Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Produktion af Apolipoprotein C-III Knockout Kaniner hjælp zinkfinger Nucleaser

doi: 10.3791/50957 Published: November 18, 2013

Summary

Seneste udvikling i gen-targeting værktøjer gør produktionen af ​​knockout (KO) kaniner muligt. I det nuværende arbejde, vi genererede fem Apolipoprotein (Apo) C-III KO kaniner bruger Zink Finger Nucleaser (ZFN). Dette arbejde viste, at ZFN er en yderst effektiv metode til at producere KO kaniner.

Abstract

Apolipoprotein (Apo) C-III (ApoCIII) ligger på overfladen af ​​plasma chylomikron (CM), meget lav densitet lipoprotein (VLDL) og high density lipoprotein (HDL). Det er blevet anerkendt, at høje niveauer af plasma ApoCIII constitutea risikofaktor for hjerte-kar-sygdomme (CVD). Forhøjet plasma ApoCIII niveau ofte korrelerer med insulinresistens, fedme og hypertriglyceridæmi. Uvurderlig viden om roller ApoCIIIin lipid stofskifte og CVD er opnået fra transgene musemodeller, herunder ApoCIII knockout (KO) mus, men det bemærkes, at metabolismen af ​​lipoprotein i mus er forskellig fra mennesker i mange aspekter. Det er ikke kendt før nu, om forhøjet plasma ApoCIII er direkte aterogene. Vi arbejdede på at udvikle ApoCIII KO kaniner i nærværende undersøgelse baseret på den hypotese, at kaniner kan tjene som en reasonablemodelfor studere menneskets lipidmetabolisme og åreforkalkning. Zink finger nukleaseresistente (ZFN) sæt målretning kanin ApoCIIIgene blev udsat for in vitro-validering før embryo mikroinjektion. MRNA blev injiceret til cytoplasma 35 kanin pronukleær embryoer, og evalueret mutationsrater på blastocyst tilstand. Af seksten blastocyster, der blev analyseret, blev et tilfredsstillende 50% mutation sats (8/16) på målretning stedet opnået støtte brugen af Set 1 til in vivo eksperimenter. Dernæst vi mikroinjiceret 145 fostre med Set 1 mRNA og overført disse embryoner til 7 modtagende kaniner. Efter 30 dage drægtighed blev 21 kits født, hvoraf fem blev bekræftet som ApoCIII KO kaniner efter PCR sekventering assays. KO dyr sats (# KO kits / samlet født) var 23,8%. Den samlede produktion effektivitet er 3,4% (5 kits/145 embryoner overføres). Den foreliggende arbejde viste, at ZFN er en yderst effektiv metode til at producere KO kaniner. Disse ApoCIII KO kaniner er nye ressourcer til at studere roller ApoCIII i lipid stofskiftet.

Introduction

Apolipoprotein (Apo) C-III (ApoCIII) er en lille O-glycosyleret sekretorisk protein, som syntetiseres hovedsageligt i leveren og tarmen. Det ligger på overfladen af ​​plasma chylomikron (CM), meget lav densitet lipoprotein (VLDL) og high density lipoprotein (HDL). ApoCIII er blevet anerkendt som en risikofaktor for hjerte-kar-sygdom 1. Patienter med arvelig mangel på ApoCIII har lav plasma triglycerid (TG) niveauer og reduceret subklinisk koronar åreforkalkning 2,3. Forhøjede plasma ApoCIII plan på den anden side ofte korrelerer med insulinresistens, fedme og hypertriglyceridæmi (HTG) 4,5.

Gene knockout (KO) er et effektivt middel til at studere funktionen af ​​et gen. I overensstemmelse med bemærkningerne i humane mutant populationer knockout af ApoCIII genet i mus førte til en reduktion af plasma TG og beskyttelse mod postprandial HTG 6. En sådan positiv rolle ApoCIII optrådteat være uafhængig af apolipoprotein E (ApoE), som mus, der mangler både ApoE og ApoCIII også er beskyttet mod postprandial hyperlipidæmi 7. Selv om disse ApoCIII KO musemodeller har givet uvurderlige oplysninger om mulige funktioner ApoCIII hos mennesker, skal det bemærkes, at metabolismen af ​​lipoprotein af mus er forskellig fra mennesker i mange aspekter. For eksempel mangler museplasma cholesterylesteroverførselsprotein (CETP), et enzym, der er involveret i transport af VLDL, LDL og HDL 8. Derfor er det nødvendigt at udvikle en passende dyremodel for yderligere at forstå den fysiologiske rolle ApoCIII in vivo.

