新規タスクを使用した片側子宮頸SCI後前肢の機能を評価する：四肢ステップ交替、姿勢の不安定やパスタの取り扱い

Summary

げっ歯類における子宮頸部脊髄損傷後の前肢機能を評価するための3つの新たな行動試験（前肢ステップ交替、姿勢の不安定性試験、パスタハンドリング試験）に記載されている。

Abstract

頸髄損傷（CSCI）は、障害または上肢や手の機能が失われるなど壊滅的な神経障害を引き起こす可能性があります。ヒトにおける脊髄損傷の大部分は、子宮レベルで起こる。そのため、頚椎損傷モデルを開発し、関連性の高い機密行動テストを開発することが非常に重要である。ここでは、ラットにおける子宮頸部脊髄損傷後の新たに開発された前肢ステップ交替試験の使用を記載している。姿勢の不安定性試験（PIT）、パスタハンドリング試験：さらに、我々は脊髄損傷後に使用されていない2つの行動試験を記載している。すべての3つの行動試験は、傷害に非常に敏感であり、使いやすい。したがって、我々はこれらの行動試験は、CSCIの後に治療戦略を研究に尽力することができると感じています。

Introduction

頸髄損傷（CSCI）は、全てのSCIの約62％（代表、患者では、SCIの最も一般的な形態であるhttp://www.spinalcord.uab.edu ）。頸髄への傷害は上肢だけでなく、呼吸障害になることがあります。 CSCI患者における最近の研究は、腕および/ ​​または手の部分的または完全な機能は、主要な優先度¹であると考えられることを示唆している。そのため、CSCIモデルと使用するには、簡単に高感度かつ信頼性のある、関連する行動アッセイを開発することは重要な目標である。げっ歯類^1-17 CSCI後前肢機能を評価するためのいくつかの有用な行動試験があるが、しかしながら、これらの試験の多くは、使用が困難であり、特殊な装置を必要とする。パスタハンドリングテストは、他のグループ^18,19によって開発されてきたが、これらのテストは、動物が特定のパスタを食べるケージで撮影されている必要があり、長いを必要とする訓練期間、我々は提案する方法は、動物のホームケージで実行することができますが。前に説明したパスタテストはここに記載された試験とは異なり、かなりの分析時間と、多くの場合、高価なソフトウェアが必要です。本手法の目的は、開発し、使用し、使いやすく信頼性の高い行動試験を、高価な装置を必要としないことです。具体的には、ここで説明前肢ステップ交替試験は、慢性処置が投与される前に、同等の治療群を作成する手段を提供し、研究者が早期に損傷後の病変体積を推定することを可能にする。 （1）前肢ステップ交替、（2）姿勢の不安定、および（3）パスタ処理：本研究では、詳細には3つの新規の行動試験を記載している。

使用権の行動試験を決定することは困難であり得る。確かに、私たちは誰も行動試験が適切に前肢の機能を評価することはできないと感じています。したがって、我々はいくつかのお尻に行動試験の組合せを使用して示唆しているSCI後のESS前肢機能。一概に言えば、1はオープンフィールド歩行型作業動物は、通常の歩行運動時の彼らの前肢の使用に評価される（ 例えば前肢運動スケール、シリンダー）、および動物を特定のタスクを実行するように要求されたタスクの特定のテストを、使用する必要があります彼らの前肢の使用（ 例えば 、パスタを食べ、姿勢の不安定、握力など ） を含む。ここでは詳細に説明した行動試験は、〜1週間後の病変（前肢ステップ交替、姿勢の不安定、パスタの取り扱い）、contralesional前肢（前肢のステップ交替、姿勢の不安定に対する一方的な病変の影響で、病変の重症度を決定するのに有用である）と前肢の細かい運動運動（パスタの取り扱い）。使用病変の重症度や効果を知ることは、適切な行動テストを指示することができます。手首の細かい運動の動きがテストを用いて、病変の後に可能でない場合は、その対策とquantifIES前肢の足を使用することは適切ではありません。例えば、先に説明したパスタハンドリングテストの多くは、数字の個々の動きに深く多くを見て、しかし、我々は我々の損傷の重症度および位置が見つかった、これは関係ありませんでしたし、代わりに四肢の全体的な配置の違いを観察した。

