Summary
Drosophila spermatogenez sırasında centrosomal proteinlerin Görüntüleme sentrozom biyoloji için önemli bir yeni proteinleri tespit etmek yanı sıra, bu işlem bilinen oyuncu belirli bir işlevi aydınlatmak için güçlü bir yöntemdir.
Abstract
Sentrozomlar olan yapısı ve fonksiyonu, hücre döngüsü ve hücre farklılaşması boyunca dramatik değişim mikrotübül-temelli organellerini korunmuştur. Sentrozom mitoz sırasında hücre bölünmesi ekseni belirlemek ve interfaz sırasında kirpikler çekirdeklenmesi için gereklidir. Bu dinamik değişiklik aracılık proteinlerin kimliği kısmen bilinir kalır ve bu işlemler de implike edilmiştir proteinlerin çoğunun işlevi henüz gelişmemiş. Son çalışmalar, Drosophila spermatogenez sentrozom ile ilgili süreçlerin bilinen oyuncu belirli bir işlev anlamak için yeni sentrozom fonksiyonu ve oluşumu için kritik proteinleri hem de tanımlamak için güçlü bir sistem sağlar göstermiştir. Drosophila kurulmuş bir genetik bir model organizma mutantları olduğu centrosomal genler hali hazırda elde edilmiş ve kolayca analiz edilebilir. Ayrıca, son ışık mikroskobu hassasiyet ve çözünürlük gelişmeler veSağlam genetik etiketli centrosomal belirteçlerin geliştirilmesi centrosomes incelemek için basit ve erişilebilir bir model sistem olarak Drosophila testis kullanma yeteneği değiştirdi. Bu çalışma, yeni centrosomal mutantlar için genetik ekranlar gerçekleştirmek için ve yeni tanımlanan genlerin spesifik fonksiyonu hakkında fikir elde etmek için genetik olarak-işaretli centrosomal belirteçlerin kullanımını tarif eder.
Introduction
Drosophila testis hücresel ve gelişimsel süreçlerinin çeşitli çalışma için uygun bir organ sistemi ve yıllar 1-9 üzerinde yoğun gözden geçirilmiştir. Bu el yazması centrosome, korunmuş bir hücresel organelini çalışma Drosophila testislerin kullanılması üzerinde duruluyor. Diğer sistemlerde olduğu gibi, mitoz, mayoz ve ciliogenesis 10 Drosophila testisler fonksiyonunun sentrozom. Sentrozom olarak pericentriolar malzeme (PCM) de ifade kompleks protein ağı ile çevrili sentriyoller olarak bilinen mikrotübül yapılarının temel bir çift oluşur. Sentriol çifti eski bir anne Sentriyol ve bir genç kızı Sentriyol oluşur. Hücre mitoz doğru ilerledikçe, her ikisi de sentriyoller, ayrı çoğaltmak ve sonuç olarak iki ayrı centrosomes oluşturulması için PCM büyük miktarda kazanır. Orijinal ana Sentriyol ihtiva sentrozom anne sentrozom ve centr olarak adlandırılırOrijinal kız Sentriyol içeren Osome kızı sentrozom olarak adlandırılır.
Drosophila testisler çeşitli nedenlerden için floresan mikroskobu ile sentrozom biyoloji moleküler temeli incelemek için idealdir.
- Testislerde sentrozom biyoloji için gerekli olan proteinlerin çoğu Drosophila 1,11-14 testisler, insan ve diğer türlerdeki sentrozom biyoloji ile ilgili bir fikir Drosophila sentrozom inceleyerek elde edilebilir düşündüren, ökaryotlar arasında muhafaza edilir.
- Drosophila mutant analizi yapan birçok diğer modellerin aksine, Drosophila centrosomal mutasyonlar dolayısıyla centrosome fonksiyonunun klasik genetik analiz için izin, öldürücü embriyonik değil, yana önemli bir avantaj sağlamaktadır. Drosophila Bu eşsiz özellik embriyonik develo kritik safhaları sırasında devam maternal katkı varlığı nedeniylepment. 1,11-14. Böylece, bir can a) tamamen sentrozom oluşumunu ortadan kaldırmak ve b) (maternal katkı tükendikten sonra, bir mutant bağlamda maternal katkısı ile erken embriyo kuruldu normal sentrozom kaderini çalışma çalışma mutasyonlar yöntemin prensibi ) 11 'de tarif edilmektedir.
- Centrosome etiketlemek genetik olarak kodlanmış floresan etiketleri ile fonksiyonel transgenler mevcuttur. Bu hatların çoğu güçlü aşın önlemek amacıyla transgenin transkripsiyonu sürmek için protein kendi promotörü kullanın. Proteinlerin aşırı ekspresyonu çoğu zaman sentrozom fonksiyonu 1,11 analizi müdahale eserler ile sonuçlanır, çünkü bu özellikle önemlidir.
- Centriole ve sentrozom böylece görüntüleme ile sentrozom hızlı ve kolay bir analiz için izin veren, Drosophila spermatogenez boyunca benzersiz uzunluğundadır.
- Spermatogenez ve sentrozom b ardışık adımlariology sperm kök hücrelerinin sentrozomlarla birlikte testis ucunda başlayan ve olgun sperm hücreleri azalmış centrosome boyutu ve aktivite (Şekil 1 ve 2) ile testislerin alt biten, testis boyunca kronolojik düzenlenmektedir. Bu sperm gelişimi farklı aşamalarında sentrozom fonksiyonu kolay tanımlama ve analiz sağlar.
- Testisler kolayca erkek larva, pupa ve yetişkin 27 disseke.
