Summary
Imaging av sentrosomalt proteiner under Drosophila spermatogenesen er en kraftig metode for å identifisere nye proteiner kritisk for sentrosomen biologi samt å belyse den aktuelle funksjonen kjente aktører i denne prosessen.
Abstract
Centrosomes er bevart microtubule baserte organeller som struktur og funksjon endres dramatisk gjennom cellesyklus og celledifferensiering. Centrosomes er avgjørende for å bestemme celledeling aksen under mitose og å nucleate flimmerhårene under interfase. Identiteten av de proteiner som formidler disse dynamiske forandringer forblir bare delvis kjent, og funksjonen av mange av de proteiner som er involvert i disse prosesser fremdeles er rudimentær. Nyere arbeider har vist at Drosophila spermatogenesis gir et kraftig system for å identifisere nye proteiner kritisk for sentrosomen funksjon og dannelse samt å få innsikt i den aktuelle funksjonen kjente spillere i sentrosomen relaterte prosesser. Drosophila er en etablert genetisk modellorganisme hvor mutanter i sentrosomalt gener kan lett oppnås og enkelt analysert. Videre, nylige fremskritt i følsomhet og oppløsning av lysmikroskopi ogUtviklingen av robuste genetisk kodede sentrosomalt markører har endret evne til å bruke Drosophila testes som en enkel og tilgjengelig modellsystem for å studere centrosomes. Dette notatet beskriver bruk av genetisk merket sentrosomalt markører for å utføre genetiske skjermer for nye sentrosomalt mutanter og å få innsikt i den spesifikke funksjon av nylig identifiserte gener.
Introduction
Drosophila testiklene er et egnet organ system for å studere en rekke cellulære og utviklingsprosesser, og har blitt anmeldt omfattende gjennom årene 1-9. Manuskriptet fokuserer på bruk av Drosophila testiklene til å studere sentrosomen, en konservert cellulære organeller. Som i andre systemer, sentrosomen av Drosophila testiklene funksjon i mitose, meiose og ciliogenesis 10.. Centrosomes er sammensatt av et par av microtubule baserte strukturer kjent som Sentrioler omgitt av et komplekst protein nettverk kalt pericentriolar materiale (PCM). Den centriole paret består av en eldre mor centriole og en yngre datter centriole. Som cellen utvikler seg mot mitose, begge Sentrioler skille, duplisere, og skaffe seg en stor mengde PCM til slutt danne to forskjellige centrosomes. Den sentrosomen inneholdende den opprinnelige mor centriole er referert til som moder sentrosomen og centrOSOME inneholder den opprinnelige datter centriole omtales som datter sentrosomen.
Drosophila testiklene er ideelle for å studere de molekylære grunnlaget for sentrosomen biologi av fluorescerende mikroskop for en rekke grunner.
- De fleste av Drosophila proteiner som kreves for sentrosomen biologi i testiklene er bevart blant eukaryoter, noe som tyder på at innsikten relevant for sentrosomen biologi hos mennesker og andre arter kan oppnås ved å studere sentrosomen i Drosophila testikler 1,11-14.
- Utføre mutant analyse i Drosophila gir en betydelig fordel siden, i motsetning til mange andre modeller, sentrosomalt mutasjoner i Drosophila er ikke embryonale dødelig, og dermed gir for klassisk genetisk analyse av sentrosomen funksjon. Det unike med Drosophila er på grunn av tilstedeværelsen av maternal bidrag som vedvarer under de kritiske faser av embryonale utvikledepment. 1,11-14. Dermed kan man a) studie mutasjoner som fullstendig eliminerer sentrosomen dannelse og b) studerer skjebnen til en normal sentrosomen som ble dannet i tidlig embryo av mors bidrag i en mutant sammenheng etter mors bidrag har blitt utarmet (prinsippet om metoden er beskrevet i 11).
- Funksjonelle transgener med genetisk kodet fluorescerende tagger som etiketten sentrosomen er tilgjengelig. Mange av disse linjene bruke protein egen promotor for å drive transkripsjonen av transgenet for å hindre sterk overekspresjon. Dette er spesielt viktig fordi overekspresjon av proteinene ofte resulterer i gjenstander som forstyrrer analysen av sentrosomen funksjon 1,11.
- Den centriole og sentrosomen er unikt lang hele Drosophila spermatogenesen, og dermed gir for rask og enkel analyse av sentrosomen ved bildebehandling.
- Påfølgende trinnene i spermatogenesen og sentrosomen biology er organisert kronologisk langs testiklene, som starter på testis spissen med de centrosomes av sperm stamceller og endte på bunnen av testiklene med redusert sentrosomen størrelse og aktivitet i modne sædceller (figur 1 og 2). Dette sørger for enkel identifisering og analyse av sentrosomen funksjon under ulike stadier av sperm utvikling.
- Testiklene er lett dissekert fra mannlige larver, puppe, og voksne 27.
