Seneste udvikling i gen-targeting værktøjer gør produktionen af knockout (KO) kaniner muligt. I det nuværende arbejde, vi genererede fem Apolipoprotein (Apo) C-III KO kaniner bruger Zink Finger Nucleaser (ZFN). Dette arbejde viste, at ZFN er en yderst effektiv metode til at producere KO kaniner.
Apolipoprotein (Apo) C-III (ApoCIII) ligger på overfladen af plasma chylomikron (CM), meget lav densitet lipoprotein (VLDL) og high density lipoprotein (HDL). Det er blevet anerkendt, at høje niveauer af plasma ApoCIII constitutea risikofaktor for hjerte-kar-sygdomme (CVD). Forhøjet plasma ApoCIII niveau ofte korrelerer med insulinresistens, fedme og hypertriglyceridæmi. Uvurderlig viden om roller ApoCIIIin lipid stofskifte og CVD er opnået fra transgene musemodeller, herunder ApoCIII knockout (KO) mus, men det bemærkes, at metabolismen af lipoprotein i mus er forskellig fra mennesker i mange aspekter. Det er ikke kendt før nu, om forhøjet plasma ApoCIII er direkte aterogene. Vi arbejdede på at udvikle ApoCIII KO kaniner i nærværende undersøgelse baseret på den hypotese, at kaniner kan tjene som en reasonablemodelfor studere menneskets lipidmetabolisme og åreforkalkning. Zink finger nukleaseresistente (ZFN) sæt målretning kanin ApoCIIIgene blev udsat for in vitro-validering før embryo mikroinjektion. MRNA blev injiceret til cytoplasma 35 kanin pronukleær embryoer, og evalueret mutationsrater på blastocyst tilstand. Af seksten blastocyster, der blev analyseret, blev et tilfredsstillende 50% mutation sats (8/16) på målretning stedet opnået støtte brugen af Set 1 til in vivo eksperimenter. Dernæst vi mikroinjiceret 145 fostre med Set 1 mRNA og overført disse embryoner til 7 modtagende kaniner. Efter 30 dage drægtighed blev 21 kits født, hvoraf fem blev bekræftet som ApoCIII KO kaniner efter PCR sekventering assays. KO dyr sats (# KO kits / samlet født) var 23,8%. Den samlede produktion effektivitet er 3,4% (5 kits/145 embryoner overføres). Den foreliggende arbejde viste, at ZFN er en yderst effektiv metode til at producere KO kaniner. Disse ApoCIII KO kaniner er nye ressourcer til at studere roller ApoCIII i lipid stofskiftet.
Apolipoprotein (Apo) C-III (ApoCIII) er en lille O-glycosyleret sekretorisk protein, som syntetiseres hovedsageligt i leveren og tarmen. Det ligger på overfladen af plasma chylomikron (CM), meget lav densitet lipoprotein (VLDL) og high density lipoprotein (HDL). ApoCIII er blevet anerkendt som en risikofaktor for hjerte-kar-sygdom 1. Patienter med arvelig mangel på ApoCIII har lav plasma triglycerid (TG) niveauer og reduceret subklinisk koronar åreforkalkning 2,3. Forhøjede plasma ApoCIII plan på den anden side ofte korrelerer med insulinresistens, fedme og hypertriglyceridæmi (HTG) 4,5.
Gene knockout (KO) er et effektivt middel til at studere funktionen af et gen. I overensstemmelse med bemærkningerne i humane mutant populationer knockout af ApoCIII genet i mus førte til en reduktion af plasma TG og beskyttelse mod postprandial HTG 6. En sådan positiv rolle ApoCIII optrådteat være uafhængig af apolipoprotein E (ApoE), som mus, der mangler både ApoE og ApoCIII også er beskyttet mod postprandial hyperlipidæmi 7. Selv om disse ApoCIII KO musemodeller har givet uvurderlige oplysninger om mulige funktioner ApoCIII hos mennesker, skal det bemærkes, at metabolismen af lipoprotein af mus er forskellig fra mennesker i mange aspekter. For eksempel mangler museplasma cholesterylesteroverførselsprotein (CETP), et enzym, der er involveret i transport af VLDL, LDL og HDL 8. Derfor er det nødvendigt at udvikle en passende dyremodel for yderligere at forstå den fysiologiske rolle ApoCIII in vivo.