- Spermatogenez sırasında, sentrozom ve sentriyoller birden Kompozisyonal, yapısal ve mitoz, mayoz ve kirpik oluşumu işlev fonksiyonel devletler ile devam edin. Bu işlemler sırasında, hücrenin belirli bölümlerine centrosome monte ediyor, çiftleri, göç eder, çapa, olgunlaşır, bölme, ve bir cilium oluşturur. Bundan başka, olgun spermatid en centriole PCL 1 adlı bir centriolar ön neden olur. Ayrıca, olgun spermatid olarak, sentrozom bir işlem c uğrarbirçok PCM bileşenleri ve Sentriyol (Şekil 1 ve 2) kaybeder nereye centrosome azalma lerinizin. Böylece, testislerde çalışmalar böyle bir kök hücrelerinde sentrozom tutma, centriole çoğaltılması, centriole istikrar, centriole uzama, centriole ayırma ve tecrit, PCM işe alım, ciliogenesis, PCL oluşum, sentrozom azaltılması, ve gibi sentrozom hayatın çoklu yönlerini ele izin diğerleri arasında astral mikrotübül çekirdeklenme.
- Son olarak, sentrozom biyoloji çalışmaları bu biyolojik çalışmalar için tercih edilen bir model organizma yapmış Drosophila diğer iyi bilinen özelliklerine göre destekli vardır. Bunlar, kısa bir süre üretimi, genetik kolaylığını, hem de rasgele ve yer yönlendirmeli mutagenez yer alır.
Birlikte, Drosophila testislerin yukarıda belirtilen özellikleri sentrozom, kolay, hızlı ve detaylı görüntüleme ile ele alınabilir bir model sağlar. Açıklanan tekniklerBu yazıda centriole oluşumu 11, centriole çoğaltılması 15, PCM işe 16, sentrozom yönetmelik 17, ve ciliogenesis 18 dahil centrosome biyoloji birçok yönlerini araştırmak için uygulanmıştır. Bu teknikler, aynı zamanda, öz değişmesine ait düzenleme 19, mil düzeneği 20 ve bir çok diğerleri arasında asimetrik bir kök hücre bölünmesi 21 sentrozom etkinlik olarak biyoloji diğer alanlarda sentrozom çalışma uygulanmıştır.
Genetik-etiketli centrosomal proteinleri ifade sinekler elde etmek ve erkek larva, pupa veya ergin sinek gelen testisler izole ile sentrozom başlar testisler görüntüleme. Bu sinekler çeşitli araştırma grupları mevcuttur 1,11,15,22-25. Larva testisler önce mayoz spermatogenezisin tüm aşamalarını içeren ve pupa veya yetişkin ölümcül mutasyonları analiz ederken yararlıdır. Ancak, Geç pupa veya genç adult testisler en sağlam ve spermatogenez tüm öncesi ve sonrası mayozdaki aşamalarını içeren, böylece analiz için onları tercih yapma. Sperm hücrelerinin sayısı uçucu yaş olarak azaldığı için, yetişkin testis kullanımı da yaşlanma. 26 bağlamında sentrozom çalışmak için uygundur. Beyaz sinek testis izolasyonu için bir yöntem, daha önce 27 tarif edilmiştir.
Sentrozomlarla ve Drosophila testislerde kendi fonksiyonu görüntüleme burada (Şekil 3) sunulmaktadır ilişkili üç parça ile elde edilebilir. Parça en uygun olan seçimi araştırmacı ele alıyor sorunun doğasına bağlıdır.
Parça canlı testis görüntüleme içerir. Bu üç parça en hızlıdır ancak örnekler muhafaza edilmesi için ve immün zaman gerekli değildir gerekmez yalnızca uygulanabilir. Parça A, testis slaytlar üzerinde (bozulmamış, delinmiş veya kesilmiş) monte edilirve dikkatli bir şekilde kolayca tanımlanabilir hücrelerin tek bir tabaka oluşturmak için bir coverslip altında ezilmiş. Hücreler daha sonra, faz kontrast mikroskopisi ve floresan mikroskobu her ikisini de kullanarak görselleştirilir. Bu iletilen aydınlatma diğer biçimleri ile görülemez ve bu nedenle geliştirme sperm 28,29 çeşitli aşamalarında hızlı tanımlama sağlayan hücre bilgileri ortaya çıkarır, çünkü faz-kontrast kullanılması Drosophila testisler analizi için özellikle önemlidir. Ancak, Parça iki ana dezavantajı vardır. Testisler yırtılmış kez Birincisi, hücrelerin morfolojik bütünlüğü sık sık tehlikeye düşer. İkinci olarak, tespit edilmemiş hücreler bazen zor belirli bir bölgede çok sayıda eş odaklı tabakalarının görüntüleme yapma, numune içinde hareket. Spesifik hücre tipleri analizini geliştirmek için, testis delinmiş ya da testis kırılmalar gibi lamel minimal altında ezme, ilgi konusu hücre tipi morfolojisini etkiler şekilde yönlendirmek için kesilebilir.
Parça B testislerin kimyasal tespit içerir. Bu parça numune hazırlanması için bir ara zaman gerektirir ve sabit numuneler sonraki analiz için saklanır avantajına sahiptir. Bundan başka, sabitleme görüntüleme sırasında numunenin hareketi en aza indirerek, hücresel yapılar daha sert hale getirmek için hizmet eder. Bununla birlikte, faz-kontrast mikroskobu tespit etmek zor sperm bazı gelişim aşamaları yapma, kimyasal sabitleme sonra çok daha az bilgi olur.
