서, 초기 라운드가 Spermatid invaginated 세포막에 부착 된 단일 중심 소체를 갖는다. 대형 원형 미토콘드리아 유도체 핵 근처에서 발견하고 나중에 나중에 라운드 정자의 성장 axoneme 따라 연장하기 시작한다. 정자 중, 세포질 내부의 axoneme 양식과가 신장. 또한 PCL (근위 중심 소체 같이)라고하는 새로운 centriolar 구조는 기존의 중심 소체 1에 나타납니다. 정자의 끝에서, 공통 낭종을 공유 세포는 완전히 성숙한 정자 운동성이되기 위해 서로로부터 분리. Spermatocyte 개발 (B)와 Spermiogenesis (C)의 다이어그램은 각각 낭종 당 16 정모 세포 중 하나의 셀에만 64 정자을 묘사하고, 낭종 세포를 묘사하지 않는다. 큰를 보려면 여기를 클릭하십시오R 그림.
그림 2. 초파리 고환. 팬 centriolar 마커 아나-1-GFP를 표현하는 전체 마운트 고환의 위상차 및 GFP의 형광 현미경의 오버레이. 패널 그림 1의 1-3에 해당하는 고유 한 영역은 셀과 정조 세포, B) 정모 세포 및 세포핵의 감수 분열, C) Spermiogenesis 줄기) 빨간 점선으로 구분됩니다.
그림 3. 초파리 고환에서 영상 중심체 향해 추적합니다.
그림 4. 중심체 신장 정자 중. A) 각 단계는 단계 대비 이미지 (왼쪽), 형광 이미지 (가운데), 그리고 중심체의 확대 이미지 (오른쪽)를 보여줍니다. 위상차 콘텐츠 세포, 핵, 핵소체 및 미토콘드리아의 위치 및 형태에 기초하여 특정 세포 단계를 보여준다. 형광 이미지는 DAPI (파란색)로 염색 DNA를 보여줍니다. 중심체 이미지 Asterless-GFP (ASL, 상단 이미지)와 ANA1-GFP (ANA1, 아래 이미지)로 표시 중심체를 보여줍니다. 흰색 원은 모두 위상차 및 형광 이미지의 세포막을 강조한다. 점선 흰색 동그라미와 형광 이미지에서 회색 원은 각각 핵과 핵소체의 위치를 강조. Y-염색체에 노란색 화살표가일부 루프. 빨간색 동그라미가 미토콘드리아를 표시 점선. 1-6 단계는 29을 의미하고 13 ~ 17는 32 세포 단계의 설명을 참조 스테이지. 1 단계 : 1 차 Spermatocyte. 작은 세포 고환의 설명으로 확인했다. 단계 2A : 폴라 Spermatocyte. 핵의 한쪽 미토콘드리아 캡의 존재에 의해 확인했다. 3 단계 : 비극성 Spermatocyte. 기본 spermatocyte과 미토콘드리아 캡의 부족보다 상대적 큰 크기로 식별. 4 단계 : 1 차 Spermatocyte. 모든 3 Y-염색체 루프 : 모두의 모양에 의해 확인. 5 단계 : 성숙한 차 Spermatocyte. 핵 크기가 더 증가에 의해 확인 된 정자에서 생산되는 가장 큰 Spermatocyte. 6 단계 : Premeiotic 차 Spermatocyte. Y-염색체 루프는 분해 핵이 사라집니다. 13 단계 : 양파 단계 Spermatid. 동일한 크기의 핵과 미토콘드리아를 포함하는 둥근 세포. 단계 17 : 늦은 spermatid. bundl의 일부가 남아 연장 spermatid로 확인고환의 기지 근처에서 발견 된 핵 64 정자의 전자는., 핵은 정낭에있는 성숙한 정자보다 약간 넓다. 스케일 바, 10 μm의 1 μm의. B) 그래프 Asterless-GFP (파란색)과 ANA1-GFP (녹색)에 의해 측정 된 각 단계에 대한 평균과 표준 편차를 보여줍니다. 6 단계에서 Asterless-GFP (파란색)과 ANA1-GFP (녹색) 평균과 표준 편차가 겹쳐 만 Asterless-GFP (파란색)은 명백하다. 13 단계에서 시작, Asterless-GFP는 전체 중심 소체를 장식하지 않고 측정 (ND) 결정되지 않았다.