研究者は、多くの行動試験を実施し、その結果に基づいて、デモンストレーションのためにそれらのサンプルを使用したくなるかもしれません、しかし、パイロット·スタディを使用している各実験モデルに病変に対して適切な行動試験を決定するために実行されることをお勧めします。したがって、ユーザは使用すべき行動試験を決定する前に、特定の病変の種類及び程度の欠損のタイプの少なくともいくつかの事前知識を有するべきであることに留意することが重要である。行動パフォーマンスに基づいて病変の重症度を評価することは、治療群は治療前の病変の重症度の平等な分配を使用して作成することができますMENTが投与される。

Protocol

全ての動物手順は、テキサス大学オースティン校の内部IACUCとし、国立衛生研究所（NIH）のガイドラインに基づいて承認されたプロトコルに従って行われた。

この研究で用いた動物は無限ホライゾンインパク、又はC3/C4横方向片側切断モデルとこれらの方法は、他のモデル¹⁸に、より広く適用することができるC3/C4を用いて横方向の挫傷を有していた。試験期間中のため、我々は研究者は損傷前に2週間のために動物をテストすることをお勧めし、3日間は、損傷後、定期的に（ 例えば毎週）。特に3日後に手術で、術後の動物に行動試験を行う際には、注意が動物が手術から十分に回復し、行動試験の手順は、動物への追加の痛みやストレスを引き起こさないことをしていることに注意しなければならない。

一般的には、ハンドリングと事前テストの2〜3週間は、手術前に必要になる場合があります。これは、テストだけでなく、動物が、試験表面に自由に移動できるように中に処理される方法と同じようにそれらを処理することで、テスト環境に動物が快適な取得が伴う。これは取り扱いに動物を順応さ非ダイレクトな動きで、試験表面に近く、動物を移動することによって行うことができ、開催されることに慣れた動物を取得することも重要です。これは、開始時および試験セッションの間に動物を緩和することも重要である。 、動物をリラックス "手押し車"の位置に、前肢のみの保有​​スタンスで卓上に動物を保持し、前肢が表面に触れることが可能卓上に優しく動物をバウンスします。これは安定した表面のためにそれらの下に検知するために動物を教え、それはテストが始まる前に動物が緩和されることを保証するための手順の重要かつ必要なステップです。

1。前肢ステップ交代テスト

1. テスト要約：彼らは彼らの前肢の使用を交互にするかどうか決定するために、卓上に触れるの両方前肢で動物を置きます。ステップを試みるためにそれらを強制的に、体の重心をシフト前方ラットを移動します。この試験は、各動物で4回繰り返し、動物の位置は交互する能力、またはより高い、75％を示した場合、それはオルタネータであると考えられる。非オルタネータと考えられている動物が繰り返し同じ前肢でいきますので、これは、強制的なモーションタスクである。
2. 自分の体表からほぼ90°の「手押し車」の位置に、前肢のみの体重支持のスタンスで卓上に動物を開催しています。
3. 動物がリラックス表示されたら、テーブルトップの表面に沿って移動するように前進​​動物を押してください。
4. 表面を横切って移動しながらラットを交互に前肢の使用かどうかを判断し、記録します。
5. 注意して運動を開始し、O動物が代替できるかどうか前肢を記録N前肢ステップ交替テストのスコアシート（付属）。
6. 1手（右または左手）で動物を保​​持した状態で、少なくとも2回のテストを繰り返します。一方で動物を保​​持した状態で少なくとも二回、再び繰り返します。
7. ラットがこの能力を示した場合は、ステップ交互に交互のパターンが遅延した後に残るかどうかを決定する最初のステップの後に5秒の待ち時間を導入することによって再度試験することができる。スコアシートに結果や記録を注意してください。
8. このテストでは、毎日使用することができ、それは動物を反復測定実験のために少なくとも週にテストされることをお勧めします。