Parça C zaman yoğun, ama en uygun genetik etiketleri ile mevcut değildir proteinlerin görselleştirme için izin, hücresel yapılar sabit ve immunohistokimyasal olduğu yararı vardır. Drosophila testislerde centrosomes ve sentrozom ilgili yapıların immünboyama için pek çok antikorlar hem ticari ve çeşitli araştırma grupları vardır.
Protocol
1.. Canlı Testislerin İz A. Hazırlanması
- 8.0 g NaCl, 0.2 g KCI, 1.44 g 2 HPO 4, 0.24 g KH 2 damıtılmış su içinde 800 ml PO 4 Na eritilmesi ile PBS hazırlamak ve pH'ı 7.4 'e ayarlayın. 1 L ses getirmek ve otoklav ile sterilize edin.
- Daha önce tarif edildiği gibi 27 testisler izole edin.
- PBS içinde 1 ug / ml için 1 mg / ml stok seyreltilmesi DAPI boyama tamponu hazırlayın. -20 ° C'de ışık ve deposundan tüp korumak için alüminyum folyo kullanarak
- Testisler izole edildikten sonra, 10 dakika boyunca, pozitif yüklü bir cam mikroskop slayt üstüne DAPI lekeleme tampon 6 ul numune bırakın. Deneyler, numunenin kolay manipülasyon sağlayan, ticari olarak temin edilebilir, pozitif yüklü bir slaytlara iyi yapışırlar. Pozitif yüklü slaytlar kovalent olarak cam yüzeyine sabit bir pozitif yük vermek için modifiye edilir. Polilizin kaplamaya benzer, bu testisler wi etkileşimi teşvikslayt yüzeyini inci.
- 6 ul PBS ile iki defa lekeleme tampon maddesi değiştirerek fazla DAPI yıkayın. Her bir yıkama aşamasından sonra tampon fitil için bir filtre kağıdı parçası kullanın. Yanlışlıkla her yıkama sırasında tampon ile birlikte testisler kaldırmak değil, dikkatli olun.
- Örnek PBS 6 ul ekleyin. Kullanılan tampon miktarı lamel boyutu için ayarlanmalıdır. Bu protokol sağlanan miktarlar, bir 18 x 18 mm örtücü kısım içindir. İsteğe bağlı: Bu ilgi, hücre tipi göreli konumu yakınında testisler delmek için tavsiye edilir. Bu sayede yapısal bütünlüğünün muhafaza, ezme aşaması esnasında, bu hücreler üzerinde minimum baskı olmasını sağlayacaktır. Testislerin Piercing keskin, temiz bir neşter kullanılarak yapılabilir.
- Dikkatlice numune üstüne bir lamel yerleştirin.
- Tampon canlı örnekten buharlaşma olmaz sağlamak için şeffaf tırnak cilası kullanarak lamel kenarları mühür ise imyaşlanma.
- Slaytta numune yerini kolaylığı için testislerin konumunu belirlemek ve görüntülemeye devam etmek için bir kalem kullanın.
- 6 ul PBS ile iki kez tampon değiştirerek fazla DAPI boyama tamponu yıkayın. Her bir yıkama aşamasından sonra tampon fitil için bir filtre kağıdı parçası kullanın. Yanlışlıkla her yıkama sırasında tampon ile birlikte numune çıkarmak için dikkatli olun.
2. Sabit Testislerin İz B.
- 1x PBS içinde% 3.7 formaldehit bir son konsantrasyona PBS içinde% 37 formaldehit stok çözelti seyreltilerek Fix tamponu hazırlayın
- PBS içinde 1 ug / ml için 1 mg / ml DAPI stokları seyreltilerek DAPI boyama tamponu hazırlayın.
- Pozitif yüklü bir cam mikroskop slayt üstüne PBS 6 ul damla testisler bırakın.
- El ile doğrusal bir şekilde ya da başka şekilde tercih testisler yönlendirin.
- PBS fitil ve Fix 6 ul ile değiştirmek için filtre bir parça kağıt kullanın5 dakika boyunca tampon.
- Fix tampon fitil ve 10 dakika için DAPI lekeleme tampon 6 ul numune sokmak için bir filtre kağıdı parçası kullanın.
- Dikkatlice numune üstüne bir 18 x 18 mm lamel yerleştirin.
- Görüntüleme sırasında tampon örnekten buharlaşmaz sağlamak için şeffaf tırnak cilası ile lamel kenarları sıkıca kapatın.
- Slaytta numune yerini kolaylığı için testislerin konumunu belirlemek ve görüntülemeye devam etmek için bir kalem kullanın.
3. Immunostan Testislerin İz C.
Lamel siliconization: silikonlaştırma çözeltisi ihtiva eden küçük bir tepsi içinde birden çok 18 x 18 mm lamelleri daldırın ve bir davlumbaz altında oda sıcaklığında 1 dakika boyunca inkübe edin. Lamelleri tamamen açık ve birbiri üstüne yığılmış değildir emin olun.
- Silikon lamel PBS, 5 ul damla numune yerleştirin. Orienttestis istenen ve keskin bir neşter kullanılarak testisi delmek gibi. Nazikçe PBS eşit lamel ile kızak arasında olacak şekilde dağılmış halde sağlayan, lamel üzerine, pozitif yüklü bir cam mikroskop slayt yerleştirin. Lamel ve slayt arasındaki aşırı tampon fitil filtre kağıdı küçük bir parça kullanın. Tampon filtre kağıdı ile çıkarılır gibi, basınçtaki artış testisler kabak olacaktır. Bazı protokol boyunca kayıp ya da hasarlı olabilir gibi birçok örneği, aynı anda hazırlanmalıdır. Numunelerin farklı eş zamanlı olarak hazırlanacak ise bir cam slaytlar gravür etiketlemek için kullanılabilir.