그림 5. 무대에서 비정상적으로 긴 중심 소체 6 ALY의 정모 세포 수의 돌연변이. 전체 고환 대표 중심체 라의 형광 패널의 AC) 라이트 현미경ANA1-GFP로 beled. ALY에 고환의 이상 형태를 참고 할 수 그래프는 평균, 표준 편차를 보여, 야생형의 중심 소체의 길이의 데이터 배포, ALY 수) 감수 체포의 결과. D로 정자의 부족의 결과 돌연변이, . 각 데이터 포인트에 대한 시료 번호는 괄호 안에있다. 스케일 바, 1 μm의.
Discussion
유전자 태그 centrosomal 마커를 사용하여 비행 고환의 중심체 생물학을 공부하는 것은 야생형과 돌연변이 상황 모두에서 중심체 기능과 활동을 평가하기위한 유용한 방법입니다. 특히, 트랙은 기형, misegregation, 불안정, 또는 새로운 돌연변이를 확인하기 위해 비정상적인 길이와 centrosomal 이상을 신속하게 검사에 적합하다. 또한, 라이브 준비에 spermatid 섬모는 약 15 절개 후 분, 정자의 운동성이 쉽게 해결 될 때까지 트랙에 살고 고환의 사용도 수에 운동성이 남아있다. 정자 운동성 섬모의 활성을 직접적 중심체 기능과 관련되어 있기 때문에, 분석은 섬모 기능에 다양 centrosomal 돌연변이의 영향을 결정하기 위하여 수행 될 수있다. 트랙 B는 통계 데이터가 그러한 셀 또는 낭종 당 세포 수 당 중심 소체의 수를 카운트 요구되고, 특히 더 구체적인 관찰에 사용될 수있다. 트랙 C는 대부분의 usefu입니다항체로 염색을 필요로 상세한 관측 L. 예를 들면 줄기 세포, 예컨대 아세틸과 같은 튜 불린 가능한 태그가 없거나 돌연변이의 단백질의 부재 또는 mislocalization을 확인 단백질의 염색과 같은 특정 셀 분류 라벨을 포함한다.
유전자 태그 마커보다는 항체를 사용하여, 중심체와 중심체 관련 구조를 이미징 할 때하는 것은뿐만 아니라 실험적으로 쉽게, 또한보다 강력하고 재현 가능한 결과를 제공합니다. 따라서 유전자 태그 centrosomal 단백질의 사용은 큰 데이터 세트를 필요 기계론 및 정량 분석을위한 신뢰성있는 방법이다. 예를 들어, 유전자 태그 centrosomal 마커의 사용은 중심 소체의 길이의 정량화에 특히 가치가있다. 이러한 분석은 다양한 돌연변이가 중심 소체의 길이 변화에 따라 두 가지로 분류 할 수 있습니다 것으로 나타났습니다. 하나의 범주는 돌연변이를 포함하는 찬GE의 중심 소체의 길이 있지만, 표준 편차 1과 다른 카테고리에 영향을주지 않습니다는 중심 소체의 길이와 길이 11의 표준 편차 모두에 영향을 미치는 돌연변이를 포함한다. 이러한 정량적 인 데이터는 특정 centrosomal 유전자의 기능에 유용한 통찰을 제공 할 수있다. 표준 편차의 증가에 결함이 중심 소체의 길이를 나타내는 Centrosomal 돌연변이 centriolar 구조의 불안정으로 인해 수 있습니다. 그러나, 통상의 표준 오류와 결함 중심 소체의 길이는 돌연변이가 구조적으로 중심 소체를 불안정 인해 중심 소체의 길이를 제어하는 규제기구의 변화가 될 가능성이 높습니다하지 않는 것을 나타낼 수있다. 때문에 면역 염색의 불일치, 정량 분석은 혼자 항체 마커의 사용에 어렵습니다.