注：試験動物の交替行動に影響を及ぼし得るので、それは実験者の手の位置を交互にすることが重要である。設けステップ交替スコアシートは、ステッピング時の足の位置および使用を留意することに使用することができる。我々は現在、当社のスコアリングシステムにそれらのデータを組み入れていないが（私たちは持っている使用済みの交替状況基に、現在の研究における損傷動物）、ユーザが容易に特定のプロジェクトに応じて、分析の一部として足の位置データを含むことができる。

2。姿勢の不安定テスト

1. テストサマリー：この行動試験では、前肢交代テストの場合と同様の位置にラットを保持するが、しかし、各々の前肢を個別にテストする必要があります。卓上には、滑りブレース、またはテスト中に前肢のドラッグを防止するために、サンドペーパー（番号220）で覆われている必要があります。
   1. このテストでは、それはそのバランスを取り戻すために前肢が調べられているとの一歩を踏み出すために、動物に要する距離が記録されます。
   2. 体重に大きな差が所与の動物¹⁹の重心を維持するために必要なベースライン距離の変化をもたらすことができるように、研究グループ内の動物は、ほぼ同じ重量、大きさおよび年齢でなければならない。シャム群は、あるべき行動の変化は、再生または回復ではなく、年齢や体重増加によるものであることを確認するために、PITを使用しながら含まれていた。
2. 快適なスタンスで卓上に動物を持って、両方の前肢が表面に到達することができ、動物が快適に自分の体表からほぼ90°の「手押し車」の位置にあるべきである。それは、より垂直に動物を保持することが重要であることに注意してください。これは、ステップをトリガーするために必要な、より一貫した距離は、重心を取り戻すことを可能にする。
3. 軽く動物の胴体に対して1前肢を抑制し、上から見たゼロラインをラットの鼻の位置を合わせます。
4. 前進ラットを移動します。これは、重力が前方にバランスを取り戻すためにステップするために動物を刺激する動物の中心をシフトします。
5. 二回ラットステップ後の鼻の新しい位置を記録し、距離がステップをトリガーするために、必要に応じてこれらの2つのステップの平均を使用しています。
6. 各foreliをテストMB独立5X、バック0の位置に動物を持ってきて、動物が一貫性のある結果を保証するために、続行する前に、実験者の手で緩和され続けていることを検証する。
7. 提供姿勢の不安定テスト（PIT）スコアシート、上のレコード。このテストは、毎日行うことができ、それは動物が実験期間中に少なくとも週にテストされていることをお勧めします。

3。パスタ取扱テスト

1. テストサマリー：それはパスタを食べるセッション中にパスタや足の好みの部分を食べるのにかかる時間を決定するために、このテストに使用します。このテストでは、乾燥パスタの4.0センチメートルストランド（;直径〜1.6ミリメートルの薄いスパゲッティ）を使用します。テストでは、各試験日ほぼ同時に投与されるべきである。げっ歯類は一般的に容易に乾燥パスタを食べますが、食品離​​脱の4〜6時間はこれが発生しない場合は、テストする前にお勧めします。
2. ベースライン測定は、1〜2週間前に取得すべき傷害に。ベースラインの記録に先立って、ラットは、試験のためにそれらを準備するために、それらのホームケージにパスタの同じタイプを与えられるべきである。すると、ラットは、試験室でパスタを食べ、パスタを食べる時間を記録することができます。パスタ片は前肢の使用が容易に観察することができ、試験室の正面近くに配置する必要があります。各パスタを食べるセッションは、パスタの少なくとも3個を食べて含める必要があります。彼らのパスタを食べる時は、少なくとも3日間、一貫している場合は、ラットを、パスタを食べに堪能と考えられている。
3. 検査室で一貫してパスタを食べにラットを訓練した後、記録室にラットを配置します。
4. パスタ取扱スコアシートに見られるように、パスタの一部、使用前肢と前肢の位置を食べに検査室と記録時間の前面付近の床の上にパスタのピースを置きます。
5. このテストは、毎日実行することができますが、動物の体重を観察しながら、Tとして、毎週それを実行することをお勧めしますO動物を過剰餌を与えない。