Kaninen er en klassisk model dyreart 9-11. Den har en kort drægtighedsperiode (30-31 dage), stor kuldstørrelse (4-12/litter) og kan huse bekvemt i et indendørs anlæg. Sammenlignet med mus, kaniner er fylogenetisk tættere på mennesker 10. Vigtigere er det, som humand, men i modsætning til mus, kaniner er LDL-rige pattedyr og har betydelige niveauer af CETP 10,12. Desuden er de modtagelige for kolesterol-rig kost-induceret åreforkalkning med læsioner svarende til dem, der ses i menneskelig åreforkalkning 13.. Af disse grunde har vi den hypotese, at ApoCIII KO kaniner kan tjene som en bedre model end deres murine modparter at undersøge roller ApoCIIIplay i lipidmetabolisme og atherosklerose hos mennesker.

Produktion af genet målrettet transgene (GTT) kaniner har været en udfordring. Dette er primært på grund af manglende germline transmission embryonale stamceller (ESC), og den ekstremt lave effektivitet kropsceller (SCNT) hos kaniner. ESC er det primære værktøj til at generere GTT mus, hvorimod og SCNT har været anvendt med succes til at generere KO dyr i arter mangler germline sender økonomiske og sociale råd, herunder svin, får og kvæg, men ikke kaniner. Senest zinkfinger Nuclease (ZFN) Tranvelse Activator-Like Effector Nuclease (TALEN) 14, og RNA Guidet Endonuclease (Jørgen) 15 dukket op som effektivt middel til genom redigering. Disse nukleaser, såkaldte "molekylære sakse", er effektive i at generere dobbeltstrengede brud (DSB) i genomet, der kan føre til en funktionel KO af målgenet eller anvendes til at integrere en DNA-sekvens på et specifikt locus i genomet i en række arter 16. I 2011 blandt de første tilpasning af ZFN teknologi, vi genererede peroxisomproliferatoraktiveret receptor gamma (PPARy) KO svin celler via denne fremgangsmåde og med held genererede PPAR KO grise efter brug af disse celler til SCNT 17. I samme år blev effektiv immunoglobulingen forstyrrelser og målrettet erstatning hos kaniner også bruger ZFN indberettet 18.

I den foreliggende undersøgelse blev fem ApoCIII KO kaniner frembragt som bekræftet ved PCR-sekventering under anvendelse ZFN Set 1 (se figur 1

Protocol

Alle vedligeholdelse dyr, pasning og anvendelse procedurer blev gennemgået og godkendt af universitetet Udvalg om brug og pleje af dyr fra University of Michigan.

1.. ZFN Design og Selection

  1. Forsyne den genomiske sekvens information af genet af interesse (f.eks kanin ApoCIII) til fabrikanten. Vælg ZFN sæt (r) til forsøgene baseret på ZFN scoringer.

2. Kanin embryonindsamlingsteam

  1. Superovulere seksuelt modnet (6-18 måneder) New Zealand White (NZW) hunkaniner ved subkutan (sc) injektion af FSH to gange / dag med en dosis på 3 mg for de første to injektioner, 5 mg for de næste to injektioner og 6 mg de sidste to injektioner.
  2. Administrere en enkelt intravenøs (iv) injektion af 200 IU hCG på 72 timer efter den første FSH injektion for at inducere ægløsning. Parre superovulated hunner med en mandlig kanin umiddelbart efter hCG injektionen.
  3. Euthanize de superovulated donor kaniner med natriumpentobarbital (150 mg / kg, iv) ved 16-18 timer efter insemination (psi).
  4. Recover æggelederen ampuller ved omhyggeligt at indsamle hele æggeledere og æggestokke struktur.
  5. Skyl hvert æggelederen med 10 ml manipulation medium HEPES pufret TCM 199 suppleret med 10% føtalt bovint serum, ved injektion af medium fra livmoderen ende af æggelederen. Opsaml skyllet medium ved æggestokken-endeåbning æggelederen til en petriskål.
  6. Observere og identificere inddrives embryoner i den blussende medium, vaske embryoner tre gange i manipulation medium, holde dem i manipulation medium ved 38,5 ° C i luft, og observere dem under et stereomikroskop for forekomst af befrugtning. Forbered mikroinjektion på pronukleær embryoer 19-21 timer psi