중심체는 크고 복잡한 단백질 구조와 단백질의 대부분은 그 내부에서 발견된다. 유전자 태그 centrosomal 사용항체 오히려 마커 하나는 지속적으로 항원 항체 마커에 액세스 할 수없는 경우가 있습니다 중심체의 내부 구성 요소 레이블을 할 수 있습니다. BLD10-GFP는보다 균일 한 분포를 나타낸다 예를 들면, BLD10는 항체를 사용하는 지역화 연구는 단백질 중심 소체 (13)의 근위 단부에 충실하도록 찾는다. 그러나, 이러한 단백질의 분포에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 특정 유전자 표지 된 단백질의 발현 수준을 고려하는 것도 중요하다. 사스-4-GFP 및 SAS-6-GFP의 지역화들은 내인성 하에서 발현이 한편 중심 소체 1,16,35의 기단부로 제한되어, 사스-4-GFP 및 SAS-6-GFP는 아래 표현 강한 유비퀴틴 프로모터는 중심 소체 (12, 14)의 전체 길이를 따라 지역화됩니다. 또 다른 중요한 고려 사항은 단백질 기능에 대한 유전 태그의 효과이다. 유전자 태그 단백질이 기능하는 경우 분석하는 것은 TES 할 수 있습니다테드 돌연변이 배경으로 유전자 변형 단백질을 도입하고 유전자 변형 단백질이 돌연변이 표현형을 구출하면 검사하여.
초파리 고환의 고정이 화학 고정 제의 종류를 사용하여 수행 될 수있다. 여기, 우리는 포름 알데히드 (트랙 B)와 메탄올, 아세톤 (트랙 C) 모두 고정을 설명합니다. 그러나, 정착액 하나는 상호 교환 적으로 사용될 수 있고 다양한 고정 제는 화학적으로 네이티브 항체 에피토프를 방해 할 수 있기 때문에, 면역 염색에 적합한 고정 제의 선택은 실험적으로 결정되어야한다. 다음 고정 제와 배양 조건은 일반적으로 사용된다 : 3.7 %의 포름 알데히드, 실온에서 5 분, 메탄올, -20 ° C에서 15 분, 아세톤, -20 ° C에서 10 분, 메탄올, 15 분 -20 ° C. 아세톤, -20 ° C에서 30 초 뒤에, 에탄올, 20 분 -20 ° C. 아세톤, 메탄올, 에탄올과 고정은 면역 염색, 고정 위스콘신에 대한 확장 permeabilization 단계를 필요로하지 않지만일 포름 알데히드는 세포막을 투과하고 세포 내 항원에 대한 항체를 액세스 할 수 있도록하기 위해 상온에서 PBST-B에서 1 시간 배양 한 다음에해야한다. 또한, 특정 고정 제는 특정 항원에 대한 더 적합합니다. 예를 들어, 포름 알데히드 함수 확실히 작은 단백질의 고정을 위해, 반면, 메탄올 및 아세톤 큰 분자 복합체 (36)의 고정 용에 적합하다.
초파리 고환의 면역 염색 이전 염색질 구조와 세포 골격 29,37 미세 소관을 관찰하기위한 설명되었다. 여기서 (트랙 C), 절차는 유전자 태그로 단백질을 함유 centrosomal 구조의 분석을 위해 최적화되었다. 우리는 초파리의 정소에서 작업의 경험이 개인을 안내하는 절차에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 또한이 절차는 발을 사용하여 같은 고환의 보존 형태를 개선하기 위해 수정을 포함커버 슬립과 양으로 대전 된 유리 현미경 슬라이드를 iliconized.
