Ny utvikling i genet målretting verktøy som gjør produksjonen av knockout (KO) kaniner mulig. I dette arbeidet, genererte vi fem Apolipoprotein (Apo) C-III KO kaniner som bruker sink finger nukleaser (ZFN). Dette arbeidet viser at ZFN er en svært effektiv metode for å produsere KO kaniner.
Apolipoprotein (Apo) C-III (ApoCIII) befinner seg på overflaten av plasma chylomikron (CM), veldig lav tetthet lipoprotein (VLDL) og høy tetthets lipoproteiner (HDL). Det har blitt anerkjent at høye nivåer av plasma ApoCIII constitutea risikofaktor for hjerte-og karsykdommer (CVD). Forhøyede plasma ApoCIII nivå ofte korrelerer med insulinresistens, fedme, hypertriglyseridemi og. Uvurderlig kunnskap om rollene til ApoCIIIin lipid metabolisme og hjerte-og karsykdom er innhentet fra transgene musemodeller inkludert ApoCIII knockout (KO) mus, men er det bemerket at metabolismen av lipoprotein hos mus er forskjellig fra det av mennesker i mange aspekter. Det er ikke kjent før nå om forhøyet plasma ApoCIII er direkte atherogenic. Vi jobbet med å utvikle ApoCIII KO kaniner i denne undersøkelsen basert på hypotesen om at kaniner kan tjene som en reasonablemodelfor studere menneskelig lipid metabolisme og åreforkalkning. Sink finger nuklease (ZFN) sett rettet kanin ApoCIIIgene ble utsatt for in vitro validering før embryo mikroinjeksjon. MRNA ble injisert til cytoplasma av 35 kanin pronuclear scene embryoer, og vurdert de mutasjon priser på blastocyst staten. Av seksten blastocyster som ble analysert, var en tilfredsstillende 50% mutasjonsfrekvens (8/16) ved målretting område oppnås, som støtter bruk av sett en for in vivo eksperimenter. Neste, vi microinjected 145 embryoer med Set 1 mRNA, og overført disse embryoene 7 mottaker kaniner. Etter 30 dager svangerskap, ble 21 kits født, hvorav fem ble bekreftet som ApoCIII KO kaniner etter PCR sekvense analyser. Den KO dyr rate (# KO kits / totalt født) var 23,8%. Den samlede produksjonseffektivitet er 3,4% (5 kits/145 embryo overføres). Foreliggende arbeid vist at ZFN er en svært effektiv metode for å produsere KO kaniner. Disse ApoCIII KO kaniner er nye ressurser for å studere rollene til ApoCIII i lipid metabolisme.
Apolipoprotein (Apo) C-III (ApoCIII) er en liten O-glykosylerte sekretoriske protein som syntetiseres hovedsakelig i leveren og tarmen. Den ligger på overflaten av plasma chylomikron (CM), veldig lav tetthet lipoprotein (VLDL) og høy tetthets lipoproteiner (HDL). ApoCIII har blitt anerkjent som en risikofaktor for hjerte-og karsykdommer en. Pasienter med arvelig mangel på ApoCIII har lav plasma triglyserider (TG) nivåer og redusert subklinisk koronar aterosklerose 2,3. Forhøyede plasma ApoCIII nivå, på den annen side samsvarer ofte med insulinresistens, fedme, hypertriglyseridemi, og (HTG) 4,5.
Gene knockout (KO) er et kraftig middel for å studere funksjonen til et gen. I samsvar med observasjoner i menneskelige mutant populasjoner, knockout av ApoCIII genet i mus førte til en reduksjon av plasma TG og beskyttelse fra postprandial HTG seks. En slik positiv rolle ApoCIII dukket oppå være uavhengig av Apolipoprotein E (ApoE), som mus mangelfull av både ApoE og ApoCIII er også beskyttet fra postprandial hyperlipidemi 7.. Selv om disse ApoCIII KO musemodeller har gitt uvurderlig informasjon om mulige funksjoner av ApoCIII hos mennesker, er det bemerket at metabolismen av lipoprotein av mus er forskjellig fra det av mennesker i mange aspekter. For eksempel mangler mus plasma kolesteryl-ester overføringsprotein (CETP), en viktig enzym som er involvert i transport av VLDL, LDL, og HDL 8.. Derfor er det nødvendig å utvikle en egnet dyremodell for ytterligere å forstå den fysiologiske rollen til ApoCIII in vivo.