3. Udarbejdelse af ZFN mRNA

  1. Renses det resulterende mRNA før resuspension i RNAse-fri 0.1X TE (1 mM Tris-CI pH8,0, 0,1 mM EDTA). Måle koncentrationen og gemme mRNA ved -80 ° C indtil anvendelse.
  2. Forbered mRNA'er koder ZFN par (4-10 ng / gl i 1 mM Tris-CI, 0,1 mM EDTA ved pH 7,5), alikvot i 10 hætteglas pi. Opbevar dem ved -80 º C, indtil klar til brug. Før mikroinjektion, tø RNA hætteglas (r), og holde det på is.

4.. Embryo Mikroinjektion

  1. Forbered mikroinjektion platform ved at placere en 5 ul dråbe manipulation medium på en 1-godt kammer dias, har medierne kammer fjernet. Dæk medium dråbe med mineralsk olie og sted på den opvarmede mikroskop scenen.
  2. Placer holde pipette (120 um diameter) i holderen arm mikromanipulator og placer det i dråbe manipulation medium.
  3. Fabrikere injektion mikropipetter ved opvarmning og trække borosilikatglas kapillarrør i en mikropipette aftrækker enhed. Indlæse mRNA til injektion i injektion pipette.
  4. Tænd trykluft, der er forbundet til en mikroinjektor.
  5. Placer indsprøjtning pipette i holderen injektion, sætte det på mikromanipulator og placer det i den dråbe manipulation medium.
  6. Setup mikroinjektor med følgende foreslåede parametre: holdP = 2 psi, InjP = 20 psi, ClearP = 60 psi, Injtime = 1 sekund, hvilket vil resultere i et injektionsvolumen på 1-5 pl.
  7. Åbn spidsen af ​​indsprøjtning pipetten ved forsigtigt at banke den mod den bedrift pipette.
  8. Overfør embryoner (30-50) til mikromanipulering slip på platformen. Brug den bedrift pipette for at fange et foster og tilpasse kanylen, embryoner og afholdelsen pipetten langs x-aksen.
  9. Under 400X forstørrelse, fremme indsprøjtning pipetten gennem embryoet. Vær omhyggelig med at undgå kernen. Når plasmamembranen er gennemboret, skal du trykke på fodpedal injicere. Efter injektion, træk kanylen Slip embryoet. Gentag processen for alle resterende embryos.
  10. Vask injicerede embryoner tre gange i embryo dyrkningsmedium, der består af Earles Balanced Salt Solution (EBSS) suppleret med ikke-essentielle aminosyrer (NEAA), essentielle aminosyrer (EAA), 1 mM L-glutamin, 0,4 mM natriumpyruvat og 10% FBS.
  11. Inkuber embryoner ved 38,5 ° C i 5% CO2 i luft i 1-2 timer, før de er kirurgisk overført til æggelederne af en synkroniseret recipient hun-NZW kaniner (se trin 5.1). Alternativt kultur embryoner, indtil de når blastocyststadiet før de anvendes til in vitro-validering eller analyser.

5.. Embryo Transfer

  1. Vælg en kvindelig NZW kanin 5-12 måneder gammel, ved godt helbred, der vejer ca. 4,0 af 5,0 kg som modtager dyr. Administrere Gonadotropin Releasing Hormone (GnRH) injektion intramuskulært (im, 50 mcg / ml, 0,3 ml / dyr) til modtageren på samme tidspunkt med den af ​​hCG injektion til donordyret (r) (se trin 2.2). Efter afslutningen af ​​mikroinjektion, forberede modtageren kanin for ægoplægning (normalt 16-24 timer efter GnRH injektion). Bedøve kanin med 10-40 mg / kg ketamin (im), og / eller fordampes isofluran (2-4%) ved indånding. Beskyt kaninens øjne mod overdreven udtørring ved anvendelse af en steril ophthalmisk salve. Overhold dyret, indtil det er helt ubevidst, dvs. reagerer ikke på pedal reflekser, klemme foden pad bruges til at kontrollere på grund af manglende pedal refleks, der er en indikation af passende bedøvelse.
  2. Barbere kaninens mave, vask med antiseptisk krat, efterfulgt af antiseptisk opløsning, og aftør det barberede område med steril gaze svampe.
  3. Udføre kirurgi under sterile forhold, optage vitale tegn på modtagerens kanin cirka hver 15 minutter hele operationen.
  4. Overfør 10-25 embryoner til én modtager dyr, afhængigt af den tilgængelige antal embryoner.
  5. Ved udgangen afkirurgiske procedurer, lukke muskel lag med coated resorberbar sutur. Suturere huden med enten en subkutikulær sutur hjælp resorberbar sutur eller med enkle afbrudte hud suturer hjælp nonabsorable sutur (f.eks monofil nylon eller lignende).
  6. Hold dyret varm og overvåge den, indtil dens brystleje er nået.
  7. Overvåg dyret dagligt. Følg dyrlægens anvisninger til at passe dyret. Indgiv meloxicam (sc 1,0 mg / kg) til at lindre smerter og / eller reducere feber daglige indlæg drift, hvis bestemt nødvendig af dyrlægen.
  8. Fjern nonabsorable hud suturer på omkring 10-14 dage efter operationen.