Disclosures
이 책을 무료로 이용할 수는 라이카 마이크로 시스템즈에 의해 지원되었다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH 및 일반 의료 과학 국립 연구소에서 보조금 (R01GM098394)뿐만 아니라 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에서 보조금 1,121,176에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Positively Charged Slides | AZER Scientific | EMS200A+ | |
| Feather Microscalpel | Electron Microscopy Sciences | 72045-30 | |
| 37% Formaldehyde or Paraformaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Boston Bioproducts | BM-220 | |
| 18x18 mm coverslips number 1.5 | VWR | 48366 205 | |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100 ml | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| Acetone | Fisher Scientific | A949-1 | |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T9284-100ML | |
| BSA | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| RNAse A | 5 prime | 2900142 | |
| Filter paper | Whatman | 1001-055 | |
| Glass engraver | Dremel | 290-01 | |
| TCS SP5 confocal microscope | Leica | ||
| Mounting Media | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
| Immuno Stain Moisture Chamber, Black | Electron Microscopy Sciences | 62010-37 | |
| Glass Coplin Staining Jar, Screw Cap | Electron Microscopy Sciences | 70315 |
References
- Blachon, S., et al. A proximal centriole-like structure is present in Drosophila spermatids and can serve as a model to study centriole duplication. Genetics. 182, 133-144 (2009).
- Hennig, W. Spermatogenesis in Drosophila. The International journal of developmental biology. 40, 167-176 (1996).
- Fabian, L., Brill, J. A. Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages. Spermatogenesis. 2, 197-212 (2012).
- White-Cooper, H. Molecular mechanisms of gene regulation during Drosophila spermatogenesis. Reproduction. 139, 11-21 (2010).
- Davies, E. L., Fuller, M. T. Regulation of self-renewal and differentiation in adult stem cell lineages: lessons from the Drosophila male germ line. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 73, 137-145 (2008).
- Belote, J. M., Zhong, L. Duplicated proteasome subunit genes in Drosophila and their roles in spermatogenesis. Heredity. 103, 23-31 (2009).
- Xiao, X., Yang, W. X. Actin-based dynamics during spermatogenesis and its significance. Journal of Zhejiang University. Science. B. 8, 498-506 (2007).
- Hennig, W. Chromosomal proteins in the spermatogenesis of Drosophila. Chromosoma. 111, 489-494 (2003).
- Wakimoto, B. T. Doubling the rewards: testis ESTs for Drosophila gene discovery and spermatogenesis expression profile analysis. Genome research. 10, 1841-1842 (2000).
- Avidor-Reiss, T., Gopalakrishnan, J. Building a centriole. Curr Opin Cell Biol. , (2012).
- Blachon, S., et al. Drosophila asterless and vertebrate Cep152 Are orthologs essential for centriole duplication. Genetics. 180, 2081-2094 (2008).
- Basto, R., et al. Flies without Centrioles. Cell. 125, 1375-1386 (2006).
- Mottier-Pavie, V., Megraw, T. L. Drosophila bld10 is a centriolar protein that regulates centriole, basal body, and motile cilium assembly. Mol Biol Cell. 20, 2605-2614 (2009).
- Rodrigues-Martins, A., et al. DSAS-6 Organizes a Tube-like Centriole Precursor, and Its Absence Suggests Modularity in Centriole Assembly. Curr Biol. 17, 1465-1472 (2007).
- Stevens, N. R., Dobbelaere, J., Brunk, K., Franz, A., Raff, J. W. Drosophila Ana2 is a conserved centriole duplication factor. J Cell Biol. 188, 313-323 (2010).
- Gopalakrishnan, J., et al. Sas-4 provides a scaffold for cytoplasmic complexes and tethers them in a centrosome. Nat Commun. 2, 359 (2011).
- Gopalakrishnan, J., et al. Tubulin nucleotide status controls Sas-4-dependent pericentriolar material recruitment. Nat Cell Biol. 14, 865-873 (2012).
- Riparbelli, M. G., Callaini, G., Megraw, T. L. Assembly and persistence of primary cilia in dividing Drosophila spermatocytes. Dev Cell. 23, 425-432 (2012).
- Maines, J. Z., Wasserman, S. A. Post-transcriptional regulation of the meiotic Cdc25 protein Twine by the Dazl orthologue Boule. Nat Cell Biol. 1, 171-174 (1999).
- Herrmann, S., Amorim, I., Sunkel, C. E. The POLO kinase is required at multiple stages during spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Chromosoma. 107, 440-451 (1998).
- Yamashita, Y. M., Jones, D. L., Fuller, M. T. Orientation of asymmetric stem cell division by the APC tumor suppressor and centrosome. Science. 301, 1547-1550 (2003).
- Dix, C. I., Raff, J. W. Drosophila Spd-2 Recruits PCM to the Sperm Centriole, but Is Dispensable for Centriole Duplication. Curr Biol. , (2007).
- Stevens, N. R., Dobbelaere, J., Wainman, A., Gergely, F., Raff, J. W. Ana3 is a conserved protein required for the structural integrity of centrioles and basal bodies. J Cell Biol. 187, 355-363 (2009).
- Giansanti, M. G., Bucciarelli, E., Bonaccorsi, S., Gatti, M. Drosophila SPD-2 Is an Essential Centriole Component Required for PCM Recruitment and Astral-Microtubule Nucleation. Curr Biol. , (2008).
- Januschke, J., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Drosophila neuroblasts retain the daughter centrosome. Nat Commun. 2, 243 (2011).
- Cheng, J., et al. Centrosome misorientation reduces stem cell division during ageing. Nature. 456, 599-604 (2008).
- Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster testes. J. Vis. Exp. , e2641 (2011).
- Fuller, M. T. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-174 (1993).
- Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis. J Cell Sci. . 107 (Pt. 12), 3521-3534 (1994).
- White-Cooper, H., Schafer, M. A., Alphey, L. S., Fuller, M. T. Transcriptional and post-transcriptional control mechanisms coordinate the onset of spermatid differentiation with meiosis I in Drosophila. Development. 125, 125-134 (1998).
- Yamashita, Y. M., Mahowald, A. P., Perlin, J. R., Fuller, M. T. Asymmetric inheritance of mother versus daughter centrosome in stem cell division. Science. 315, 518-521 (2007).
- Tates, A. D. Cytodifferentiation during Spermatogenesis in Drosophila melanogaster: An Electron Microscope Study. , Rijksuniversiteit de Leiden. Leiden, Netherlands. (1971).
- Baker, J. D., Adhikarakunnathu, S., Kernan, M. J. Mechanosensory-defective, male-sterile unc mutants identify a novel basal body protein required for ciliogenesis in Drosophila. Development. 131, 3411-3422 (2004).
- Avidor-Reiss, T., Gopalakrishnan, J., Blachon, S., Polyanovsky, A. The Centrosome: Cell and Molecular Mechanisms of Functions and Dysfunctions in Disease. Schatten, H. , Humana Press. (2012).
- Gopalakrishnan, J., et al. Self-assembling SAS-6 multimer is a core centriole building block. J Biol Chem. 285, 8759-8770 (2010).
- Hassell, J., Hand, A. R. Tissue fixation with diimidoesters as an alternative to aldehydes. I. Comparison of cross-linking and ultrastructure obtained with dimethylsuberimidate and glutaraldehyde. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 22, 223-229 (1974).
- Pisano, C., Bonaccorsi, S., Gatti, M. The kl-3 loop of the Y chromosome of Drosophila melanogaster binds a tektin-like protein. Genetics. 133, 569-579 (1993).