Kaninen er en klassisk model dyreart 9-11. Den har en kort drægtighedsperiode (30-31 dage), stor kuldstørrelse (4-12/litter) og kan huse bekvemt i et indendørs anlæg. Sammenlignet med mus, kaniner er fylogenetisk tættere på mennesker 10. Vigtigere er det, som humand, men i modsætning til mus, kaniner er LDL-rige pattedyr og har betydelige niveauer af CETP 10,12. Desuden er de modtagelige for kolesterol-rig kost-induceret åreforkalkning med læsioner svarende til dem, der ses i menneskelig åreforkalkning 13.. Af disse grunde har vi den hypotese, at ApoCIII KO kaniner kan tjene som en bedre model end deres murine modparter at undersøge roller ApoCIIIplay i lipidmetabolisme og atherosklerose hos mennesker.
Produktion af genet målrettet transgene (GTT) kaniner har været en udfordring. Dette er primært på grund af manglende germline transmission embryonale stamceller (ESC), og den ekstremt lave effektivitet kropsceller (SCNT) hos kaniner. ESC er det primære værktøj til at generere GTT mus, hvorimod og SCNT har været anvendt med succes til at generere KO dyr i arter mangler germline sender økonomiske og sociale råd, herunder svin, får og kvæg, men ikke kaniner. Senest zinkfinger Nuclease (ZFN) Tranvelse Activator-Like Effector Nuclease (TALEN) 14, og RNA Guidet Endonuclease (Jørgen) 15 dukket op som effektivt middel til genom redigering. Disse nukleaser, såkaldte "molekylære sakse", er effektive i at generere dobbeltstrengede brud (DSB) i genomet, der kan føre til en funktionel KO af målgenet eller anvendes til at integrere en DNA-sekvens på et specifikt locus i genomet i en række arter 16. I 2011 blandt de første tilpasning af ZFN teknologi, vi genererede peroxisomproliferatoraktiveret receptor gamma (PPARy) KO svin celler via denne fremgangsmåde og med held genererede PPAR KO grise efter brug af disse celler til SCNT 17. I samme år blev effektiv immunoglobulingen forstyrrelser og målrettet erstatning hos kaniner også bruger ZFN indberettet 18.
I den foreliggende undersøgelse blev fem ApoCIII KO kaniner frembragt som bekræftet ved PCR-sekventering under anvendelse ZFN Set 1 (se figur 1 </sTrong>. for flowdiagramillustration). Disse dyr er nye ressourcer til at studere roller ApoCIII i lipid stofskiftet.
I det nuværende arbejde, blev fem ApoCIII KO kaniner genereres ved hjælp af den ZFN teknologien. Tidligere er den eneste rapport af produktionen af GTT kaniner brugte også ZFN teknologi 18. Den foreliggende arbejde bekræftede, at ZFN er nyttigt til effektivt at målrette gener i kaniner.
I den foreliggende undersøgelse, det transgene sats (positiv kits / samlet født) is23.8% (5/21), hvilket er sammenligneligt med den tidligere ZFN rapport i kaniner (30,8%, 16/52) 18, og som er rapporteret for at bruge ZFN i andre dyrearter, herunder zebra fisk 19 mus 20, rotter 21 og svin 17. Denne sats er faktisk højere end satserne for mange konventionelle transgene kanin produktions studier, der normalt falder i intervallet 5-20%. For eksempel, i et forsøg på at produktet ApoCIII transgene kaniner via traditionel DNA mikroinjektion opnået Ding et al. Tre positive stifterne ud af 54 unger født (5,6%) 22.
I overensstemmelse med tidligere resultater, de mutationer i de målretning sites er variable, herunder sletninger eller indsættelser bestående forskelligt antal baser (lige 1-21 i de fem KO kaniner). Baseret på den specifikke sekvens information af stamdyr, forventes det, at mindst fire (dvs.. Der indeholder Δ1, +1, +1, eller Δ20 mutationer) vil have funktion tab af ApoCIII. Animal R-16 med Δ21 må ikke vise funktionelle tab, da denne mutation forudsiges kun forårsage tab af syv aminosyrer, men ikke en læseramme-forskydning. I sidste ende er det nødvendigt fænotype assays for at bestemme, om disse stamdyr virkelig vist tab af ApoCIII funktioner.
Ingen af de fem KO kaniner genereret i den foreliggende undersøgelse indeholder biallelisk ændringer. Interessant, dette er også tilfældet i den foregående ZFN kanin rapport. I modsætning hertil, når ZFNs rettet α1 ,3-galactosyltransferase blev anvendt til svinceller, hyppigheden af rettet mod en enkelt allel varierede fra 7 til 46%, med cirka en tredjedel af mutationer skaber enkelt trin biallelisk knockouts 23. I overensstemmelse med dette, når TALEN blev anvendt svine fibroblastceller blev biallelisk ændringer fundet i ca 15-40% af den samlede positive kloner 14. Det er muligt, at den manglende generere biallelisk KO kaniner i nærværende undersøgelse kan indikere en art forskel (dvs. kaniner vs svin) for en sådan kapacitet nuklease baseret genmålsøgning. Det er dog mere sandsynligt, at dette er simpelthen fordi antallet af KO kaniner genereret i dette projekt er relativt lille. Vi mener, at ZFN er stand til at generere bialleic mutationer i kaniner, som bør betragtes som en anden potentiel fordel ved ZFN baserede GTT kanin produktion. Yderligere eksperimenter er nødvendige for at bekræfte en sådan kapacitet ZFN i kaniner.
Sammenfattende den foreliggende arbejde viser at ZFN baseret gentargeting fremgangsmåde er effektiv til at producere KO kaniner. I særdeleshed, vi genererede fem ApoCIII KO kaniner med en tilfredsstillende transgen sats på 23,8%. Disse dyr menes at give mere meningsfulde oplysninger om dette protein rolle på lipid stofskifte hos mennesker end de tilsvarende musemodeller. Vi forudser ZFN baserede gen målretning, samt andre nukleaseresistente baserede teknologier såsom TALEN og rgen vil i nonmurine dyr i væsentlig grad lette udviklingen af nye dyremodeller for at studere forskellige menneskelige sygdomme.
Figur 1. Flow diagram af produktionen af knockout kaniner bruger ZFN teknologi. Produktion af KO kaniner under anvendelse ZFN teknologi starter med udvælgelsen af genet af interesse. Rækkefølgen oplyses, ZFN sæt er udformet, og subjected gær baseret på intern validering. Ved check point (CP) 1 (CP-1), vil kun de apparater bestået intern validering (50% eller højere af det indre positiv kontrol) gives til de brugere, for udvælgelse. Hvis der ingen sæt pass CP-1 kan yderligere sekvens være behov for at designe effektive ZFN sæt. En in vitro-validering embryo følges for at sikre det valgte ZFN sættet kan fremkalde mutationer på udvalgte lokaliteter (CP-2). ZFN sæt (r), vil kun blive anvendt, hvis det passerer CP-2 (> = 10% mutationsrater i reagensglasforsøg embryoner). Svigt på CP-2 vil kræve et redesign af ZFN sæt. Embryo donorer vil blive forberedt og pronukleær embryoer vil blive mikroinjiceres med de validerede ZFN sæt. Disse mikroinjicerede embryoner vil blive overført til synkroniserede embryo modtagere. Efter en måned drægtighedsperioden, vil nyfødte genotypebestemme (CP-3). Hvis ingen af de nyfødte er positiv, vil yderligere mikroinjektion blive udført. Det tager 2-3 måneder fra projektets start til CP-2, under forudsætning af no svigt under processen. Det tager yderligere 2-3 måneder fra CP-2 til CP-3. Derfor er det muligt at generere en knockout kanin i en 4-6 måneders tidsramme ved hjælp af ZFN teknologi. Klik her for at se større billede .