6.. Påvisning af ZFN induceret genafbrydelse

  1. Til in vitro validering, udføre genotypebestemmelse på in vitro dyrkede embryoner. Lyse individuelle embryoner, der er udviklet til morula / blastocyst stadier i 5 pi NP40 opløsning (1% NP40 plus 1 ug / ml proteinase K i Taq Buffer) I 0,5-1 timer ved 55 ° C og 10 minutter ved 95 ° C.
  2. For genotypebestemmelse af afkommet, indsamle øre hudprøver fra nyfødte kits, ekstrakt genomisk DNA, og bruge dem som skabeloner til PCR-sekventering. Påfør Kwik-Stop til prøveudtagning område efter indsamling for at stoppe blødningen og reducere ubehag.
  3. Brug lysis fra trin 6.2 eller 6.3 som template for PCR under anvendelse af LA-Taq-og PCR-primer-par, som er placeret opstrøms (5'-TGAGGCCGGGAAGGGAGCAGTCG-3 ') og nedstrøms (5'-GCCAGGCCCACCCACGGAACAGC-3') af ZFN målstedet .
  4. Oprense PCR-produkter og sekventere dem med sekventeringsprimer (5'-TCTGCACGCTTGGGGCTGGAG-3 ').
  5. Identificer muterede prøver ved at lede efter dobbelt kurve i sekvensdiagrammet omkring målretning site. Mærk dem med dobbelte kurver som "positive".
  6. Klone "positive" PCR-produkter i TA kloningsvektor, afhente 10-20 kloner, sekvens indsatserne, og bekræft mutationer omkring targeting site.

Representative Results

In vitro validering af ZFN par
Seksten ZFN par blev oprindeligt udformet. Den målrettede forstyrrelse sekvens af sæt 1 er placeret på Exon 2 kanin ApoCIII (figur 2A). Tre par (Sæt 1, 2 og 3, figur 2A) blev udvalgt og udsat for gær MEL-1 reporter assay for at bestemme de ZFN aktiviteter (figur 2B). Sæt 1 har en ZFN score på 224,2%, højere end sæt 2 (196,9%) og Set 3 (177,8%) og meget højere end tærsklen udvælgelse (dvs. 50% af det indre positiv kontrol). Derfor Set 1 blev udvalgt til in vitro-validering eksperimenter.

Et bestemt sæt nødt til at resultere i en positiv rater i embryoner på 10% eller højere for at passere embryo validering af in vitro, på grundlag af de interne kriterier validering. MRNA (5 ug / ml) for Sæt 1 blev mikroinjiceret til cytoplasmaet af 35 pronukleær fase kanin embryoner (figur 3A </ Strong>). Skylles embryoer uden mikroinjektion behandling (n = 31) blev anvendt som kontrolgruppen. Atten embryoner af mikroinjiceret gruppen udviklede til BL scenen på D5, hvoraf seksten blev sekventeret, og otte (BL # APOC-3, 4, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 3B, rød understreget) vises muteret sekvenser på målretning stedet (sort-boxed, 2B, øverste række, apoC3wt.seq). BL på den mikroinjiceret gruppe (51,4%), er lavere end den for kontrolgruppen (77,4%), hvilket indikerer en smule forringet udviklingsmæssig kompetence mikroinjicerede embryoer. Den positive mutation rate af de mikroinjicerede embryoner er 50,0% (8/16), meget højere end tærsklen udvælgelse (dvs. 10%). Disse resultater viste, at Set 1 er en effektiv ZFN indstillet til at fremkalde mutationer på målretning stedet for kanin ApoCIII. Derfor Set 1 blev valgt til in vivo-fremstilling af ApoCIII KO kaniner.