Kaninen er en klassisk modell dyrearter 9-11. Den har en kort drektighetstid (30-31 dager), stor kullstørrelse (4-12/litter) og kan bli plassert beleilig i et innendørs anlegg. Sammenlignet med mus, kaniner er fylogenetisk nærmere mennesker 10. Viktigere, som humann, men i motsetning til mus, kaniner er LDL-rik pattedyr og har betydelige nivåer av CETP 10,12. Videre er de utsatt for kolesterol-rik diett-indusert aterosklerose med lesjoner lik dem man ser i menneskelig aterosklerose 13. For disse grunner, vi en hypotese om at ApoCIII KO kaniner kan tjene som en bedre modell enn sine muse kolleger for å undersøke rollene til ApoCIIIplay i lipid metabolisme og aterosklerose hos mennesker.
Produksjon av genet målrettet transgen (GTT) kaniner har vært en utfordring. Dette er hovedsakelig på grunn av mangel på germline overføring embryonale stamceller (ESC), og den ekstremt lav effektivitet av somatisk cellekjerneoverføring (SCNT) i kaniner. ESC er det viktigste verktøyet for å generere GTT mus, mens og SCNT har blitt brukt til å generere KO dyr i arter mangler germline sender ESCs, inkludert griser, sauer og storfe, men ikke kaniner. Nylig Zinc Finger Nuclease (ZFN), Tranvelse Activator-Like Effector Nuclease (TALEN) 14, og RNA Guidet Endonuklease (rgen) 15 dukket opp som kraftig middel for genom redigering. Disse nukleaser, såkalte "molekyl saks", er effektiv i å generere dobbeltstrengbrudd (DSB) i genomet som kan føre til en funksjonell KO av målrettede gen eller som brukes for å integrere et DNA-sekvens på et bestemt geometrisk sted i genomet i en rekke arter 16. I 2011, blant de første tilpasse ZFN teknologi, genererte vi peroksisomproliferator-aktivert reseptor gamma (PPARγ) KO svin celler via denne tilnærmingen og hell generert PPARγ KO griser etter bruk av disse cellene for SCNT 17. I samme år, var effektiv immunoglobulin genet avbrudd og målrettet utskifting i kaniner også bruker ZFN rapportert 18.
I denne studien ble fem ApoCIII KO kaniner generert som bekreftet ved PCR sekvensering, ved hjelp ZFN Set 1 (se figur 1 </strong>. for flytdiagram illustrasjon). Disse dyrene er nye ressurser for å studere rollene til ApoCIII i lipid metabolisme.
I dette arbeidet ble fem ApoCIII KO kaniner generert ved hjelp av ZFN teknologien. Tidligere den eneste rapporten fra produksjon av GTT kaniner brukte også ZFN teknologi 18. Det foreliggende arbeidet bekreftet at ZFN er nyttig å effektivt målrette gener i kaniner.
I den foreliggende studien, den transgene rate (positive kits / totalt født) is23.8% (5/21), som er sammenlignbar med den forrige ZFN rapport i kaniner (30.8%, 16/52) 18, og de rapporterte for å bruke ZFN i andre dyrearter, inkludert zebrafisk 19, mus 20, rotter 21 og griser 17. Denne hastighet er i virkeligheten høyere enn tallene for mange konvensjonelle transgene kanin produksjons studier, som normalt faller i området fra 5-20%. For eksempel, i et forsøk på å Produktet ApoCIII transgene kaniner via konvensjonelle DNA-mikroinjeksjon, Ding et al. Erholdt 3 positive erne ut av 54 unger født (5,6%) 22.
I samsvar med tidligere funn, de mutasjoner ved målretting nettsteder er variabel, inkludert joner eller innskudd som består forskjellig antall baser (spenner 1-21 i de fem KO kaniner). Basert på den spesifikke sekvens informasjon av grunnleggerne dyr, er det spådd at minst fire (ie. De som inneholder Δ1, 1, 1, eller Δ20 mutasjoner) ville ha funksjon tap av ApoCIII. Animal R-16 med Δ21 kan ikke vise funksjonelt tap, da denne mutasjon er spådd å bare føre til tap av syv aminosyrer, men ikke en leseramme skift. Til syvende og sist fenotype analyser er nødvendige for å bestemme om disse stifter dyrene virkelig viser tapet av ApoCIII funksjoner.