注：パスタスコアシートの取り扱いは、この研究に含まれているデータと同様パスタや足の使用を、食べる時間を記録するためのスペースが用意されています。我々はまた、このような足の位置などのパスタを食べるセッション中に足の使用のさらなる詳細を記録する領域が含まれています。

Representative Results

私たちは動物が改善され、分析のための反復測定型の実験で、実験を通して定期的にテストすることが、時間をかけて改善を分析することをお勧めします。

前肢ステップ交代テスト

この試験は、その前肢の使用を交互する動物の能力を決定するために設計されている。前肢ステップ交互試験を用い、動物の50％が12から16週間後損傷（ 図1A）でCSCI ¹⁹後に前肢の使用を交互にすることができました。次に、第二段階のために前進動物を移動する前に、最初のステップの後に、動物の静止を保持することによって遅延（5秒）を導入した。手足の使用を交互にされた動物の50％（総病変グループの25％）が5秒遅れた（ 図1B）した後に代替することができました。我々は、解剖学的研究とこれらの調査結果を相関と分析はオルタネータがsignificaを持っていることを明らかにしたntly大きな免れる皮質脊髄路の面積が[F（1,1）= 5.56、P <0.05]と脊柱[F（1,1）= 19.2、P <0.003] contralesional側¹⁹に。これらのデータは、前肢工程交替試験は、病変の重篤度、ならびに病変のunilateralityを予測できることを示している。この試験は、反復測定分散分析を用いて分析されるべき名目カテゴリデータをもたらすことができる。この例では、我々は、群間の差を説明するために、1つの時点を用い、反復測定ではなかった。各動物は、（それぞれ、重度対中程度）傷害の二つのグループに動物を分離し、「オルタネータ」または「非オルタネータ」に分類される。

姿勢の不安定テスト

脊髄の一方的な病変が損なわれ、および/または、患肢するだけでなく、非障害者の四肢にするだけでなく、変更が発生する可能性があります。姿勢の不安定テスト（PIT）は、以前に得！だったribedおよびパーキンソン病¹⁸のげっ歯類モデルを有する動物およびCSCI ¹⁹のげっ歯類モデルで使用される。我々は、[P <0.01、F（1,1）= 8.17] CSCI後PITを使用し、病変の状態の有意な効果があったことを見出した。また、前肢変位（重心を取り戻すまでの距離）（偽手術した動物と比較して負傷した動物のipsilesional側（右前肢）で有意に大きかった8.00±0.10センチメートル、P <0.0001対6.00±0.24センチメートル、 図2 ）。 contralesional前肢での移動距離は、（; 図2 CSCIのための4.00±0.10センチメートル、P <0.0001に対して偽のための6.00±0.25 CM）偽手術動物と比較して病変動物で有意に小さかった。この結果は、contralesional foreliによる姿勢調整、すなわち変化（contralesional前肢も反対側に起因する病変の変化をもたらしたことを示している）重心を取り戻すためにMB。この試験からのデータは、定量的であろうと実験を通して基の変化を調べるために、反復測定ANOVAを用いて分析されるべきである。