Produktion af ApoCIII KO kaniner
MRNA of ZFN Set 1 blev mikroinjiceret til cytoplasma kanin pronukleær embryoer og overført 145 mikroinjicerede embryoner til 7 pseudo-gravid modtagende kaniner (figur 4A). Frisk skylles embryoner (n = 75) uden ZFN mikroinjektion blev overført til modtagere (n = 6), som kontrolgruppen. Efter 30 dage i drægtigheden blev 21 kits født i mikroinjiceret gruppe. PCR sekventering identificerede fem (apoC3-R1, R9, R11, R12 og R16), som positive KO kits (figur 4B). Udtrykket rente beregnes som den samlede langsigtede kits / samlede embryoner er 14,5% (21/145), mens andelen er 29,3% (22/75) i kontrolgruppen. Satsen KO opgøres som det samlede KO kits / samlet løbetid er 23,8% (5/21). En KO kit (apoC-R16) døde fem dage efter fødslen (20,0%, 1/5). Den indelsat målretning webstedet omfatter to indrykninger og tre sletninger, de areΔ1, +1, +1, Δ20 og Δ21 for Rabbits # R1, R9, R11, R12 og R16, (figur 4B).

Bioinformatics analyse blev anvendt til at identificere potentielle ZFN off-mål med 7 eller færre paradoksproblemer at indstille 1 sekvens, som beskrevet tidligere 17. Kun én forudsagde mulig off-target site, beliggende på kromosom 14, blev identificeret med 7 uoverensstemmende bps. PCR analyse fundet nogen off-target begivenheder i nogen af ​​de stiftende dyr.

Discussion

I det nuværende arbejde, blev fem ApoCIII KO kaniner genereres ved hjælp af den ZFN teknologien. Tidligere er den eneste rapport af produktionen af GTT kaniner brugte også ZFN teknologi 18. Den foreliggende arbejde bekræftede, at ZFN er nyttigt til effektivt at målrette gener i kaniner.

I den foreliggende undersøgelse, det transgene sats (positiv kits / samlet født) is23.8% (5/21), hvilket er sammenligneligt med den tidligere ZFN rapport i kaniner (30,8%, 16/52) 18, og som er rapporteret for at bruge ZFN i andre dyrearter, herunder zebra fisk 19 mus 20, rotter 21 og svin 17. Denne sats er faktisk højere end satserne for mange konventionelle transgene kanin produktions studier, der normalt falder i intervallet 5-20%. For eksempel, i et forsøg på at produktet ApoCIII transgene kaniner via traditionel DNA mikroinjektion opnået Ding et al. Tre positive stifterne ud af 54 unger født (5,6%) 22.

I overensstemmelse med tidligere resultater, de mutationer i de målretning sites er variable, herunder sletninger eller indsættelser bestående forskelligt antal baser (lige 1-21 i de fem KO kaniner). Baseret på den specifikke sekvens information af stamdyr, forventes det, at mindst fire (dvs.. Der indeholder Δ1, +1, +1, eller Δ20 mutationer) vil have funktion tab af ApoCIII. Animal R-16 med Δ21 må ikke vise funktionelle tab, da denne mutation forudsiges kun forårsage tab af syv aminosyrer, men ikke en læseramme-forskydning. I sidste ende er det nødvendigt fænotype assays for at bestemme, om disse stamdyr virkelig vist tab af ApoCIII funktioner.