- 1% 70 etanol içinde 1 dakika her biri için 3 kat, ardından su içinde dakika her biri, ve su içinde 1 dakika boyunca son bir yıkama için lamelleri 3 kez yıkayın. Davlumbaz altında kurumaya silikonlu lamelleri izin verin.
- Sıvı azot içine slaytlar ve numune 5-10 dakika boyunca dondurmak için izin verir.
- L slaytları çıkarınBüyük bir forseps kullanılarak azot iquid. Hızla lamel kaldırmak için bir neşter kullanın. Örnek slayt üzerinde kalmalıdır. Slayt boyunca lamel kaydırarak bu süreçte örnek smear için dikkatli olun.
- 15 dakika boyunca -20 ° C'de, bir cam kavanoz içinde Coplin boyama önceden soğutulmuş metanol slaytlar inkübe edin.
- 30 saniye boyunca -20 ° C'de önceden soğutulmuş aseton ihtiva eden bir cam kavanoza Coplin boyama slaytlar aktarın.
- , Bir cam kavanoz Coplin boyama kullanılarak oda sıcaklığında PBS içinde 1 dakika boyunca slaytlar yıkayın.
- % 0.1 Triton-X100 ve% 1 sığır serum albumeni (BSA) ile takviye PBS ile PBST-B hazırlayın. (Adım 3.14 'dan itibaren), ikincil antikor olarak aynı ev sahibi türünden% 5 normal serum spesifik olmayan ikincil antikor üretilen arka plan gürültüsünü azaltmak için yerine BSA kullanılabilmektedir.
- Spesifik olmayan siteleri engellemek için, bir cam kavanoz içinde Coplin boyama PBST-B, 10 dakika boyunca kuluçkaya bırakın.
- Bir kuyu doldurunsu ile nem odası. Bölmesi içindeki nem inkübasyon adımları sırasında numune antikor çözeltileri buharlaşmasını en aza indirecektir.
- 100 ug / ml RNase A RNase A örnekte RNA düşürür ve ayrıca cam yüzeyine güçlü bir şekilde emerek ilave bir bloke etme maddesi olarak hizmet ile PBST-B ilave tarafından PBST-BR hazırlayın.
- Eşit antikor çözüm yaymak ve buharlaşmasını antikor çözeltisi korumak için numune üstüne Parafilm yaklaşık 1x1 cm parça yerleştirin. Nem odası kapatın ve oda sıcaklığında 1 saat için primer antikor içinde numune inkübe edin.
- PBST-B slaytları çıkarın. Numune kendisi kurutmak için değil dikkatli kullanarak, numune etrafında slayt alanını kuru filtre bir parça kağıt kullanın. Son olarak, numune yukarı bakacak şekilde nem odası içinde yer slayt
- Yavaşça spec üstünde PBST-BR içinde seyreltilmiş birincil antikor, 100 ul ekleimen (1:200 genellikle uncharacterized antikorlar için iyi bir başlangıç konsantrasyonu).
- Parafilm yaklaşık 1 cm x 1 parça ile numune örtün ve nem odası kapatın. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca sekonder antikor olarak numune inkübe edin.
- Nem odasını açın ve yavaşça slayt Parafilm çıkarmak için forseps kullanabilir. Yıkamak için, oda sıcaklığında, bir cam kavanoz içinde Coplin boyama PBST içinde 5 dakika boyunca kuluçkaya bırakın. Üç yıkar toplam için bu işlemi tekrarlayın.
- PBST-B slaytları çıkarın ve örnek yukarı bakacak şekilde nem odasına koyun. Yavaşça numune üstüne PBST-BR içinde seyreltilmiş sekonder antikor, 100 ul ilave edin.
- Nem odasını açın ve yavaşça slayt Parafilm çıkarmak için forseps kullanabilir. Yine, PBS içinde 5 dakika her biri için 3 kat ve ardından bir cam kavanoz içinde Coplin boyama PBST içinde 5 dakika için, her numune 3 kez yıkayın.
- Kimwipe ve filtre kağıdı için kullanın dikkatli dokunmaktan veya numune kurumasını önlemek için dikkatli olmak, slayt yüzeyini kurulayın.
- , Numune için Montaj Medya 6 ul ekleyin (silikon ile kaplı olmayan) temiz bir lamel ile kaplayın ve mühür oje ile kenarları.
- Slaytta numune yerini kolaylığı için testislerin konumunu belirlemek ve görüntülemeye devam etmek için bir kalem kullanın.
4. Görüntüleme Notlar
Görüntüleme dik veya ters normal bir ışık mikroskobu veya konfokal mikroskop kullanılarak elde edilebilir. Bu mikroskop özellikle canlı testis örneklerinde (Parça A) görüntüleme için, faz-kontrast ile donatılmış olması önemlidir. Bu özellik, son zamanlarda konfokal mikroskoplar kullanılabilir hale gelmiştir.
Testisler kendiliğinden (Track A) kestiğinizde, ucu (hücre bölgesini kök), genellikle başlangıçta bulmak ve yönlendirme için kullanmak iyi bir işaretleyici sağlayan sağlam tuttu ve kolayca tanımlanabilir olmasıdır.