パスタ取扱テスト

パスタの取り扱いは、乾燥パスタの部分を食べながら前肢の熟練した使用をテストするために設計されました。同様のテストは、片側脳卒中およびパーキンソン病^20,21の動物モデルおよびCSCI ¹⁹後の前肢の使用に熟練した障害を検出するために以前に使用されている。慢性の時点で負傷（12週損傷後）の後に、すべての偽動物は、試験期間中の両方の足を使ってパスタを食べました。病変群では、パスタの部分を食べるための全体的な時間は、対照群（ 図3）と同様であることを見出した。しかし、より多くのオルタネーター（穏やかな傷害、15のうち10）は、非オルタネーター（重傷を負った群と比較して、そのipsilesional前肢を使用することができました。7のうち1;

前肢ステップ交番試験を用いて前肢の機能の図1。慢性的評価は、さまざまな病変の重症度と動物の2異なるグループを明らかにした。動物が前方に両足を使ってステップ実行時 ​​の動作の違いを示した。他の人が連続で2 contralesional段階（非オルタネーターをとることによって、ステップ·交代の欠如を示したのに対し、; 5 10病変のうち、（10破壊ラットのうち5オルタネータ）をステップ実行しながら、足を交互に損傷動物の50％のみラット）。 5秒の遅延がセントの間に導入した場合にはより多くの動物は、複数のcontralesional措置をとるためにこの傾向を表示PS（10破壊ラットのうち8）。

図2慢性前肢行動評価姿勢の不安定テスト（PIT）を使用して、予想したように、頸髄損傷（CSCI）を持つ動物におけるipsilesional前肢は、偽手術8センチメートル対（6 CMとの動物よりも有意に大きな変位距離を持っていた。* P <0.0001）。 （; * P <0.0001を4センチメートル対6センチメートル）また、contralesional前肢上の移動距離は、偽手術動物と比較して病変動物で有意に小さかった。これは病変動物ピットの間contralesional手足の強化された機能を提案することができる。

前肢アセスメントパスタ処理を使用し、テストを食べるには、病変非オルタネータに重大な障害を示した。動物はパスタの標準一片を与えられた。足の使用やパスタを食べる時間を記録した。結果は、オルタネータの数が少ない（33％）が独占的に非オルタネーター（86％）に比べて（より重度の障害を示す）、そのcontralesional前肢を使用したことが示された。また、全3群（偽、オルタネータを病変、非オルタネータ病変）の動物は、パスタ（p <0.05）を食べる時間の同じような長さを取った。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。

Discussion

頸髄損傷（CSCI）は患者で壊滅的と人生変え負傷する可能性があります。神経基盤および治療剤の可塑性を研究するために使用されているげっ歯類で開発頚髄損傷モデルは多数存在する。 、敏感な効果、再現性があり、CSCI後の機能障害および回復を評価するために行動試験を使用して簡単に開発することは重要な目標である。四肢の交代、姿勢の不安定やパスタ処理：ここでは詳細にこのような3つの行動試験の使用を記載している。

げっ歯類における脊髄損傷は、ヒトの集団のように、異種の怪我です。非常によく似た損傷は行動障害の様々を誘導することができる。したがって、負傷した動物における病変の重症度を決定することが重要である。私たちは、contralesional側が一方的な損傷（片側切断またはCONT後に損傷がある場合は、四肢の交替タスクが決定する非常に有効な方法であることがわかった頸髄¹⁹にusion型損傷）。我々のグループからのデータは、この四肢交替タスクの使用は、損傷後の最初の週以内に損傷の重症度を決定することができることを示した。加えて、より深刻な負傷した動物（非交流発電機）はオルタネータ（前肢の運動スケールを使用）と比較して有意に異なる回復プロファイルを有していた。そのため、手足の交替タスクは研究は、各治療群の病変の重症度の平等な分配があることを確認するための長期治療が含まれる場合は特に、オルタネータと非オルタネーターに損傷ラットをグループ化することに非常に有用である。