Ingen af ​​de fem KO kaniner genereret i den foreliggende undersøgelse indeholder biallelisk ændringer. Interessant, dette er også tilfældet i den foregående ZFN kanin rapport. I modsætning hertil, når ZFNs rettet α1 ,3-galactosyltransferase blev anvendt til svinceller, hyppigheden af rettet mod en enkelt allel varierede fra 7 til 46%, med cirka en tredjedel af mutationer skaber enkelt trin biallelisk knockouts 23. I overensstemmelse med dette, når TALEN blev anvendt svine fibroblastceller blev biallelisk ændringer fundet i ca 15-40% af den samlede positive kloner 14. Det er muligt, at den manglende generere biallelisk KO kaniner i nærværende undersøgelse kan indikere en art forskel (dvs. kaniner vs svin) for en sådan kapacitet nuklease baseret genmålsøgning. Det er dog mere sandsynligt, at dette er simpelthen fordi antallet af KO kaniner genereret i dette projekt er relativt lille. Vi mener, at ZFN er stand til at generere bialleic mutationer i kaniner, som bør betragtes som en anden potentiel fordel ved ZFN baserede GTT kanin produktion. Yderligere eksperimenter er nødvendige for at bekræfte en sådan kapacitet ZFN i kaniner.

Sammenfattende den foreliggende arbejde viser at ZFN baseret gentargeting fremgangsmåde er effektiv til at producere KO kaniner. I særdeleshed, vi genererede fem ApoCIII KO kaniner med en tilfredsstillende transgen sats på 23,8%. Disse dyr menes at give mere meningsfulde oplysninger om dette protein rolle på lipid stofskifte hos mennesker end de tilsvarende musemodeller. Vi forudser ZFN baserede gen målretning, samt andre nukleaseresistente baserede teknologier såsom TALEN og rgen vil i nonmurine dyr i væsentlig grad lette udviklingen af ​​nye dyremodeller for at studere forskellige menneskelige sygdomme.

Figur 1
Figur 1. Flow diagram af produktionen af knockout kaniner bruger ZFN teknologi. Produktion af KO kaniner under anvendelse ZFN teknologi starter med udvælgelsen af ​​genet af interesse. Rækkefølgen oplyses, ZFN sæt er udformet, og subjected gær baseret på intern validering. Ved check point (CP) 1 (CP-1), vil kun de apparater bestået intern validering (50% eller højere af det indre positiv kontrol) gives til de brugere, for udvælgelse. Hvis der ingen sæt pass CP-1 kan yderligere sekvens være behov for at designe effektive ZFN sæt. En in vitro-validering embryo følges for at sikre det valgte ZFN sættet kan fremkalde mutationer på udvalgte lokaliteter (CP-2). ZFN sæt (r), vil kun blive anvendt, hvis det passerer CP-2 (> = 10% mutationsrater i reagensglasforsøg embryoner). Svigt på CP-2 vil kræve et redesign af ZFN sæt. Embryo donorer vil blive forberedt og pronukleær embryoer vil blive mikroinjiceres med de validerede ZFN sæt. Disse mikroinjicerede embryoner vil blive overført til synkroniserede embryo modtagere. Efter en måned drægtighedsperioden, vil nyfødte genotypebestemme (CP-3). Hvis ingen af ​​de nyfødte er positiv, vil yderligere mikroinjektion blive udført. Det tager 2-3 måneder fra projektets start til CP-2, under forudsætning af no svigt under processen. Det tager yderligere 2-3 måneder fra CP-2 til CP-3. Derfor er det muligt at generere en knockout kanin i en 4-6 måneders tidsramme ved hjælp af ZFN teknologi. Klik her for at se større billede .

Figur 2
Figur 2. ZFN design. Tre ZFN sæt (Sæt 1, 2 og 3) var designet henvender sig til forskellige sekvenser på Exon 1 eller Exon 2 af kanin ApoCIII (A). Alle tre sæt blev udsat for gær MEL-1 reporter assay for at bestemme de ZFN aktiviteter. I overensstemmelse med producentens protokoller er ZFNs der viser> 50% aktiviteter efter fremstillingen interne positive kontrol betragtes som anvendelige til in vitro-og in vivo-genom redigering eksperimenter.De ZFN aktiviteter var 224,2% for Set 1, 196,9% for sæt 2 og 177,8% for Set 3 (B), derfor Set 1 blev valgt i nærværende undersøgelse. Klik her for at se større billede .

Figur 3
Figur 3.. In vitro validering embryo af ZFN. MRNA (5 ug / ml) for Sæt 1 blev mikroinjiceret til cytoplasmaet af 35 pronukleær fase kanin embryoner (A). Skylles embryoer uden mikroinjektion behandling (n = 31) blev anvendt som kontrolgruppen. Den BL udvikling lå 77,4% i kontrolgruppen. I mikroinjiceres gruppe, BL sats var 51,4%. 16 BLS udsat for PCR-sekventering blev 8 (50%) identificeres som positiv, hvilket Set 1 er en effektiv ZFN sæt til at inducere mutationer på targeTing stedet (B, apoc3wt.seq, sort-boxed) af ApoCIII i kaniner. BLS indeholder mutationer er BL # APOC-3, 4, 5, 7, 11, 13, 15, og 17 (B, rød understreget). De resterende BLS (# APOC-2, 6, 9, 10, 12, 14 og 16) ikke har mutationer på målretning site. Klik her for at se større billede .