_content "> sentriyoller oldukça küçük yapılardır ve görüntüleri nedenle 63X veya 100X hedefleri, 4-6X yakınlaştırma faktörü kullanılarak alınmalı ve mümkün olan en az 512 x 512 piksel çözünürlük.Representative Results
Sentrozomlar spermatogenez boyunca birden fazla morfolojik ve fonksiyonel dönüşmeliler. Spermatogenez Bu karakteristik testisler centrosome biyolojinin çeşitli yönlerini incelemek için yararlı bir sistem yapar. Bu tür bir işlem hali hazırda gözlenmiştir sentrozom uzama olduğunu. Spermatogonia olarak, centriolar işaretleyici Ana1-GFP 0.6 mikron uzunluğunda centriole (Şekil 4a) işaretler. Bu centriole spermatogenez sırasında uzatır ve yaklaşık olgun spermatidler 2,5 mikron uzunluğunda ulaşır. Drosophila sperm sentriyoller benzersiz uzun olduğu için, görüntüleme sentrozom uzama (Şekil 4b) ile ilgili kantitatif ifadeler için de kullanılabilir. Centriole uzunlukta analizi de bir mutant arka planda gerçekleştirilebilir ve çeşitli mutantlan centriole büyüme (Şekil 5) değiştirmek olduğu tespit edilmiştir. Örnekler (aly) her zaman erken ve nefis (can), mutasyonlar olduğunu arrest spermatogenez mayoz 30 başlangıcından önce ama centriole uzama blok yok. Bu mutantlar olarak, olgun spermatosit bir sentriyoller 1.8 um maksimum ulaşmak kontrol hücrelerinin sentriyoller kıyasla yaklaşık ~ 2.4 um büyür.
Şekil 1. Spermatogenez ve Sentrozom Biyoloji. Kök Hücreler ve spermatogonia A) Development. Tüm sperm hücreleri testislerde apikal ucunda bulunan Kök Hücre kaynaklanır. Her Kök Hücre anne centrosome ve kızı centrosome 31 devralan bir ata spermatogonyum devralan Kök Hücre oluşturmak için asimetrik böler. Spermatogonia form olarak, onlar spermatogenez boyunca spermatosit ve Spermatid çevreleyen devam 2 kist hücreleri tarafından çevrili olmak. Spermatogonia bölmek 4 kere her iki sentriyoller. B içeren 16 spermatogonia) spermatosit ve Mayoz Kalkınma üretmek. Spermatosit gelişimi sırasında, sentriyoller hücre başına iki çift ve kist başına 64 sentriyoller organize dört sentriyoller oluşturmak için bir kez daha çoğaltın. Erken spermatosit gelişimi sırasında, her centriole buna plazma zarı, rıhtım hareket eder, ve bir birincil kirpik 18,32-34 benzer bir yapı oluşturmak üzere uzatır. Olgun spermatositlerde, centriole boyu ~ 1.8 mikron ulaşır. Sentrozomlar mayoz önemli bir rol oynamaktadır. Mayoz sırasında, hala hücrenin merkezine doğru hareket plazma zarı eklenmiş ve uzak ucunda, hücre membranı invaginations yaratmaktadır centriole çiftleri. Sentriyoller etrafında PCM, büyür astral Mikrotübülleri çekirdekleşirken ve iğ kutup colocalizes. Yalnızca tek bir centriole presen böylece mayoz II için geçiş sırasında centriole çift ayırırHer iğ kutup. C) Spermiyogenez de t. Mayoz II sonunda, Erken yuvarlak spermatid invajine olduğ plazma membranına bağlı tek Sentriyol sahiptir. Büyük yuvarlak mitokondriyal türev çekirdeğinde yakınında bulunan ve daha sonra ilerleyen Yuvarlak spermatidler büyüyen axoneme boyunca uzamaya başlar. Spermatogenez sırasında, sitoplazma içindeki axoneme formları ve uzatır. Buna ek olarak PCL (Proksimal Sentriyol gibi) olarak bilinen yeni bir centriolar yapı önceden var Sentriyol 1. yanında görünür. Spermatogenez sonunda, ortak bir kist paylaşan hücrelerin tam olgun sperm hareketli olmak için birbirinden ayrılır. Spermatosit geliştirme (B) ve Spermiyogenez (C) şemaları sırasıyla kist başına 16 spermatositlerin dışında tek bir hücre ve 64 spermatid tasvir ve kist hücreleri tasvir yok. büyük görüntülemek için buraya tıklayınr rakam.
Şekil 2. Drosophila Testisler. Pan-centriolar işaretleyici Ana-1-GFP ifade eden tüm montaj testisin bir faz kontrast ve GFP floresan mikrograftaki bir bindirme. Panellerin Şekil 1 1-3 tekabül ayrı alan Hücreler ve spermatogonia, B) spermatosit ve mayoz, C) spermiogenez Stem) bir kesik kırmızı çizgi A ayrılır.
Şekil 3,. Drosophila Testislerin Imaging centrosomes doğru izler.
Şekil 4. Sentrozom Uzama Spermatogenez sırasında. A) Her aşamada bir faz-kontrast görüntü (solda), floresan görüntü (orta) ve sentrozom büyütülmüş görüntüsü (sağda) gösterir. Faz-kontrast görüntü hücre çekirdeği, çekirdekçik ve mitokondri konumu ve morfolojiye göre özel bir hücre aşamasında göstermektedir. Floresan görüntü DAPI (mavi) ile boyandı DNA gösterir. Sentrozom görüntü Asterless-GFP (Asl, üst görüntüleri) ve Ana1-GFP (Ana1, alt görüntü) ile etiketli centrosomes gösterir. Beyaz bir daire hem faz-kontrast ve floresan görüntüler hücre zarı vurgulamaktadır. Beyaz kesikli çevreler ve floresan görüntüde gri daire sırasıyla, çekirdek ve çekirdekçik konumunu vurgulamak. Y-kromozom için sarı oklabazı döngüler. Kırmızı daire mitokondri işaretlemek kesik. Aşamaları 1-6 29 belirtmektedir ve 13-17 32 hücre aşamaları açıklamasına atıfta aşamaları. Aşama 1: İlköğretim spermatosit. Küçük bir hücrede testisin bir ipucu olarak tanımlanmıştır. Evre 2a: Polar spermatosit. Çekirdeğin bir tarafında bir kapak mitokondri varlığı ile tanımlanır. Aşama 3: Apolar spermatosit. Birincil spermatosit ve mitokondri başlığın eksikliği daha büyük bir nispi ebatları ile tanımlanır. Evre 4: İlköğretim spermatosit. Her 3 Y-kromozomu döngüler: tüm görünüşü belirledi. Evre 5: Olgun İlköğretim spermatosit. Nükleer boyutunda biraz daha bir artış ile tanımlanır Spermatogenez üretilen büyük spermatosit. Aşama 6: Premeiotic İlköğretim spermatosit. Y-kromozomu döngüler parçalanır ve çekirdek kayboluyor. Sahne 13: Soğan Sahne spermatid. Eşit büyüklükte çekirdeği ve mitokondri içeren yuvarlak hücre. Sahne 17: Geç spermatid. Bir bundl parçası olmaya devam uzatılmış bir spermatid olarak tespittestislerin üssü yakınlarında bulunan çekirdekleri ile 64 spermatidlerin e., Çekirdekler seminal kesede bulunan olgun spermatidler biraz daha geniş. Ölçek çubukları, 10 um ve 1 um. B) Grafik Asterless-GFP (mavi) ve Ana1-GFP (yeşil) ile ölçülen her aşaması için ortalama ve standart sapma gösteriyor. Sahne 6, Asterless-GFP (mavi) ve Ana1-GFP (yeşil) ortalamaları ve standart sapmaları örtüşen ve sadece Asterless-GFP (mavi) açıktır. Sahne 13 başlayarak, Asterless-GFP bütün Sentriyol süslemek değildir ve ölçümler (ND) tespit edilmedi.
Şekil 5,. Sahne anormal Uzun sentriyoller 6 Aly spermatosit ve can mutantlar. Bütün testis ve temsili centrosome la floresan panelinin AC) Işık mikrografıAna1-GFP tarafından beled. Aly içinde testislerin anormal şeklini not ve can Grafik ortalama, standart sapma gösteriyor ve vahşi tür centriole uzunluğu veri dağıtım, aly ve can) mayotik tutuklama bir sonucu. D gibi spermatidlerin bir eksikliğinden kaynaklanan mutantlar, . Her bir veri noktası için örnek sayısı parantez içindedir. Ölçek çubuğu, 1 mikron.
Discussion
Genetik-etiketli centrosomal işaretlerini kullanarak sinek testislerde centrosome biyoloji okuyan vahşi-tip ve mutant bağlamda hem sentrozom fonksiyonu ve etkinliğini değerlendirmek için yararlı bir yöntemdir. Özellikle, Parça A gibi malformasyon, misegregation, instabilite ya da yeni mutantlann tespit edilmesi için bir çaba anormal uzunluğu centrosomal anormalliklerin hızlı taranması için uygundur. Ayrıca, canlı hazırlıklarına spermatid kirpikler yaklaşık 15 dakika sonra diseksiyon ve sperm hareketliliğini kolayca ele alınması için takip A canlı testis kullanımı da olanak için hareketli kalır. Sperm hareketli siliyaların aktivitesi, sentrozom fonksiyonu ile ilişkili olduğu için, deneyler, siliyer fonksiyonu çeşitli centrosomal mutasyonların etkilerini belirlemek için gerçekleştirilebilir. Parça B istatistiki veriler, hücre ve kist veya başına hücre sayısı başına sentriyoller sayısının sayılması için gerektiği gibi, özellikle daha özel gözlemler için kullanılabilir. Parça C en FAYDALI olduğunuantikorlarla boyama gerektiren ayrıntılı gözlemleri için l. Örnekleri arasında, kök hücre, örneğin asetillenmiş tübülin gibi uygun bir etiketi yok, ya da bir mutant bir proteinin yokluğunun ya da mislocalization kontrol etmek için bir protein boyama gibi belirli bir hücre tipi etiketleme içerir.
Genetik işaretleyiciler-etiketli antikorlar kullanılarak yerine, centrosomes ve sentrozom ilgili yapıları görüntüleme zaman sadece deneysel daha kolay olmakla birlikte, aynı zamanda daha sağlam ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlar. Bu nedenle, genetik olarak centrosomal-etiketli proteinlerin kullanımı büyük bir veri seti gerektiren mekanik ve kantitatif analiz için güvenilir bir yaklaşımdır. Örneğin, genetik olarak-etiketli centrosomal markerlerin kullanımı centriole uzunluğunun ölçümü için özellikle değerlidir. Bu tür bir analiz, çeşitli mutasyonlar centriole uzunluğunda değişkenliğine göre iki kategoriye ayrılabilir olduğunu ortaya koymuştur. Bir kategori mutasyon içeren kanalge centriole uzunluğu, ancak standart sapma 1 ve diğer kategori etkilemez centriole uzunluk ve uzunluk 11 standart sapma etkileyebilir mutasyon içerir. Böyle nicel veriler belirli centrosomal genlerin fonksiyonu içine yararlı bilgiler sağlayabilir. Standart sapma artış ile arızalı centriole uzunluğunu gösterirler centrosomal mutantlar centriolar yapısının bir istikrarsızlığa bağlı olabilir. Ancak, normal bir standart hata ile kusurlu centriole uzunluğu mutasyon yapısal Sentriyol destabilize nedeniyle centriole uzunluğunun kontrol düzenleyici mekanizmasının bir değişiklik olması daha muhtemel değildir olduğunu gösteriyor olabilir. Nedeniyle imüno tutarsızlıklara yol, kantitatif analiz, tek başına antikor markerlerin kullanımı ile zordur.
Sentrozom bir büyük, karmaşık proteinli yapısı ve proteinlerin çoğu sadece kendi iç içinde bulunur. Genetik-etiketli centrosomal kullanmaantikorlardan ziyade belirteçleri bir sürekli epitoplar antikor belirteçleri aksi erişilemez olabilir sentrozom iç bileşenlerini etiketlemek sağlar. Bld10-GFP daha homojen bir dağılım 1 göstermektedir Örneğin, Bld10 antikorları kullanarak lokalizasyonu çalışmaları, protein, Sentriyol 13'ün uzak ve yakın uçlarında zenginleştirilmiş bulur. Bununla birlikte, bu protein dağılımını etkileyebilir gibi, belirli bir genetik etiketli protein ekspresyon düzeyini dikkate almak da önemlidir. Sas-4-GFP ve SAS-6-GFP lokalizasyonu kendi endojen altında ifade Öte yandan Sentriyol 1,16,35 proksimal uçları ile sınırlandırılmıştır, Sas-4-GFP ve SAS-6-GFP altında eksprese Güçlü ubikutin promotör centriole 12,14 tüm uzunluğu boyunca lokalizedir. Diğer bir önemli husus protein fonksiyonu üzerindeki imuno isaretinin etkisidir. Genetik-etiketli proteinlerin fonksiyonel olup olmadığını analiz tes olabilirted bir mutant arka plana transgenik protein tanıtan ve transgenik protein mutant fenotip kurtarır eğer inceleyerek.
Drosophila testislerin Fixation kimyasal fiksatif çeşitli kullanılarak yapılabilir. Burada, formaldehit (Track B) ve metanol-aseton (Parça C) hem de tespit açıklar. Ancak, sabitleyici ya da birbirinin yerine kullanılabilir ve çeşitli kimyasal sabitleyici ana antikor epitoplarını bozabilir olabilir çünkü, immün için uygun sabitleyici seçimi deneysel olarak tespit edilmelidir. Aşağıdaki kuluçka şartları fiksatif ve yaygın şekilde kullanılmaktadır:% 3.7 formaldehid, oda sıcaklığında 5 dakika, metanol, -20 ° C'de 15 dakika, aseton, -20 ° C'de 10 dakika, metanol, 15 dakika -20 ° C'de ° C. aseton, -20 ° C'de 30 saniye, ardından, etanol, 20 dakika -20 ° C'de ° C. Aseton, metanol ve etanol ile tespit immüno-boyama, tespit wi için uzatılmış permeabilizasyon aşamasını gerektirmeyen, ancakth formaldehit hücre zarının geçirgen ve hücre içi epitopuna antikor erişim sağlamak için oda sıcaklığında PBST-B içinde 1 saat kuluçkaya bırakma takip edilmelidir. Ayrıca, bazı sabitleyici özel antijen için daha uygundur. Örneğin formaldehit işlevleri de küçük proteinlerin tespiti için, oysa metanol ve aseton büyük moleküler kompleksler 36 tespiti için çok uygundur.
Drosophila testislerin immün önce kromatin yapısı ve 29,37 iskeleti mikrotübül gözlemlemek için tarif edilmiştir. Burada (Parça C), prosedür genetik olarak etiketlenmiş proteinleri içeren centrosomal yapılarının analizi için optimize edilmiştir. Biz Drosophila testislerde çalışan deneyimsiz bireyler rehberlik etmek, bu prosedürün detaylı bir açıklama sağlar. Bu işlem aynı zamanda s kullanarak gibi testis, korunması ve şekil geliştirmek modifikasyonları da içerirlamelleri ve pozitif yüklü cam mikroskop slaytlar iliconized.
Disclosures
Bu yayın için ücretsiz erişim Leica Microsystems tarafından desteklenmiştir.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH ve Genel Sağlık Bilimleri Ulusal Enstitüsü hibe (R01GM098394) yanı sıra Ulusal Bilim Vakfı hibe 1121176 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Positively Charged Slides | AZER Scientific | EMS200A+ | |
| Feather Microscalpel | Electron Microscopy Sciences | 72045-30 | |
| 37% Formaldehyde or Paraformaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Boston Bioproducts | BM-220 | |
| 18x18 mm coverslips number 1.5 | VWR | 48366 205 | |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100 ml | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| Acetone | Fisher Scientific | A949-1 | |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T9284-100ML | |
| BSA | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| RNAse A | 5 prime | 2900142 | |
| Filter paper | Whatman | 1001-055 | |
| Glass engraver | Dremel | 290-01 | |
| TCS SP5 confocal microscope | Leica | ||
| Mounting Media | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
| Immuno Stain Moisture Chamber, Black | Electron Microscopy Sciences | 62010-37 | |
| Glass Coplin Staining Jar, Screw Cap | Electron Microscopy Sciences | 70315 |
References
- Blachon, S., et al. A proximal centriole-like structure is present in Drosophila spermatids and can serve as a model to study centriole duplication. Genetics. 182, 133-144 (2009).
- Hennig, W. Spermatogenesis in Drosophila. The International journal of developmental biology. 40, 167-176 (1996).
- Fabian, L., Brill, J. A. Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages. Spermatogenesis. 2, 197-212 (2012).
- White-Cooper, H. Molecular mechanisms of gene regulation during Drosophila spermatogenesis. Reproduction. 139, 11-21 (2010).
- Davies, E. L., Fuller, M. T. Regulation of self-renewal and differentiation in adult stem cell lineages: lessons from the Drosophila male germ line. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 73, 137-145 (2008).
- Belote, J. M., Zhong, L. Duplicated proteasome subunit genes in Drosophila and their roles in spermatogenesis. Heredity. 103, 23-31 (2009).
- Xiao, X., Yang, W. X. Actin-based dynamics during spermatogenesis and its significance. Journal of Zhejiang University. Science. B. 8, 498-506 (2007).
- Hennig, W. Chromosomal proteins in the spermatogenesis of Drosophila. Chromosoma. 111, 489-494 (2003).
- Wakimoto, B. T. Doubling the rewards: testis ESTs for Drosophila gene discovery and spermatogenesis expression profile analysis. Genome research. 10, 1841-1842 (2000).
- Avidor-Reiss, T., Gopalakrishnan, J. Building a centriole. Curr Opin Cell Biol. , (2012).
- Blachon, S., et al. Drosophila asterless and vertebrate Cep152 Are orthologs essential for centriole duplication. Genetics. 180, 2081-2094 (2008).
- Basto, R., et al. Flies without Centrioles. Cell. 125, 1375-1386 (2006).
- Mottier-Pavie, V., Megraw, T. L. Drosophila bld10 is a centriolar protein that regulates centriole, basal body, and motile cilium assembly. Mol Biol Cell. 20, 2605-2614 (2009).
- Rodrigues-Martins, A., et al. DSAS-6 Organizes a Tube-like Centriole Precursor, and Its Absence Suggests Modularity in Centriole Assembly. Curr Biol. 17, 1465-1472 (2007).
- Stevens, N. R., Dobbelaere, J., Brunk, K., Franz, A., Raff, J. W. Drosophila Ana2 is a conserved centriole duplication factor. J Cell Biol. 188, 313-323 (2010).
- Gopalakrishnan, J., et al. Sas-4 provides a scaffold for cytoplasmic complexes and tethers them in a centrosome. Nat Commun. 2, 359 (2011).
- Gopalakrishnan, J., et al. Tubulin nucleotide status controls Sas-4-dependent pericentriolar material recruitment. Nat Cell Biol. 14, 865-873 (2012).
- Riparbelli, M. G., Callaini, G., Megraw, T. L. Assembly and persistence of primary cilia in dividing Drosophila spermatocytes. Dev Cell. 23, 425-432 (2012).
- Maines, J. Z., Wasserman, S. A. Post-transcriptional regulation of the meiotic Cdc25 protein Twine by the Dazl orthologue Boule. Nat Cell Biol. 1, 171-174 (1999).
- Herrmann, S., Amorim, I., Sunkel, C. E. The POLO kinase is required at multiple stages during spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Chromosoma. 107, 440-451 (1998).
- Yamashita, Y. M., Jones, D. L., Fuller, M. T. Orientation of asymmetric stem cell division by the APC tumor suppressor and centrosome. Science. 301, 1547-1550 (2003).
- Dix, C. I., Raff, J. W. Drosophila Spd-2 Recruits PCM to the Sperm Centriole, but Is Dispensable for Centriole Duplication. Curr Biol. , (2007).
- Stevens, N. R., Dobbelaere, J., Wainman, A., Gergely, F., Raff, J. W. Ana3 is a conserved protein required for the structural integrity of centrioles and basal bodies. J Cell Biol. 187, 355-363 (2009).
- Giansanti, M. G., Bucciarelli, E., Bonaccorsi, S., Gatti, M. Drosophila SPD-2 Is an Essential Centriole Component Required for PCM Recruitment and Astral-Microtubule Nucleation. Curr Biol. , (2008).
- Januschke, J., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Drosophila neuroblasts retain the daughter centrosome. Nat Commun. 2, 243 (2011).
- Cheng, J., et al. Centrosome misorientation reduces stem cell division during ageing. Nature. 456, 599-604 (2008).
- Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster testes. J. Vis. Exp. , e2641 (2011).
- Fuller, M. T. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-174 (1993).
- Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis. J Cell Sci. . 107 (Pt. 12), 3521-3534 (1994).
- White-Cooper, H., Schafer, M. A., Alphey, L. S., Fuller, M. T. Transcriptional and post-transcriptional control mechanisms coordinate the onset of spermatid differentiation with meiosis I in Drosophila. Development. 125, 125-134 (1998).
- Yamashita, Y. M., Mahowald, A. P., Perlin, J. R., Fuller, M. T. Asymmetric inheritance of mother versus daughter centrosome in stem cell division. Science. 315, 518-521 (2007).
- Tates, A. D. Cytodifferentiation during Spermatogenesis in Drosophila melanogaster: An Electron Microscope Study. , Rijksuniversiteit de Leiden. Leiden, Netherlands. (1971).
- Baker, J. D., Adhikarakunnathu, S., Kernan, M. J. Mechanosensory-defective, male-sterile unc mutants identify a novel basal body protein required for ciliogenesis in Drosophila. Development. 131, 3411-3422 (2004).
- Avidor-Reiss, T., Gopalakrishnan, J., Blachon, S., Polyanovsky, A. The Centrosome: Cell and Molecular Mechanisms of Functions and Dysfunctions in Disease. Schatten, H. , Humana Press. (2012).
- Gopalakrishnan, J., et al. Self-assembling SAS-6 multimer is a core centriole building block. J Biol Chem. 285, 8759-8770 (2010).
- Hassell, J., Hand, A. R. Tissue fixation with diimidoesters as an alternative to aldehydes. I. Comparison of cross-linking and ultrastructure obtained with dimethylsuberimidate and glutaraldehyde. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 22, 223-229 (1974).
- Pisano, C., Bonaccorsi, S., Gatti, M. The kl-3 loop of the Y chromosome of Drosophila melanogaster binds a tektin-like protein. Genetics. 133, 569-579 (1993).
