V3 arbetsflöde är en western blot förfarande med fläckfria geler. Den fläckfria tekniken gör det möjligt för forskare att visualisera proteinseparationskvaliteten, för att verifiera överföringseffektiviteten, och viktigast av allt, validera förändringen i proteinet av intresse med hjälp av total proteink kvantifiering som en pålitlig lastkontroll.
Den västra fläcken är en mycket användbar och allmänt antagen labbteknik, men dess utförande är utmanande. Arbetsflödet karakteriseras ofta som en “svart låda” eftersom en experimentalist inte vet om det har utförts framgångsrikt förrän det sista av flera steg. Dessutom utmanas kvaliteten på västerländska fläckar ibland på grund av bristen på effektiva verktyg för kvalitetskontroll under hela den västra blottningsprocessen. Här beskriver vi V3 västra arbetsflödet, som tillämpar fläckfri teknik för att ta itu med de stora problemen i samband med det traditionella västra fläckprotokollet. Detta arbetsflöde gör det möjligt för forskare: 1) att köra en gel på ca 20-30 min; 2) att visualisera provseparationskvaliteten inom 5 minuter efter gelkörningen, 3) att överföra proteiner på 3-10 min; 4) att kvantitativt kontrollera överföringseffektiviteten, och viktigast av allt 5) för att validera förändringar i nivån av proteinet av intresse med hjälp av total proteinbelastningskontroll. Detta nya tillvägagångssätt eliminerar behovet av att strippa och reproducera fläcken för hushållningsproteiner som β-aktin, β-tubulin, GAPDH, etc. V3-fläckfria arbetsflödet gör den västra fläckprocessen snabbare, transparent, mer kvantitativ och pålitlig.
Western blot är en mycket användbar teknik9, men det finns två stora utmaningar med västerländsk blotting: lång och arbetsintensiv process och datakvalitet. Ett traditionellt protokoll kräver ca 2 dagar. Det innebär många steg inklusive provberedning, gelgjutning, proteinelektrofores och överföring, membranblockering följt av antikroppsinkubation, avbildning och ganska ofta strippning, återgivning och slutligen dataanalys. Under hela denna process finns det inga pålitliga och flexibla verktyg för processkontroll. Som sådan kan fel införas i varje steg, och dessa fel har potential att generera dataartefakter. Därför är lastningskontroller nödvändiga i västra blotting för att identifiera och korrigera för felen. Lastningskontrollen görs vanligtvis genom att kontrollera proteinnivån för ett referensprotein i varje prov för att se om det presenteras på samma sätt. Människor använder ofta hushållningsproteiner, β-aktin, β-tubulin, GAPDH, som lastkontroll.
Kvaliteten på västerländska fläckar beror på tillförlitlig lastkontroll. Men det finns två legitima farhågor när man använder hushållningsproteiner för lastningskontroll: 1) är den antikroppsbaserade immundetectionen av hushållningsproteinbanden ofta mättade och därför kan man inte skilja lastskillnaderna mellanproverna 30; 2) Städproteinuttrycksnivån kan variera i proverna under vissa experimentella förhållanden, till exempel siRNA-behandling, celldöd, celldidelning etc.11,28,3,6,10,21. På grund av dessa farhågor kräver vetenskapliga tidskrifter nu att “för kvantitativa jämförelser bör lämpliga reagenser, kontroller och bildframställningsmetoder med linjära signalintervall användas” (Naturriktlinje). På samma sätt ber redaktörer från Journal of Clinical Investigation om mer tillförlitliga lastkontroller24. Av dessa skäl måste ett hushållningsprotein valideras för att kunna användas som lastkontroll. För det första måste man se till att den mäts i immunodetectionmetodens linjära dynamiska intervall14,29. För det andra måste man se till att det uttrycks konsekvent i alla prover26,31,25,19,20.
En alternativ lösning till en tillförlitlig lastkontroll är att använda total proteinmätning från fläcken. Vissa forskare har färgat uppblåstheterna med totala proteinfläckar, såsom Coomassie, Flamingo Pink, Sypro Ruby, Amido Black, Ponceau S och fläckfri teknik, för att mäta den totala proteinsignalen i varje körfält som lastkontroll16,20,13,27,1,4,12. Den totala proteinbelastningskontrollen undviker fallgroparna i samband med hushållningsproteiner. För det första är det en sann återspegling av mängden protein som laddas för varje prov. För det andra uppvisar den totala proteinfläcken utmärkt linjärt dynamiskt intervall i det gemensamma belastningsområdet för western blot-analys (10-50 μg protein i ett komplext celllyat) och skiljer noggrant lastskillnaden mellanproverna 12.
Fläckfri teknik är en ny total proteinfärgningsmetod där en unik förening blandas i akrylamidgellösning och fördelas jämnt i den gjutna gelén. När elektroforesen är klar utsätts gelén för UV-ljus i minst 1 minut så att fläckföreningen reagerar med tryptofanresterna i proteinet. Proteinerna blir upphetsande under UV-ljus för att ge en stark fluorescerande signal som kan visualiseras och kvantifieras i en fläckfri aktiverad imager som ChemiDoc MP-systemet. Den fläckfria föreningen själv absorberar dock inte UV-ljus, vilket resulterar i låg bakgrund av gelbilden. Modifieringen av tryptofanresterna är irreversibel och proteiner kan visualiseras inte bara i gelén utan också på fläcken när som helst efter proteinöverföring.