Figur 4
Figur 4.. Produktion af ApoCIII KO kaniner. Et hundrede og femogfyrre embryoner mikroinjicerede med ZFN Sæt 1 mRNAer blev overført til 7 pseudo-gravid modtagende kaniner (A). Frisk skylles embryoner (n = 75) uden ZFN mikroinjektion blev overført til modtagere (n = 6), som kontrolgruppen. Udtrykket rente beregnes som den samlede langsigtede kits / samlede embryoner i eksperiment gruppe er 14.5% (21/145), mens andelen er 29,3% (22/75) i kontrolgruppen (A). Ud af 21 kits født i mikroinjiceret gruppe, fem (R1, R9, R11, R12 og R16), blev identificeret som positive KO kits efter PCR-sekventering (B). De indels på målretning webstedet omfatter to indrykninger (+1 for både R9 og R11) og tre sletninger (Δ1, Δ 20 Δ 21 for R1, R12 og R16, henholdsvis). Klik her for at se større billede .

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev delvist finansieret af tilskud fra National Institutes of Health (HL105114, HL088391, NS066652 og HL068878 til YEC), American Heart Association (National Scientist Development 0835237N til JZ). YEC er støttet som begavet Frederik Huetwell Professor of Cardiovascular Medicine ved University of Michigan Medical Center (UMMC). Dette arbejde udnyttes Core Services understøttes af Center for Advanced Models for Translationel Sciences og Therapeutics (CAMTraST) ved UMMC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APOC3-ZFN Sigma Aldrich CSTZFNY-1KT Target Gene: APOC3, Lot Number: 12201118MN
mMESSAGE kit Invitrogen AM1344M mRNA synthesis
MEGAclear Kit  Invitrogen AM1908M mRNA purification
Follicle-stimulating hormone Bioniche Life Sciences Folltropin-V Treating embryo donor rabbits
Human chorionic gonadotropin Intervet Chorulon Treating embryo donor rabbits
Gonadotropin-releasing hormone Prospecbio HOR-255 Treating embryo recipient rabbits
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)  Thermo Fisher Scientific SH30029.02 Embryo culture, base medium
MEM (nonessential amino acid) Sigma Aldrich M7145 Embryo culture, supplements
BME AMINO ACIDS solution Sigma Aldrich B6766 Embryo culture, supplements
Glutamine Gibco 25030-149 Embryo culture, supplements
Sodium pyruvate  Gibco 11360-070 Embryo culture, supplements
Fetal bovine serum Sigma Aldrich 12003C Embryo culture, supplements
HEPES buffered TCM 199  Gibco 12350039 Embryo manipulation medium
Incubator Eppendorf Galaxy 170 Embryo culture equipment
Micromanipulator  Eppendorf TransferMan NK 2 Embryo manipulation equipment
Micropipette puller Sutter Instruments Inc. P-1000 Embryo manipulation equipment
Microinjector  Tritech Research MINJ-D Embryo manipulation equipment
Borosilicate glass capillary tubes  World Precision Instruments, Inc. TW100F-6 Embryo manipulation supply
Euthasol (pentobarbitol sodium) Virbac AH, Inc. ANADA#200-071 Euthanization of embryo donor rabbits