Ingen av de fem KO kaniner som genereres i den foreliggende studie inneholde bialleliske modifikasjoner. Interessant, er dette også tilfellet i den forrige ZFN kanin rapport. I kontrast, ble da ZFNs målretting α1 ,3-galactosyltransferase brukes på grisceller, hyppigheten av målretting en enkelt allel varierte 7-46%, med omtrent en tredjedel av mutasjoner som skaper enkelt trinn bialleliske knockouts 23. I samsvar med dette, når TALEN ble påført på pig fibroblastceller ble bialleliske modifikasjoner som finnes i omtrent 15 til 40% av den totale positive kloner 14. Det er mulig at unnlatelse av å generere bialleliske KO kaniner i denne studien kan tyde på en art forskjell (dvs. kaniner vs griser) for en slik kapasitet på nuclease basert genet målretting. Det er imidlertid mer sannsynlig at dette er ganske enkelt fordi antall KO kaniner som genereres i dette prosjektet er relativt liten. Vi tror at ZFN er i stand til å generere bialleic mutasjoner i kaniner, som bør vurderes som en annen potensiell nytte av ZFN basert GTT kanin produksjon. Ytterligere eksperimenter for å bekrefte at en slik kapasitet ZFN hos kaniner.
Som en konklusjon, viser den foreliggende arbeid som ZFN basert genet målretting tilnærming er effektive i å produsere KO kaniner. Spesielt genererte vi fem ApoCIII KO kaniner med en tilfredsstillende transgen sats på 23,8%. Disse dyrene er antatt å gi mer meningsfull informasjon om dette proteinet rolle på lipid metabolisme hos mennesker enn de tilsvarende musemodeller. Vi spår ZFN basert genet målretting, samt andre nuklease baserte teknologier som TALEN og rgen, vil i ikke-murint dyr betydelig rette for utvikling av nye dyremodeller for å studere ulike menneskelige sykdommer.
Figur 1. Kanalisering av produksjon av knockout kaniner bruker ZFN teknologi. Produksjon av KO kaniner som bruker ZFN teknologi starter med valg av genet av interesse. Sekvensen informasjonen er gitt, ZFN sett er utformet, og subjected til gjær basert in-house validering. På sjekkpunkt (CP) 1 (CP-1), vil bare de settene gått in-house validering (50% eller høyere av den interne positiv kontroll) gis til brukerne for utvalget. Hvis ingen sett passerer CP-en, kan ytterligere sekvens være nødvendig for å utforme effektive ZFN sett. En in vitro-embryo validering blir fulgt for å sikre at det valgte ZFN settet kan indusere mutasjoner på utvalgte områder (CP-2). ZFN sett (s) vil kun bli brukt hvis det passerer CP-2 (> = 10% mutasjonsrater i in vitro befruktede egg). Svikt på CP-2 vil kreve en redesign av de ZFN settene. Embryo givere vil bli utarbeidet og pronuclear scene embryo vil bli microinjected med validerte ZFN settene. Disse microinjected embryo vil bli overført til synkroniserte embryo mottakere. Etter en måned drektighetstid, vil nyfødte bli genotypede (CP-3). Hvis ingen av de nyfødte er positive, vil ytterligere mikroinjeksjon utføres. Det tar 2-3 måneder fra prosjektstart til CP-2, forutsatt no svikt i løpet av prosessen. Det tar ytterligere 2-3 måneder fra CP-2 til CP-3. Derfor er det mulig å generere en knockout kanin i en 4-6 måneders tidsramme bruker ZFN teknologien. Klikk her for å se større bilde .
Figur 2. ZFN design. Tre ZFN sett (Sett 1, 2, og 3) ble utformet målretting ulike sekvenser på Exon en eller Exon 2 av kanin ApoCIII (A). Alle tre sett ble utsatt for gjær MEL-1 reporter-analysen for å bestemme de ZFN aktiviteter. I henhold til produsentens protokoller, blir ZFNs som viser> 50% virksomhet av den av fremstilling intern positiv kontroll ansett som nyttige for in vitro-og in vivo-genomet redigerings eksperimenter.De ZFN aktiviteter var 224,2% for Set 1, 196,9% for Set 2 og 177,8% for Set 3 (B), derfor ligger en ble valgt i denne studien. Klikk her for å se større bilde .