- Under spermatogenesen, sentrosomen og dets Sentrioler fortsette gjennom flere kompositorisk, strukturelle og funksjonelle stater til å fungere i mitose, meiose, og cilium formasjon. I løpet av disse prosessene, sentrosomen monterer, duplikater, vandrer, ankere til bestemte deler av cellen, modnes, dividerer, og skaper en cilium. Videre centriole av modne spermatid gir opphav til en centriolar forløper kalt PCL en. Også i den modne spermatid, gjennomgår sentrosomen en prosess called sentrosomen reduksjon, hvorved det taper mange komponenter i PCM og centriole (figur 1 og 2). Dermed studier i testiklene tillater en å ta opp flere aspekter av sentrosomen livet som sentrosomen oppbevaring i stamcellene, centriole duplisering, centriole stabilitet, centriole forlengelse, centriole separasjon og segregering, PCM rekruttering, ciliogenesis, PCL formasjon, sentrosomen reduksjon, og astral microtubule nucleation blant andre.
- Endelig er studier av sentrosomen biologi hjulpet av de andre kjente karakteristikker av Drosophila som har gjort det til en foretrukket modell organisme for biologiske studier. Disse omfatter en kort generasjonstid, enkel genetikk, så vel som tilfeldig og seterettet mutagenese.
Sammen, de ovennevnte karakteristikkene av Drosophila testikler gir en modell der sentrosomen kan studeres ved enkel, rask og detaljert lydbilde. De teknikker som er beskreveti denne artikkelen har blitt brukt til å undersøke mange aspekter av sentrosomen biologi inkludert centriole formasjon 11, centriole duplisering 15, PCM rekruttering 16, sentrosomen regulering 17, og ciliogenesis 18. Disse teknikkene har også blitt brukt til å studere sentrosomen i andre områder av biologi som meiotisk regulering 19, spindelenheten 20, og sentrosomen aktivitet i asymmetrisk stamcelle divisjon 21 blant mange andre.
Avbildning av testiklene i sentrosomen starter med å skaffe fluer som uttrykker genetisk-merkede sentrosomalt proteiner og isolere testiklene fra mannlige larver, puppe, eller voksne fluer. Disse fluene er tilgjengelig fra flere forskningsgrupper 1,11,15,22-25. Larve testiklene inneholde alle stadier av spermatogenesen før meiose og er nyttige når analysere mutasjoner som er dødelig i puppe eller voksen. Men Late pupal eller unge Adult testiklene er den mest robuste og inneholde alle pre-og post-meiotisk stadier av spermatogenesen, og dermed gjør dem foretrekke for analyse. Siden antall sædceller reduseres når flue aldre, er bruken av voksen testiklene også hensiktsmessig for å studere sentrosomen i sammenheng med aldring. 26. En fremgangsmåte for testis isolert fra voksne fluer tidligere er beskrevet 27.
Imaging av centrosomes og deres funksjon i Drosophila testikler kan oppnås via tre relaterte låter som presenteres her (figur 3). Valg av hvilke spor er mest hensiktsmessig er avhengig av arten av den aktuelle undersøkeren er adressering.
Spor A innebærer avbildning av levende testiklene. Det er den raskeste av de tre sporene, men kan bare brukes når prøvene ikke trenger å bli bevart og når farging er ikke nødvendig. I Track A, er testiklene montert (intakt, gjennomboret eller klippe) på lysbilderog nøye klemt under et dekkglass for å danne et enkelt lag av lett identifiserbare celler. Cellene blir deretter visualisert ved hjelp av både fase-kontrastmikroskopi og fluorescerende mikroskopi. Anvendelse av fase-kontrast er spesielt viktig for analyse av Drosophila testikler, fordi det viser cellulær informasjon som ikke er synlig med andre former for overført lys, og således tillater en rask identifisering av forskjellige faser av utvikling av spermiene 28,29. Imidlertid har Track En to største ulempene. Først er den morfologiske integritet av celler ofte kompromittert når testiklene er sprukket. For det andre, ufestede cellene noen ganger flytte innenfor prøven, noe som gjør den avbildning av flere confocal lag innenfor et angitt område vanskelig. For å fremme en analyse av spesifikke celletyper, kan prøvene bli gjennomboret eller kuttes for å lede veien testis brister slik at squashing under dekkminimalt påvirker morfologien til den celletype av interesse.
Spor B innebærer kjemisk fiksering av testiklene. Dette sporet krever en mellomliggende mengde tid for preparering og har den fordel at faste prøver kan lagres for senere analyse. Videre tjener fiksering for å gjøre cellulære strukturer stivere, noe som reduserer bevegelse av prøven under avbildning. Men blir fasekontrastmikros mye mindre informativ etter kjemisk fiksering, noe som gjør noen stadier av sperm utvikling vanskelig å identifisere.
Track C er den mest tidkrevende, men har den fordelen at cellulære strukturer er faste og immunostained, noe som åpner for visualisering av proteiner som ikke er tilgjengelige med de riktige genetikk koder. Det er mange antistoffer tilgjengelige både kommersielt og fra ulike forskningsmiljøer for farging centrosomes og sentrosomen relaterte strukturer i Drosophila testikler.