それは、前肢-交替試験（そのような前肢運動スケールまたはシリンダー足の嗜好試験など）、動物の前肢の使用を調べることができ、他のタスクと組み合わせて使用​​することをお勧めします。このテストを投与しながら、実験者がテストを同じ回数を行うことが肝要であるそれぞれの手で（ 例えば二回、左手で2回、右に）ラットの行動に実験者の手の位置の影響を最小限に抑えます。動物は実験者の手の中に緩和されている場合、このテストは、有効であり、提案され取り扱いの2〜3週間は、リラクゼーションを提供する必要があります。動物が緩和された後、さらに、実験者の中、動物の変動を防ぐために、ほぼ90°の手押し車の位置に動物を保持する必要があります。

前肢-交番テストは、動物が足で個別にステップすることができないが、交代タスクを実行することができたとき、クロス脊髄神経接続に洞察力を提供することができます。このようなラットなどの動物の正常な四足歩行のために、脊髄の長さに沿って多くの脳領域だけでなく、地元の中枢パターン発生器（CPGは）が関与している。具体的に前肢リズミカルな動きのため、頚椎のセグメント、C3〜C6は²²重要であると考えられている。以前、我々はdescri病変動物におけるオルタネータと非オルタネーター間のベッド解剖学的な違い（C3/C4の横片側切断が行われた）、contralesional脊柱および非交互動物では皮質脊髄路¹⁸へのより多くの損傷を発見した。これは、前肢の動きのために、リズミカルなパターン発生器は、子宮頸部ヘミセグメントの各レベルで存在し、クロスコードインヒビター接続が交替²³の原因であると考えられる。脊髄のcontralesionalがより完全である場合には、リズミカルな運動出力をする可能性が高いのに対し、我々の以前の解剖学的な調査結果はまた、脊髄のcontralesional側へのダメージ（たとえば交替など）リズミカルなモータ出力に混乱を引き起こす可能性があることを意味正常に機能します。私たちは、コードの任意のcontralesional内側腹側の部分に重大な損傷は見られなかったので、その分析は実行されませんでした。

ここで説明する姿勢の不安定テストはバージョンです Y有用な試験それは一方的病変に起因する両方の前肢（同側およびcontralesional）の変化を検出することができるからです。なお、この試験は、動物を実験者の手で緩和されている場合にのみ投与されるべきであることに留意することが重要である。我々の経験では、これは2〜3週間の動物の毎日の取扱いを取ることができます。実験および動物が慣れたら、この試験は非常に敏感であり、各前肢のための非常に一貫性のある変位データを取得するために使用することができる。動物が緊張している場合には、実験者は静かに動物を保持することができますし、動物が快適で、テーブルは、安全な場所であることを理解するまで、テーブルの上のオフにして上下に移動します。動物が緩和されると、それは一貫性のある結果を得るため手押し車の位置でほぼ90°で動物を保​​持することが重要です。このテストは、管理が容易で、1簡単な作業で補償と赤字についての情報を提供することで、他の行動試験を超えて洞察を提供します。

T ">ラットは、容易にカメラの前で練習した後、乾燥パスタを食べたので、パスタの取り扱い、管理することは比較的容易な試験である。本研究では、記録され、四肢の使用のためにデータを使用して（左、右、または両方）および時間唯一のパスタを食べること。パスタを食べる時の足の調整を含むより詳細な分析は、このような一方的な虚血性病変や一方的な線条体ドーパミン枯渇の^20,21,24などの傷害を持つ動物で、以前に記載されている。そのため、より多くを開発し、使用することが可能であるこれは利き手やそれぞれの手に力を明らかにすることができるようにパスタを食べるテストから高感度分析では、CSCIの後に我々は、スコアシートに足の位置を含めさらに、我々は各足のグリップに注目され、一部の動物は、1辺の上で自分の足を休める動物はパスタを食べることを躊躇している場合パスタは、支持体としての可能性、それを使用してではなく、食べる時にグリップパスタを。、絶食ステップは、試験前にプロトコルに導入することができる。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sand paper	3M	5097	3M Gold Fre-Cut Sandpaper was used. Any 220-grit sandpaper would work well
Dry Pasta	Skinner		Skinner Thin Spaghetti was used. It is available at Walmart