Figur 3. In vitro embryo validering av ZFN. Den mRNA (5 ug / ml) av Set 1 ble microinjected til cytoplasma av 35 pronuclear stadium kanin embryoer (A). Spyles embryoer uten mikroinjeksjon behandling (n = 31) ble anvendt som kontrollgruppe. Den BL utviklingshastighet var 77,4% i kontrollgruppen. I microinjected gruppen, BL Prosenten var 51,4%. Av 16 BLs utsatt for PCR-sekvensering, ble 8 (50%) identifisert som positiv, indikerer Set 1 er en effektiv ZFN settet for å indusere mutasjoner ved innsiktnting hotellet (B, apoc3wt.seq, svart-eske) av ApoCIII i kaniner. BLS inneholdende mutasjoner er BL # apoc-3, 4, 5, 7, 11, 13, 15, og 17 (B, red understreket). De resterende BLs (# apoc-2, 6, 9, 10, 12, 14 og 16) ikke har mutasjoner i målretting nettstedet. Klikk her for å se større bilde .
Figur 4. Produksjon av ApoCIII KO kaniner. Ett hundre og førtifem embryoer microinjected med ZFN Set 1 mRNA ble overført til syv pseudo-gravid mottaker kaniner (A). Ferskt spyles embryoer (n = 75) uten ZFN mikroinjeksjon ble overført til mottakere (n = 6) i kontrollgruppen. Begrepet rente beregnes som total sikt kits / total embryoer i eksperiment-gruppen er 140,5% (21/145), mens hastigheten er 29,3% (22/75) i kontroll-gruppen (A). Ut av 21 kits født i microinjected gruppen, fem (R1, R9, R11, R12 og R16) ble identifisert som positive KO kits etter PCR sekvensering (B). De indels på målretting nettstedet inkluderer to innsettinger (en for både R9 og R11) og tre strykninger (Δ1, Δ 20, Δ 21 for R1, R12 og R16, henholdsvis). Klikk her for å se større bilde .
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble delvis finansiert med tilskudd fra National Institutes of Health (HL105114, HL088391, NS066652, og HL068878 til YEC), American Heart Association (National Forsker Development 0835237N til JZ). YEC er finansielt støttet som begavet Frederick Huetwell Professor of Cardiovascular Medicine ved University of Michigan Medical Center (UMMC). Dette arbeidet benyttes Core Services støttes av Center for Advanced Modeller for Translasjonsforskerne Sciences og Therapeutics (CAMTraST) på UMMC.
APOC3-ZFN | Sigma Aldrich | CSTZFNY-1KT | Target Gene: APOC3, Lot Number: 12201118MN |
mMESSAGE kit | Invitrogen | AM1344M | mRNA synthesis |
MEGAclear Kit | Invitrogen | AM1908M | mRNA purification |
Follicle-stimulating hormone | Bioniche Life Sciences | Folltropin-V | Treating embryo donor rabbits |
Human chorionic gonadotropin | Intervet | Chorulon | Treating embryo donor rabbits |
Gonadotropin-releasing hormone | Prospecbio | HOR-255 | Treating embryo recipient rabbits |
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) | Thermo Fisher Scientific | SH30029.02 | Embryo culture, base medium |
MEM (nonessential amino acid) | Sigma Aldrich | M7145 | Embryo culture, supplements |
BME AMINO ACIDS solution | Sigma Aldrich | B6766 | Embryo culture, supplements |
Glutamine | Gibco | 25030-149 | Embryo culture, supplements |
Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | Embryo culture, supplements |
Fetal bovine serum | Sigma Aldrich | 12003C | Embryo culture, supplements |
HEPES buffered TCM 199 | Gibco | 12350039 | Embryo manipulation medium |
Incubator | Eppendorf | Galaxy 170 | Embryo culture equipment |
Micromanipulator | Eppendorf | TransferMan NK 2 | Embryo manipulation equipment |
Micropipette puller | Sutter Instruments Inc. | P-1000 | Embryo manipulation equipment |
Microinjector | Tritech Research | MINJ-D | Embryo manipulation equipment |
Borosilicate glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-6 | Embryo manipulation supply |
Euthasol (pentobarbitol sodium) | Virbac AH, Inc. | ANADA#200-071 | Euthanization of embryo donor rabbits |