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ooi, E. M., Barrett, P. H., Chan, D. C., Watts, G. F. Apolipoprotein C-III: understanding an emerging cardiovascular risk factor. Clinical Science. 114, 611-624 (2008).
  2. Pollin, T. I., et al. A null mutation in human APOC3 confers a favorable plasma lipid profile and apparent cardioprotection. Science. 322, 1702-1705 (2008).
  3. Ginsberg, H. N., et al. Apolipoprotein B metabolism in subjects with deficiency of apolipoproteins CIII and AI. Evidence that apolipoprotein CIII inhibits catabolism of triglyceride-rich lipoproteins by lipoprotein lipase in vivo. The Journal of Clinical Investigation. 78, 1287-1295 (1986).
  4. Cohn, J. S., et al. Increased apoC-III production is a characteristic feature of patients with hypertriglyceridemia. Atherosclerosis. 177, 137-145 (2004).
  5. Cohn, J. S., Patterson, B. W., Uffelman, K. D., Davignon, J., Steiner, G. Rate of production of plasma and very-low-density lipoprotein (VLDL) apolipoprotein C-III is strongly related to the concentration and level of production of VLDL triglyceride in male subjects with different body weights and levels of insulin sensitivity. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 89, 3949-3955 (2004).
  6. Maeda, N., et al. Targeted disruption of the apolipoprotein C-III gene in mice results in hypotriglyceridemia and protection from postprandial hypertriglyceridemia. The Journal of Biological Chemistry. 269, 23610-23616 (1994).
  7. Jong, M. C., et al. Apolipoprotein C-III deficiency accelerates triglyceride hydrolysis by lipoprotein lipase in wild-type and apoE knockout mice. Journal of Lipid Research. 42, 1578-1585 (2001).
  8. James, J. F., Hewett, T. E., Robbins, J. Cardiac physiology in transgenic mice. Circ. Res. 82, 407-415 (1998).
  9. Duranthon, V., et al. On the emerging role of rabbit as human disease model and the instrumental role of novel transgenic tools. Transgenic Research. 21, 699-713 (2012).
  10. Fan, J., Watanabe, T. Transgenic rabbits as therapeutic protein bioreactors and human disease models. Pharmacol. Ther. 99, 261-282 (2003).
  11. Shiomi, M., Ito, T. The Watanabe heritable hyperlipidemic (WHHL) rabbit, its characteristics and history of development: a tribute to the late Dr. Yoshio Watanabe. Atherosclerosis. 207, 1-7 (2009).
  12. Morehouse, L. A., et al. Inhibition of CETP activity by torcetrapib reduces susceptibility to diet-induced atherosclerosis in New Zealand White rabbits. Journal of Lipid Research. 48, 1263-1272 (2007).
  13. Getz, G. S., Reardon, C. A. Animal models of atherosclerosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32, 1104-1115 (2012).
  14. Carlson, D. F., et al. Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. (2012).
  15. Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F., Marraffini, L. A. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology. 31, 233-239 (2013).
  16. Petersen, B. Update on 'molecular scissors' for transgenic farm animal production. Reproduction, Fertility, and Development. 25, 317-318 (2012).
  17. Yang, D., et al. Generation of PPARgamma mono-allelic knockout pigs via zinc-finger nucleases and nuclear transfer cloning. Cell Research. 21, 979-982 (1038).
  18. Flisikowska, T., et al. Efficient immunoglobulin gene disruption and targeted replacement in rabbit using zinc finger nucleases. PLoS ONE. 6, e21045 (2011).
  19. Foley, J. E., et al. Targeted mutagenesis in zebrafish using customized zinc-finger nucleases. Nature Protocols. 4, 1855-1867 (2009).
  20. Carbery, I. D., et al. Targeted genome modification in mice using zinc-finger nucleases. Genetics. 186, 451-459 (2010).
  21. Mashimo, T., et al. Generation of knockout rats with X-linked severe combined immunodeficiency (X-SCID) using zinc-finger nucleases. PLoS ONE. 5, e8870 (2010).
  22. Ding, Y., et al. Hypertriglyceridemia and delayed clearance of fat load in transgenic rabbits expressing human apolipoprotein CIII. Transgenic Research. 20, 867-875 (2011).
  23. Hauschild, J., et al. Efficient generation of a biallelic knockout in pigs using zinc-finger nucleases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 12013-12017 (2011).
Produktion af Apolipoprotein C-III Knockout Kaniner hjælp zinkfinger Nucleaser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, D., Zhang, J., Xu, J., Zhu, T., Fan, Y., Fan, J., Chen, Y. E. Production of Apolipoprotein C-III Knockout Rabbits using Zinc Finger Nucleases. J. Vis. Exp. (81), e50957, doi:10.3791/50957 (2013).More

Yang, D., Zhang, J., Xu, J., Zhu, T., Fan, Y., Fan, J., Chen, Y. E. Production of Apolipoprotein C-III Knockout Rabbits using Zinc Finger Nucleases. J. Vis. Exp. (81), e50957, doi:10.3791/50957 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter