V3 arbeidsflyt er en vestlig blot prosedyre ved hjelp av flekkfrie geler. Den flekkfrie teknologien gjør det mulig for forskere å visualisere proteinseparasjonskvalitet, for å verifisere overføringseffektiviteten, og viktigst av alt, for å validere endringen i proteinet av interesse ved hjelp av total protein kvantifisering som en pålitelig lastekontroll.
Den vestlige blotten er en veldig nyttig og allment vedtatt laboratorieteknikk, men utførelsen er utfordrende. Arbeidsflyten karakteriseres ofte som en “svart boks” fordi en eksperimentalist ikke vet om den har blitt utført med hell før det siste av flere trinn. Videre blir kvaliteten på vestlige blotdata noen ganger utfordret på grunn av mangel på effektive kvalitetskontrollverktøy på plass gjennom hele den vestlige blottingsprosessen. Her beskriver vi den vestlige arbeidsflyten V3, som bruker flekkfri teknologi for å løse de store bekymringene knyttet til den tradisjonelle vestlige blotprotokollen. Denne arbeidsflyten gjør det mulig for forskere: 1) å kjøre en gel på ca 20-30 min; 2) å visualisere prøve separasjon kvalitet innen 5 min etter gel løp; 3) å overføre proteiner i 3-10 min; 4) å verifisere overføringseffektivitet kvantitativt; og viktigst av alt 5) for å validere endringer i nivået av proteinet av interesse ved hjelp av total proteinbelastningskontroll. Denne nye tilnærmingen eliminerer behovet for stripping og bebreidelse av flekken for rengjøringsproteiner som β-aktin, β-tubulin, GAPDH, etc. V3-flekkfri arbeidsflyt gjør den vestlige flekkprosessen raskere, gjennomsiktig, mer kvantitativ og pålitelig.
Western blot er en veldig nyttigteknikk 9, men det er to store utfordringer med vestlig blotting: lang og arbeidsintensiv prosess og kvalitet på data. En tradisjonell protokoll krever ca 2 dager. Det innebærer mange trinn, inkludert prøvepreparering, gelstøping, proteinelektroforese og overføring, membranblokkering etterfulgt av antistoffinkubasjon, avbildning og ganske ofte stripping, bebreidelse og til slutt dataanalyse. Gjennom hele denne prosessen er det ingen pålitelige og fleksible verktøy for prosesskontroll. Som sådan kan feil innføres på hvert trinn, og disse feilene har potensial til å generere dataartefakter; Derfor er lastekontroller avgjørende i vestlig blotting for å identifisere og korrigere for feilene. Lastekontrollen gjøres vanligvis ved å sjekke proteinnivået til et referanseprotein i hver prøve for å se om det er like presentert. Folk bruker ofte rengjøringsproteiner, for eksempel β-aktin, β-tubulin, GAPDH, som lastekontroll.
Kvaliteten på vestlige blotdata avhenger av pålitelig lastekontroll. Men det er to legitime bekymringer ved bruk av rengjøringsproteiner for lasting av kontroller: 1) antistoffbasert immunodeteksjon av rengjøringsproteinbåndene er ofte mettet, og derfor kan man ikke skille belastningsforskjellene mellom prøvene30; 2) rengjøring protein uttrykk nivå kan variere i prøvene under visse eksperimentelle forhold , for eksempel siRNA behandling, celledød, celle differensiering, etc.11,28,3,6,10,21. På grunn av disse bekymringene krever vitenskapelige tidsskrifter nå at “for kvantitative sammenligninger bør passende reagenser, kontroller og avbildningsmetoder med lineære signalområder brukes” (Nature retningslinje). På samme måte ber redaktører fra Journal of Clinical Investigation om mer pålitelige lastekontroller24. Av disse grunnene må et rengjøringsprotein valideres for å kunne brukes som lastekontroll. Først må man sørge for at den måles i det lineære dynamiske området til immunodeteksjonsmetoden14,29. For det andre må man sørge for at den uttrykkes konsekvent i alle prøver26,31,25,19,20.
En alternativ løsning på en pålitelig lastekontroll er å bruke total proteinmåling fra blotten. Noen forskere har farget blotter med totale proteinflekker, for eksempel Coomassie, Flamingo Pink, Sypro Ruby, Amido Black, Ponceau S og flekkfri teknologi, for å måle det totale proteinsignalet i hvert kjørefelt som lastekontroll16,20,13,27,1,4,12. Den totale proteinbelastningskontrollen unngår fallgruvene forbundet med rengjøringsproteiner. For det første er det en sann refleksjon av mengden protein lastet for hver prøve. For det andre viser den totale proteinflekken utmerket lineært dynamisk område i det vanlige lasteområdet for vestlig blotanalyse (10-50 μg protein av en kompleks cellelysat) og skiller nøyaktig lasteforskjellen mellom prøvene12.
Flekkfri teknologi er en ny total proteinfargingsmetode der en unik forbindelse blandes i akrylamidgeloppløsning og jevnt fordelt i den støpte gelen. Etter at elektroforesen er fullført, blir gelen utsatt for UV-lys i minst 1 min slik at flekkforbindelsen reagerer med tryptofanrester i proteinet. Proteinene blir spennende under UV-lys for å gi et sterkt fluorescerende signal som kan visualiseres og kvantifiseres i en flekkfri aktivert imager som ChemiDoc MP-systemet. Den flekkfrie forbindelsen selv absorberer imidlertid ikke UV-lys, noe som resulterer i lav bakgrunn av gelbildet. Modifikasjonen av tryptofan rester er irreversibel og proteiner kan visualiseres ikke bare i gelen, men også på blotte når som helst etter proteinoverføring.
Den flekkfrie teknologien brukes i V3 Western Workflow (figur 1) for å håndtere de store klagene om den tradisjonelle arbeidsflyten, spesielt bekymringene for å bruke rengjøringsproteiner som lastekontroller. Ved hjelp av denne arbeidsflyten kan man: 1) kjøre en gel på ca 20-30 min, 2) sjekke prøveintegritet og proteinseparasjonskvalitet på 5 minutter etter gelløp; 3) overføre proteiner i 3-10 min; 4) sjekk overføringseffektiviteten kvantitativt; og 5) viktigst, validere endringer i nivået av protein av interesse ved hjelp av total protein lasting kontroll.
V3 flekkfri protokoll beskrevet ovenfor er for multipleksing fluorescerende vestlig blotting. Det kan også påføres i vestlig blotting ved hjelp av chemiluminescent deteksjon. I multipleks fluorescerende vestlig blot protokoll, de flekkfrie blot bilder er anskaffet på to tidspunkter: 1) rett etter proteinoverføring; 2) ved multipleks fluorescerende bildebehandling trinn etter antistoff inkubasjon. Det første flekkfrie bildet brukes til å beregne overføringseffektivitet, og det andre flekkfrie bildet brukes som lastekontroll. Når chemiluminescent-metoden påføres, er det ikke mulig å ta et multipleksbilde for flekkfrie og målproteinsignaler, fordi chemiluminescent-signalet også vil dukke opp i den flekkfrie kanalen. I dette tilfellet anbefaler vi å bruke det flekkfrie bildet tatt rett etter proteinoverføringstrinnet for lastingskontroll og normaliseringsanalyse.