Den fläckfria tekniken tillämpas i V3 Western Workflow (figur 1) för att ta itu med de stora klagomålen om det traditionella arbetsflödet, särskilt problemen med att använda städproteiner som lastkontroller. Med hjälp av detta arbetsflöde kan man: 1) köra en gel på ca 20-30 min, 2) kontrollera provintegritet och proteinseparationskvalitet på 5 minuter efter gelkörning; 3) överföra proteiner på 3-10 min; 4) kontrollera överföringseffektiviteten kvantitativt, och 5) viktigast av allt, validera förändringar i nivån av proteinet av intresse med hjälp av total proteinbelastningskontroll.
V3 fläckfria protokollet som beskrivs ovan är för multiplexerande fluorescerande västra blotting. Det kan också appliceras i västra blotting med hjälp av chemiluminescent detektion. I multiplex fluorescerande västra fläck protokollet förvärvas de fläckfria fläckarna vid två tidpunkter: 1) direkt efter proteinöverföring; 2) vid multiplex fluorescerande bildbehandling steg efter antikropp inkubation. Den första fläckfria bilden används för att beräkna överföringseffektiviteten och den andra fläckfria bilden används som laddningskontroll. När den chemiluminescerande metoden tillämpas är det inte möjligt att ta en multiplexbild för de fläckfria och målproteinsignalerna, eftersom den chemiluminescerande signalen också kommer att dyka upp i den fläckfria kanalen. I det här fallet rekommenderar vi att du använder den fläckfria bilden som tas direkt efter proteinöverföringssteget för lastkontroll och normaliseringsanalys.
V3:s västra arbetsflöde ger följande unika fördelar jämfört med det traditionella western blot-arbetsflödet som använder hushållningsproteiner som lastningskontroller:
För det första ger V3-arbetsflödet en praktisk, bekväm och mer tillförlitlig lastkontroll för att validera förändringarna i nivån på proteinet av intresse. V3-protokollet använder en total proteinbelastningskontroll för att normalisera nivån på det protein som är av intresse mätt i varje prov. Det undviker två fallgropar av att använda hushållningsproteinerna som lastkontroller: mättad immundetection och inkonsekventa städproteinuttrycksnivåer bland proverna under vissa experimentella förhållanden. Strippning och återebråelse av steg med antikroppar riktade mot hushållning är inte längre nödvändiga. Med hjälp av fläckfri teknik finns det inget behov av att fläcka och avfärga en fläck med fläckar som Coomassie eller Sypro Ruby för total proteinmätning. Det tar bara några sekunder att få en fläckbild och ca 5 min att göra total proteinnormalisering med Image Lab-programvara.
För det andra gör V3-arbetsflödet det möjligt för forskare att ta bättre kontroll över det västra förfarandet eftersom det gör proceduren mer transparent och introducerar flera kontrollpunkter för kvalitetskontroll. Med hjälp av fläckfri teknik kan forskare visualisera sina proteinprover på både gelén och fläcken. Forskare kan bedöma proteinprovets integritet (försämrad eller inte), separationskvalitet (fälld eller inte), överföringseffektivitet och överföringskvalitet (till och med överföring eller inte). Dessa kontrollpunkter hjälper forskare att avsluta experimentet när de ser stora brister i processen och undvika att slösa tid på dåliga prover och fläckar. Denna teknik hjälper också forskare att bedöma om det finns en betydande mängd proteinförlust efter membranborttagning och om fläcken är lämplig för att reproducera ett annat mål 4.
Här är några tips för att säkerställa god erfarenhet och kvalitetsdata med V3 western workflow.
Det är viktigt att notera att den fläckfria molekylen efter UV-aktivering är oåterkalleligt bunden till tryptofanrester. Denna irreversibla modifiering kan potentiellt påverka antigenigenkänning vid användning av monoklonala antikroppar om epitopen innehåller tryptofan. Polyklonala antikroppar påverkas sannolikt inte eftersom de känner igen flera epitoper på antigenet. Obundna fläckfria molekyler tvättas lätt bort från gelén och membranet och kommer därför inte att störa antikroppsantigeninteraktioner.
Sammanfattningsvis gör V3:s västra arbetsflöde den västra fläckprocessen snabbare, mer transparent, kvantitativ och mer tillförlitlig. Forskare kan nu enkelt tillämpa total proteinbelastningskontroll i ett västerländskt fläckexperiment för att göra sina data mer tillförlitliga. V3-fläckfria arbetsflödet har antagits av ett antal laboratorier, och deras publikationer har visat att tidskrifter accepterar fläckfria data som laddningskontroll i västrafläcken 22,17,7,8,5,23,18,15.
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Dr. Wolf-Dieter Stalz, Dr. Arnaud Remy, Dr. Anton Posch, Dr. Patricia Piatti, Tom Davies, Kris Simonyi och Jeff Durban för deras kritiska granskning och redigering av detta manuskript. Författarna tackar också Allison Schwartz för tekniskt stöd.
REAGENTS | |||
4-20% Criterion TGX Stain-Free Precast Gel | Bio-Rad | 567-8093 | Choose a gel size and percentage that meet the specific need in a experiment |
Trans-Blot Turbo Midi PVDF Transfer Packs | Bio-Rad | 170-4157 | Choose either PVDF or nitrocellulose and match the membrane size to the gel size |
Clarity Western ECL Substrate, 500 ml | Bio-Rad | 170-5061 | |
[header] | |||
EQUIPMENT | |||
Criterion Cell | Bio-Rad | 165-6100 | |
Trans-Blot Turbo Transfer Starter System | Bio-Rad | 170-4155 | |
ChemiDoc MP System | Bio-Rad | 170-8280 |