Protocol
En. Spor A. Forberedelse av Levende Testikler
- Forbered PBS ved å oppløse 8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2 HPO 4, 0,24 g KH PO 2 4 i 800 ml destillert vann, og justere pH til 7,4. Bring volumet til 1 liter og sterilisere ved autoklavering.
- Isoler testiklene som tidligere beskrevet 27.
- Forbered DAPI farging buffer ved å fortynne 1 mg / ml lager i til 1 pg / ml i PBS. Bruk aluminiumsfolie for å beskytte røret mot lys og oppbevares ved -20 ° C.
- Etter isolering av testiklene, dyppe prøven i 6 mL av DAPI farging buffer på toppen av et positivt ladet glassobjektglass i 10 min. Testikler følge godt med kommersielt tilgjengelige positivt ladede lysbilder, noe som åpner for enkel manipulering av prøven. Positivt ladede lysbilder er kovalent modifisert for å gi en statisk positiv ladning til glassflaten. I likhet med polylysin belegg, fremmer dette samspillet av testiklene with overflaten av objektglasset.
- Vask skytende DAPI ved å erstatte farging buffer to ganger med 6 pl av PBS. Bruke et stykke filterpapir for å transportere bort bufferen etter hvert vasketrinn. Vær forsiktig for å ikke tilfeldigvis fjerne testiklene sammen med buffer under hver vask.
- Tilsett 6 mL PBS til prøven. Mengden av buffer som brukes bør justeres for størrelsen på dekkglasset. Volumene i denne protokollen er for en 18 x 18 mm dekkglass. Valgfritt: Det er tilrådelig å gjennombore testiklene nær den relative plasseringen av det celletype av interesse. Dette vil sikre at det er minimal press på disse celler i løpet av squashing trinnet, for derved å opprettholde sin strukturelle integritet. Piercing av testiklene kan utføres ved hjelp av en skarp, ren skalpell.
- Plassere et dekkglass forsiktig på toppen av prøvestykket.
- Forsegl kantene av dekkglass ved hjelp av klar neglelakk for å sikre at bufferen ikke fordamper fra den levende prøven mens imaldring.
- Bruk en markør for å utpeke plasseringen av testiklene for enkel i finne prøven på lysbildet og fortsett til bildebehandling.
- Vask skytende DAPI farging buffer ved å erstatte buffer to ganger med 6 pl av PBS. Bruke et stykke filterpapir for å transportere bort bufferen etter hvert vasketrinn. Vær nøye med å ikke tilfeldigvis fjerne prøven sammen med buffer under hver vask.
2. Spor B. Fremstilling av faste Testikler
- Forbered Fix buffer ved å fortynne 37% formaldehyd stamløsning i PBS til en sluttkonsentrasjon på 3,7% formaldehyd i PBS 1x
- Forbered DAPI farging buffer ved å fortynne 1 mg / ml lager i DAPI til 1 pg / ml i PBS.
- Fordyp testiklene i en 6 mL dråpe PBS på toppen av et positivt ladet glassobjektglass.
- Manuelt orientere testiklene på en lineær måte eller som på annen måte foretrukket.
- Bruk et stykke filterpapir for å transportere bort PBS og erstatte den med 6 mL av Fixbuffer i 5 min.
- Bruk et stykke filterpapir for å transportere bort Fix buffer og fordype prøven i 6 mL av DAPI flekker buffer for 10 min.
- Plassere en 18 x 18 mm dekkglass forsiktig på toppen av prøvestykket.
- Forsegl kantene av dekkglass ved hjelp av klar neglelakk for å sikre at bufferen ikke fordamper fra prøven under avbildning.
- Bruk en markør for å utpeke plasseringen av testiklene for enkel i finne prøven på lysbildet og fortsett til bildebehandling.
Tre. Spor C. Forberedelse av immunostained Testes
Dekk siliconization: Fordyp flere 18 x 18 mm Dekk i en liten skuff som inneholder silikonsiering løsning og inkuber i 1 min ved romtemperatur under en avtrekkshette. Pass på at dekkglass er fullt eksponert og stables oppå hverandre.
- Plasser prøven i en 5 pl dråpe av PBS på silikonisert dekkglass. Orientertestiklene som ønsket, og pierce testiklene med en skarp skalpell. Forsiktig plassere et positivt ladet glass objektglass over dekkglass, slik at PBS til å bli jevnt fordelt mellom dekkglass og lysbildet. Bruk et lite stykke filterpapir for å transportere vekk overflødig buffer mellom dekkglass og lysbilde. Som buffer er fjernet av filterpapiret, vil økningen i trykket knekken testiklene. Mange prøver skal utarbeides samtidig, som noen kan gå tapt eller skadet i løpet av protokollen. En glass gravør kan brukes til å merke skinnene hvis forskjellige typer av prøver som skal fremstilles samtidig.
- Vask Dekk 3x 1 min hver i vann, etterfulgt av 3 x 1 min hver i 70% etanol, og en avsluttende vask i 1 minutt i vann. La de silikoniserte Dekklufttørke under en avtrekkshette.
- Slipp lysbildene i flytende nitrogen og la prøven å fryse i 5-10 min.
- Fjern lysbildene fra lVæsken nitrogen ved hjelp av en stor tang. Bruk en skalpell til å raskt fjerne dekkglass. Prøven bør forbli på lysbildet. Vær forsiktig så du ikke å smøre prøven i løpet av denne prosessen ved å skyve dekk langs glide.
- Inkuber objektglassene i prechilled methanol i en glasskrukke Coplin farging ved -20 ° C i 15 min.
- Overfør skinnene til en glasskrukke som inneholdt Coplin fargings prechilled aceton ved -20 ° C i 30 sek.
- Vask objektglassene i 1 min i PBS ved romtemperatur ved hjelp av en glass Coplin fargings jar.
- Forbered PBST-B ved å supplere PBS med 0,1% Triton-X100, og 1% bovint serumalbumin (BSA). 5% normalt serum fra samme vertsarter som det sekundære antistoff (fra trinn 3.14) kan anvendes i stedet for BSA for å redusere bakgrunnsstøy som produseres fra ikke-spesifikk sekundær antistoffbinding.
- Inkuber lysbilder for 10 min i PBST-B i et glass Coplin flekker krukke for å blokkere uspesifikke nettsteder.
- Fyll de brønnerfuktighetskammeret med vann. Fuktighet inne i kammeret vil minimere fordampningen av antistoffløsninger fra prøven i løpet av inkubasjons-trinn.
- Forbered PBST-BR ved å supplere PBST-B med 100 mikrogram / ml RNase A. RNase A brytes RNA i prøven og fungerer også som en ekstra blokkerende middel ved å absorbere sterkt til glassflaten.
- Plasser en omtrent 1x1 cm stykke av Parafilm på toppen av prøven for å fordele oppløsningen jevnt antistoff og beskytte antistoffløsningen fra å fordampe. Lukk kammeret og inkuber fuktighets prøven i det primære antistoff i 1 time ved romtemperatur.
- Fjern lysbildene fra PBST-B. Bruke et stykke filterpapir for å tørke det området av dekselet rundt prøven, ved hjelp av forsiktighet for ikke å tørke prøven i seg selv. Til slutt plasserer raset i fuktighet kammer med prøven vender opp
- Tilsett 100 mL av primær antistoff utvannet i PBST-BR på toppen av specimen (1:200 er generelt et godt utgangspunkt konsentrasjon for uncharacterized antistoffer).
- Dekker av prøven med en omtrent 1 x 1 cm bit av Parafilm og lukke fuktighetskammeret. Inkuber prøven i sekundært antistoff i 1 time ved romtemperatur.
- Åpne fuktkammeret og bruke pinsett for å forsiktig fjerne Parafilm fra raset. Inkuber objektglassene i 5 min i PBST i en glasskrukke Coplin farging ved romtemperatur for å vaske. Gjenta denne fremgangsmåten for totalt tre vaskinger.
- Fjern lysbildene fra PBST-B og plassere dem i fuktighet kammer med prøven vendt opp. Forsiktig tilsett 100 pl av sekundært antistoff fortynnet i PBST-BR på toppen av prøvestykket.
- Åpne fuktkammeret og bruke pinsett for å forsiktig fjerne Parafilm fra raset. Igjen, vaskes prøven 3x i 5 minutter hver i PBST i en glasskrukke Coplin farging etterfulgt av 3 ganger i 5 minutter hver i PBS.
- Bruk en Kimwipe og filterpapir til nøye tørke overflaten av raset, er forsiktig med å unngå å berøre eller tørke prøven.
- Legg 6 mL Monterings Media til prøven, dekk med en ren dekkglass (ikke belagt med silikon), og forseglingen kantene med neglelakk.
- Bruk en markør for å utpeke plasseringen av testiklene for enkel i finne prøven på lysbildet og fortsett til bildebehandling.
4. Imaging Merknader
Imaging kan oppnås ved hjelp av en opprettstående eller omvendt vanlig lysmikroskop eller konfokal mikroskop. Det er viktig at mikroskopet være utstyrt med en fase-kontrast, spesielt for avbildning av levende testikler prøver (Track A). Denne funksjonen har nylig blitt tilgjengelig på confocal mikroskoper.
Når testiklene bryte spontant (spor A), er spissen (stamcelle region) vanligvis holdes intakt og er lett identifiserbare, og gir en god markør for å begynne med finne og bruke til orientering.
_content "> Sentrioler er ganske små strukturer og bilder bør derfor tas ved hjelp av 63x eller 100X mål, en zoomfaktor på 4-6X, og en oppløsning på minst 512 x 512 piksler når mulige.Representative Results
Centrosomes gjennomgå flere morfologiske og funksjonelle forandringer i løpet av spermatogenesen. Denne karakteristikken av spermatogenesen gjør testiklene et nyttig system for å studere ulike aspekter av sentrosomen biologi. En slik lett observert prosessen er sentrosomen forlengelse. I spermatogonier, den centriolar markør Ana1-GFP markerer 0,6 mikrometer lang centriole (figur 4a). Dette centriole elongates under spermatogenese og når en lengde på 2,5 mikrometer i nesten modne spermatider. Siden Sentrioler i Drosophila sperm er unikt lang, kan bildediagnostikk brukes til å gjøre kvantitative uttalelser om sentrosomen forlengelse (figur 4b). Analyse av centriole lengde kan også utføres i en mutant bakgrunn og er identifisert ulike mutanter som endrer centriole vekst (figur 5). Eksempler er alltid tidlig (ALY) og Cannonball (CAN), mutasjoner som Arrest spermatogenese før utbruddet av meiose 30, men ikke blokkere centriole forlengelse. I disse mutantene, Sentrioler av den modne spermatocyte vokse til omtrent ~ 2,4 mikrometer i forhold til Sentrioler av kontrollceller som når et maksimum på 1,8 mikrometer.
Figur 1. Spermatogenese og sentrosomen Biology. A) Utvikling av stamceller og spermatogonier. Alle sædceller stammer fra stamceller som finnes på den apikale spissen av testiklene. Hver Stem Cell deler asymmetrisk for å danne en stamcelle som arver mor sentrosomen og en stamfar spermatogonium som arver datteren sentrosomen 31. Som spermatogonier skjema, blir de omringet av to cyste celler, som fortsetter å omringe spermatocytter og spermatider gjennom spermatogenesen. Spermatogonier divide fire ganger for å produsere 16 spermatogonier, som hver inneholder to Sentrioler. B) Utvikling av spermatocytter og Meiose. Under Spermatocyte utvikling, Sentrioler duplisere en gang mer å generere fire Sentrioler organisert i to par per celle og 64 Sentrioler per cyste. Tidlig i løpet Spermatocyte utvikling, flytter hver centriole til plasma membranen, dokker til det, og elongates å danne en struktur som ligner en primær cilium 18,32-34. I modne spermatocytter, når centriole lengde ~ 1,8 mikrometer. De centrosomes spille en viktig rolle i meiose. Under meiose I, de centriole parene som fortsatt sitter til plasma membranen bevege seg mot sentrum av cellen og skape cellemembranen invaginations på sitt distale spissen. PCM rundt Sentrioler vokser, nucleates astrale mikrotubuli, og colocalizes med spindelen pol. I overgangen til meiose II, skiller centriole pair slik at bare en enkelt centriole er present på hver spindel pol. C) spermiogenesen. Ved slutten av meiose II, har de tidlig Round Spermatid en enkelt centriole festet til invaginated plasma membran. En stor rund mitokondrie derivat er funnet i nærheten av kjernen og senere begynner å forlenge langs voksende axoneme i senere runde spermatider. Under spermatogenesen, de axoneme former og elongates inne i cytoplasma. I tillegg er en ny centriolar struktur kjent som PCL (Proximal centriole Som) nær det preexisting centriole en. På slutten av spermatogenesen, celler deler en felles cyste skille fra hverandre for å bli helt modne aktive sædceller. Diagrammene av Spermatocyte utvikling (B) og spermiogenesen (C) skildre bare én celle ut av de 16 spermatocytter og 64 spermatider, henholdsvis per cyste, og ikke skildre cyste celler. Klikk her for å se stortr figur.
Figur 2. Drosophila Testikler. Et overlegg av en fase-kontrast og GFP fluorescens micrograph av en hel-mount testikkel uttrykker pan-centriolar markør Ana-1-GFP. Distinkt område tilsvarende paneler 1-3 i figur 1 er atskilt med en stiplet rød linje A) Stem Cells og spermatogonier, B) spermatocytter og Meiose, C) spermiogenesen.
Figur 3. Tracks Mot Imaging centrosomes i Drosophila Testikler.
Figur 4. Sentrosomen Forlengelse Under Spermatogenesen. A) Hver scene viser en fase-kontrast (til venstre), fluorescens bilde (i midten), og forstørret bilde av sentrosomen (til høyre). Den fase-kontrast viser den spesielle cellestadiet basert på posisjonen og morfologien til cellen, kjernen, kjerne, og mitokondriene. Fluorescens bildet viser DNA farget med DAPI (blå). Den sentrosomen bildet viser centrosomes merket av Asterless-GFP (Asl, toppbilder) og Ana1-GFP (Ana1, nederste bilde). En hvit sirkel streker cellemembranen i både fase-kontrast og fluorescens bilder. De stiplede sirkler hvite og det grå sirkelen i fluorescens bilde markere posisjonen til kjernen og kjerne, henholdsvis. Gule pilen peker til Y-chromonoen sløyfer. Stiplede røde sirkler markere mitokondriene. Stages 1-6 refererer til 29 og scener 13-17 refererer til beskrivelsen av celle stadier i 32. Stage 1: Primær Spermatocyte. Identifisert som et småcellet en spiss av testis. Stage 2a: Polar Spermatocyte. Identifisert ved tilstedeværelse av en mitokondrier hetten på den ene side av kjernen. Stage 3: apolart Spermatocyte. Identifisert ved sin relative større størrelse enn den primære spermatocyte og mangel på en mitokondrier cap. Stage 4: Primær Spermatocyte. Identifisert av utseendet av alt: Alle tre Y-kromosom sløyfer. Stage 5: Eldre Primær Spermatocyte. Største Spermatocyte produsert av spermatogenesen, identifisert av en ytterligere økning i kjernefysisk størrelse. Stage 6: Premeiotic Primær Spermatocyte. Y-kromosom looper i oppløsning og kjernen forsvinner. Stage 13: Onion Stage Spermatid. Runde celle som inneholder like store kjerne og mitokondrier. Stage 17: Late spermatid. Identifisert som et langstrakt spermatid som gjenstår en del av en Bundle av 64 spermatider med kjerner funnet nær bunnen av testiklene., kjerner er litt bredere enn modne spermatider som finnes i sædvæske. Scale barer, 10 mikrometer og 1 mikrometer. B) Diagram viser gjennomsnitt og standardavvik for hver etappe som målt ved Asterless-GFP (blå) og Ana1-GFP (grønt). I Stage 6, Asterless-GFP (blå) og Ana1-GFP (grønt) gjennomsnitt og standardavvik lapper og bare Asterless-GFP (blå) er tydelig. Starter på Stage 13, betyr Asterless-GFP ikke pynte hele centriole og målinger ble ikke fastslått (ND).
Figur 5. Unormalt lange Sentrioler i Stage 6 spermatocytter av Aly og kan mutanter. AC) Lett micrograph av hele testikler og fluorescerende panel av representant sentrosomen laBeled av Ana1-GFP. Legg merke til unormal form av testiklene i Aly og kan mutanter, som resultater fra en manglende spermatider som en konsekvens av meiotisk arrest. D) graf viser gjennomsnitt, standardavvik, og data distribusjon av centriole lengde i villtype, Aly og kan . Eksempelnummer for hvert datapunkt er i parenteser. Scale bar, en mikrometer.
Discussion
Studerer sentrosomen biologi i flue testes ved hjelp av genetisk merkede sentrosomalt markører er en nyttig metode for å vurdere sentrosomen funksjon og aktivitet i både villtype-og mutant sammenheng. Spesielt er Track En egnet for rask screening av sentrosomalt abnormaliteter som misdannelse, misegregation, ustabilitet, eller unormal lengde i et forsøk på å identifisere nye mutanter. Videre spermatid flimmerhårene i live-forberedelser forbli motile for ca 15 min etter disseksjon og bruk av levende testiklene i Track A gir også mulighet for sperm motilitet å være lett adressert. Siden aktiviteten av motile spermier cilia er direkte relatert til sentrosomen funksjon, kan analyser gjennomføres for å bestemme effekten av ulike sentrosomalt mutasjoner på ciliær-funksjon. Spor B kan brukes for mer spesifikke observasjoner, spesielt når statistiske data er nødvendig for eksempel for å telle antall Sentrioler per celle og eller antall celler pr cyste. Track C er mest useful for detaljerte observasjoner som krever farging med antistoffer. Eksempler innbefatter merking av en bestemt celletype, for eksempel stamceller, farging av et protein som ikke har et tilgjengelig kode, for eksempel acetylert tubulin, eller til å verifisere fraværet eller mislocalization av et protein i en mutant.
Når imaging centrosomes og sentrosomen relaterte strukturer, ved hjelp av genetisk merkede markører i stedet for antistoffer er ikke bare eksperimentelt enklere, men også gir mer robuste og reproduserbare resultater. Derfor er bruken av genetisk merkede proteiner sentrosomalt en pålitelig metode for mekanistiske og kvantitative analyser som krever et stort datasett. For eksempel har bruk av genetisk merket sentrosomalt markører vært spesielt verdifullt for kvantifisering av centriole lengde. Slike analyser har avdekket at ulike mutasjoner kan klassifiseres i to kategorier basert på variasjon i centriole lengde. En kategorien inkluderer mutasjoner som change centriole lengde, men påvirker ikke standardavviket 1 og den andre kategorien inkluderer mutasjoner som påvirker både centriole lengde og standardavviket i lengde 11. Slike kvantitative data kan gi nyttig innsikt i funksjon av bestemte sentrosomalt gener. Sentrosomalt mutanter som viser defekt centriole lengde med en økning i standardavvik kan skyldes en destabilisering av centriolar struktur. Imidlertid kan defekte centriole lengde med en vanlig standard feil indikerer at mutasjonen ikke strukturelt destabilisere centriole og er mer sannsynlig å være på grunn av en endring i reguleringsmekanisme som kontrollerer centriole lengde. På grunn av uregelmessigheter i farging, kvantitative analyser er vanskelig ved bruk av antistoffmarkører alene.
Sentrosomen er en stor, kompleks proteinstruktur og mange av sine proteiner er bare funnet innenfor sitt interiør. Ved hjelp av genetisk kodet sentrosomaltmarkører heller antistoffene gjør det mulig å konsekvent merke interne komponentene i sentrosomen hvis epitoper kan være ellers utilgjengelige for antistoff markører. For eksempel lokaliseringsstudier av Bld10 hjelp av antistoffer synes proteinet å bli beriket på den distale og proksimale ender av centriole 13, mens Bld10-GFP viser en mer jevn fordeling 1.. Det er imidlertid også viktig å vurdere nivået av ekspresjon av et spesielt rekombinant DNA-kodede protein, da dette kan påvirke proteinfordeling. Lokalisering av Sas-4-GFP og SAS-6-GFP uttrykt under deres endogene er begrenset til de proksimale ender av centriole 1,16,35 På den annen side, Sas-4-GFP og SAS-6-GFP uttrykt under sterk ubiquitin promoter er lokalisert langs hele lengden av centriole 12,14. Et annet viktig hensyn er effekten av den genetiske koden på proteinfunksjon. Analysere om genetisk merkede proteiner er funksjonelle kan være tested ved å innføre den transgene protein inn i en mutant bakgrunn og undersøke om det transgene protein befrir den mutante fenotype.
Fiksering av Drosophila testikler kan utføres ved hjelp av en rekke kjemiske fiksativ. Her beskriver vi fiksering med både formaldehyd (spor B) og metanol-aceton (spor C). Imidlertid kan enten fiksativ kan brukes om hverandre, og siden ulike fiksativ kan kjemisk forstyrre opprinnelige antistoff-epitoper, må valg av passende fikseringsmiddel for farging bestemmes eksperimentelt. De følgende fiksativ og inkuberingsbetingelser som vanligvis benyttes er: 3,7% formaldehyd, 5 minutter ved romtemperatur; metanol, 15 min ved -20 ° C, aceton, 10 min ved -20 ° C, metanol, 15 min ved -20 ° C. etterfulgt av aceton, 30 sek ved -20 ° C, etanol, 20 min ved -20 ° C. Selv om fiksering med aceton, metanol og etanol ikke krever en utvidet permeabilization trinn for farging, fiksering with formaldehyd bør etterfølges av en 1-timers inkubasjon i PBST-B ved værelsestemperatur til permeabilize cellemembraner og tillater antistoff tilgang til intracellulære epitoper. Videre er visse fiksativ er mer egnet for spesielle antigener. For eksempel formaldehyd fungerer godt for fiksering av små proteiner, mens metanol og aceton er egnet for fiksering av store molekylære komplekser 36.
Farging av Drosophila prøvene har blitt tidligere beskrevet for å observere kromatin strukturer og microtubuli cytoskjelettet 29,37. Her (spor C), har prosedyren er optimalisert for analyse av sentrosomalt strukturer som inneholder genetisk merkede proteiner. Vi gir en detaljert beskrivelse av denne fremgangsmåten for å veilede personer som er uerfarne i å jobbe i Drosophila testikler. Denne fremgangsmåten omfatter også modifiseringer for å forbedre bevaring og morfologien til testiklene, for eksempel ved hjelp av siliconized Dekk og positivt ladede glass objektglass.
Disclosures
Fri tilgang til denne publikasjonen ble støttet av Leica Microsystems.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av et stipend (R01GM098394) fra NIH og National Institute of General Medical Sciences samt tilskudd 1.121.176 fra National Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Positively Charged Slides | AZER Scientific | EMS200A+ | |
| Feather Microscalpel | Electron Microscopy Sciences | 72045-30 | |
| 37% Formaldehyde or Paraformaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Boston Bioproducts | BM-220 | |
| 18x18 mm coverslips number 1.5 | VWR | 48366 205 | |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100 ml | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| Acetone | Fisher Scientific | A949-1 | |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T9284-100ML | |
| BSA | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| RNAse A | 5 prime | 2900142 | |
| Filter paper | Whatman | 1001-055 | |
| Glass engraver | Dremel | 290-01 | |
| TCS SP5 confocal microscope | Leica | ||
| Mounting Media | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
| Immuno Stain Moisture Chamber, Black | Electron Microscopy Sciences | 62010-37 | |
| Glass Coplin Staining Jar, Screw Cap | Electron Microscopy Sciences | 70315 |
References
- Blachon, S., et al. A proximal centriole-like structure is present in Drosophila spermatids and can serve as a model to study centriole duplication. Genetics. 182, 133-144 (2009).
- Hennig, W. Spermatogenesis in Drosophila. The International journal of developmental biology. 40, 167-176 (1996).
- Fabian, L., Brill, J. A. Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages. Spermatogenesis. 2, 197-212 (2012).
- White-Cooper, H. Molecular mechanisms of gene regulation during Drosophila spermatogenesis. Reproduction. 139, 11-21 (2010).
- Davies, E. L., Fuller, M. T. Regulation of self-renewal and differentiation in adult stem cell lineages: lessons from the Drosophila male germ line. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 73, 137-145 (2008).
- Belote, J. M., Zhong, L. Duplicated proteasome subunit genes in Drosophila and their roles in spermatogenesis. Heredity. 103, 23-31 (2009).
- Xiao, X., Yang, W. X. Actin-based dynamics during spermatogenesis and its significance. Journal of Zhejiang University. Science. B. 8, 498-506 (2007).
- Hennig, W. Chromosomal proteins in the spermatogenesis of Drosophila. Chromosoma. 111, 489-494 (2003).
- Wakimoto, B. T. Doubling the rewards: testis ESTs for Drosophila gene discovery and spermatogenesis expression profile analysis. Genome research. 10, 1841-1842 (2000).
- Avidor-Reiss, T., Gopalakrishnan, J. Building a centriole. Curr Opin Cell Biol. , (2012).
- Blachon, S., et al. Drosophila asterless and vertebrate Cep152 Are orthologs essential for centriole duplication. Genetics. 180, 2081-2094 (2008).
- Basto, R., et al. Flies without Centrioles. Cell. 125, 1375-1386 (2006).
- Mottier-Pavie, V., Megraw, T. L. Drosophila bld10 is a centriolar protein that regulates centriole, basal body, and motile cilium assembly. Mol Biol Cell. 20, 2605-2614 (2009).
- Rodrigues-Martins, A., et al. DSAS-6 Organizes a Tube-like Centriole Precursor, and Its Absence Suggests Modularity in Centriole Assembly. Curr Biol. 17, 1465-1472 (2007).
- Stevens, N. R., Dobbelaere, J., Brunk, K., Franz, A., Raff, J. W. Drosophila Ana2 is a conserved centriole duplication factor. J Cell Biol. 188, 313-323 (2010).
- Gopalakrishnan, J., et al. Sas-4 provides a scaffold for cytoplasmic complexes and tethers them in a centrosome. Nat Commun. 2, 359 (2011).
- Gopalakrishnan, J., et al. Tubulin nucleotide status controls Sas-4-dependent pericentriolar material recruitment. Nat Cell Biol. 14, 865-873 (2012).
- Riparbelli, M. G., Callaini, G., Megraw, T. L. Assembly and persistence of primary cilia in dividing Drosophila spermatocytes. Dev Cell. 23, 425-432 (2012).
- Maines, J. Z., Wasserman, S. A. Post-transcriptional regulation of the meiotic Cdc25 protein Twine by the Dazl orthologue Boule. Nat Cell Biol. 1, 171-174 (1999).
- Herrmann, S., Amorim, I., Sunkel, C. E. The POLO kinase is required at multiple stages during spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Chromosoma. 107, 440-451 (1998).
- Yamashita, Y. M., Jones, D. L., Fuller, M. T. Orientation of asymmetric stem cell division by the APC tumor suppressor and centrosome. Science. 301, 1547-1550 (2003).
- Dix, C. I., Raff, J. W. Drosophila Spd-2 Recruits PCM to the Sperm Centriole, but Is Dispensable for Centriole Duplication. Curr Biol. , (2007).
- Stevens, N. R., Dobbelaere, J., Wainman, A., Gergely, F., Raff, J. W. Ana3 is a conserved protein required for the structural integrity of centrioles and basal bodies. J Cell Biol. 187, 355-363 (2009).
- Giansanti, M. G., Bucciarelli, E., Bonaccorsi, S., Gatti, M. Drosophila SPD-2 Is an Essential Centriole Component Required for PCM Recruitment and Astral-Microtubule Nucleation. Curr Biol. , (2008).
- Januschke, J., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Drosophila neuroblasts retain the daughter centrosome. Nat Commun. 2, 243 (2011).
- Cheng, J., et al. Centrosome misorientation reduces stem cell division during ageing. Nature. 456, 599-604 (2008).
- Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster testes. J. Vis. Exp. , e2641 (2011).
- Fuller, M. T. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-174 (1993).
- Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis. J Cell Sci. . 107 (Pt. 12), 3521-3534 (1994).
- White-Cooper, H., Schafer, M. A., Alphey, L. S., Fuller, M. T. Transcriptional and post-transcriptional control mechanisms coordinate the onset of spermatid differentiation with meiosis I in Drosophila. Development. 125, 125-134 (1998).
- Yamashita, Y. M., Mahowald, A. P., Perlin, J. R., Fuller, M. T. Asymmetric inheritance of mother versus daughter centrosome in stem cell division. Science. 315, 518-521 (2007).
- Tates, A. D. Cytodifferentiation during Spermatogenesis in Drosophila melanogaster: An Electron Microscope Study. , Rijksuniversiteit de Leiden. Leiden, Netherlands. (1971).
- Baker, J. D., Adhikarakunnathu, S., Kernan, M. J. Mechanosensory-defective, male-sterile unc mutants identify a novel basal body protein required for ciliogenesis in Drosophila. Development. 131, 3411-3422 (2004).
- Avidor-Reiss, T., Gopalakrishnan, J., Blachon, S., Polyanovsky, A. The Centrosome: Cell and Molecular Mechanisms of Functions and Dysfunctions in Disease. Schatten, H. , Humana Press. (2012).
- Gopalakrishnan, J., et al. Self-assembling SAS-6 multimer is a core centriole building block. J Biol Chem. 285, 8759-8770 (2010).
- Hassell, J., Hand, A. R. Tissue fixation with diimidoesters as an alternative to aldehydes. I. Comparison of cross-linking and ultrastructure obtained with dimethylsuberimidate and glutaraldehyde. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 22, 223-229 (1974).
- Pisano, C., Bonaccorsi, S., Gatti, M. The kl-3 loop of the Y chromosome of Drosophila melanogaster binds a tektin-like protein. Genetics. 133, 569-579 (1993).