Den vestlige V3-arbeidsflyten gir følgende unike fordeler sammenlignet med den tradisjonelle vestlige blot-arbeidsflyten som bruker rengjøringsproteiner som lastekontroller:
For det første gir V3-arbeidsflyten en praktisk, praktisk og mer pålitelig lastekontroll for å validere endringene i nivået av proteinet av interesse. V3-protokollen bruker en total proteinbelastningskontroll for å normalisere nivået av proteinet av interesse målt i hver prøve. Det unngår to fallgruver ved bruk av rengjøringsproteiner som lastkontroller: mettet immunodeteksjon og inkonsekvente rengjøringsproteinuttrykksnivåer blant prøvene under visse eksperimentelle forhold. Stripping og bebreidelse av trinn med antistoffer rettet mot rengjøring er ikke lenger nødvendig. Ved hjelp av flekkfri teknologi er det ikke nødvendig å flekke og flekke en flekk med flekker som Coomassie eller Sypro Ruby for total proteinmåling. Det tar bare noen få sekunder å skaffe seg et blotbilde og omtrent 5 min for å gjøre total proteinnormalisering ved hjelp av Image Lab-programvare.
For det andre tillater V3-arbeidsflyten forskere å ta bedre kontroll over den vestlige prosedyren fordi den gjør prosedyren mer gjennomsiktig og introduserer flere sjekkpunkter for kvalitetskontroll. Ved hjelp av flekkfri teknologi kan forskere visualisere proteinprøvene sine på både gelen og blotten. Forskere kan vurdere proteinprøveintegritet (degradert eller ikke), separasjonskvalitet (utfelt eller ikke), overføringseffektivitet og overføringskvalitet (til og med overføring eller ikke). Disse sjekkpunktene hjelper undersøkelser med å avslutte eksperimentet når de ser store feil i prosessen og unngår å kaste bort tid på dårlige prøver og flekker. Denne teknologien hjelper også forskere med å vurdere om det er en betydelig mengde proteintap etter membranstriping og om blott er egnet for å bebreide et annet mål 4.
Her er noen tips for å sikre god erfaring og kvalitetsdata ved hjelp av V3 western arbeidsflyt.
Det er viktig å merke seg at det flekkfrie molekylet etter UV-aktivering er irreversibelt bundet til tryptofan rester. Denne irreversible modifikasjonen kan potensielt påvirke antigengjenkjenning ved bruk av monoklonale antistoffer hvis epitopen inneholder tryptofan. Polyklonale antistoffer er usannsynlig å bli påvirket fordi de gjenkjenner flere epitoper på antigenet. Ubundne flekkfrie molekyler vaskes lett av gelen og membranen og vil derfor ikke forstyrre antistoff-antigeninteraksjoner.
Til slutt gjør den vestlige arbeidsflyten V3 den vestlige blotprosessen raskere, mer gjennomsiktig, kvantitativ og mer pålitelig. Forskere kan nå enkelt bruke total proteinbelastningskontroll i et vestlig bloteksperiment for å gjøre dataene mer pålitelige. Den flekkfrie arbeidsflyten V3 er vedtatt av en rekke laboratorier, og deres publikasjoner har vist at tidsskrifter godtar flekkfrie data som lastekontroll i vestligblott 22,17,7,8,5,23,18,15.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Dr. Wolf-Dieter Stalz, Dr. Arnaud Remy, Dr. Anton Posch, Dr. Patricia Piatti, Tom Davies, Kris Simonyi og Jeff Durban for deres kritiske gjennomgang og redigering av dette manuskriptet. Forfatterne takker også Allison Schwartz for teknisk støtte.
REAGENTS | |||
4-20% Criterion TGX Stain-Free Precast Gel | Bio-Rad | 567-8093 | Choose a gel size and percentage that meet the specific need in a experiment |
Trans-Blot Turbo Midi PVDF Transfer Packs | Bio-Rad | 170-4157 | Choose either PVDF or nitrocellulose and match the membrane size to the gel size |
Clarity Western ECL Substrate, 500 ml | Bio-Rad | 170-5061 | |
[header] | |||
EQUIPMENT | |||
Criterion Cell | Bio-Rad | 165-6100 | |
Trans-Blot Turbo Transfer Starter System | Bio-Rad | 170-4155 | |
ChemiDoc MP System | Bio-Rad | 170-8280 |