Figur 2. ZFN design. Tre ZFN sæt (Sæt 1, 2 og 3) var designet henvender sig til forskellige sekvenser på Exon 1 eller Exon 2 af kanin ApoCIII (A). Alle tre sæt blev udsat for gær MEL-1 reporter assay for at bestemme de ZFN aktiviteter. I overensstemmelse med producentens protokoller er ZFNs der viser> 50% aktiviteter efter fremstillingen interne positive kontrol betragtes som anvendelige til in vitro-og in vivo-genom redigering eksperimenter.De ZFN aktiviteter var 224,2% for Set 1, 196,9% for sæt 2 og 177,8% for Set 3 (B), derfor Set 1 blev valgt i nærværende undersøgelse. Klik her for at se større billede .
Figur 3.. In vitro validering embryo af ZFN. MRNA (5 ug / ml) for Sæt 1 blev mikroinjiceret til cytoplasmaet af 35 pronukleær fase kanin embryoner (A). Skylles embryoer uden mikroinjektion behandling (n = 31) blev anvendt som kontrolgruppen. Den BL udvikling lå 77,4% i kontrolgruppen. I mikroinjiceres gruppe, BL sats var 51,4%. 16 BLS udsat for PCR-sekventering blev 8 (50%) identificeres som positiv, hvilket Set 1 er en effektiv ZFN sæt til at inducere mutationer på targeTing stedet (B, apoc3wt.seq, sort-boxed) af ApoCIII i kaniner. BLS indeholder mutationer er BL # APOC-3, 4, 5, 7, 11, 13, 15, og 17 (B, rød understreget). De resterende BLS (# APOC-2, 6, 9, 10, 12, 14 og 16) ikke har mutationer på målretning site. Klik her for at se større billede .
Figur 4.. Produktion af ApoCIII KO kaniner. Et hundrede og femogfyrre embryoner mikroinjicerede med ZFN Sæt 1 mRNAer blev overført til 7 pseudo-gravid modtagende kaniner (A). Frisk skylles embryoner (n = 75) uden ZFN mikroinjektion blev overført til modtagere (n = 6), som kontrolgruppen. Udtrykket rente beregnes som den samlede langsigtede kits / samlede embryoner i eksperiment gruppe er 14.5% (21/145), mens andelen er 29,3% (22/75) i kontrolgruppen (A). Ud af 21 kits født i mikroinjiceret gruppe, fem (R1, R9, R11, R12 og R16), blev identificeret som positive KO kits efter PCR-sekventering (B). De indels på målretning webstedet omfatter to indrykninger (+1 for både R9 og R11) og tre sletninger (Δ1, Δ 20 Δ 21 for R1, R12 og R16, henholdsvis). Klik her for at se større billede .
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev delvist finansieret af tilskud fra National Institutes of Health (HL105114, HL088391, NS066652 og HL068878 til YEC), American Heart Association (National Scientist Development 0835237N til JZ). YEC er støttet som begavet Frederik Huetwell Professor of Cardiovascular Medicine ved University of Michigan Medical Center (UMMC). Dette arbejde udnyttes Core Services understøttes af Center for Advanced Models for Translationel Sciences og Therapeutics (CAMTraST) ved UMMC.
APOC3-ZFN | Sigma Aldrich | CSTZFNY-1KT | Target Gene: APOC3, Lot Number: 12201118MN |
mMESSAGE kit | Invitrogen | AM1344M | mRNA synthesis |
MEGAclear Kit | Invitrogen | AM1908M | mRNA purification |
Follicle-stimulating hormone | Bioniche Life Sciences | Folltropin-V | Treating embryo donor rabbits |
Human chorionic gonadotropin | Intervet | Chorulon | Treating embryo donor rabbits |
Gonadotropin-releasing hormone | Prospecbio | HOR-255 | Treating embryo recipient rabbits |
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) | Thermo Fisher Scientific | SH30029.02 | Embryo culture, base medium |
MEM (nonessential amino acid) | Sigma Aldrich | M7145 | Embryo culture, supplements |
BME AMINO ACIDS solution | Sigma Aldrich | B6766 | Embryo culture, supplements |
Glutamine | Gibco | 25030-149 | Embryo culture, supplements |
Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | Embryo culture, supplements |
Fetal bovine serum | Sigma Aldrich | 12003C | Embryo culture, supplements |
HEPES buffered TCM 199 | Gibco | 12350039 | Embryo manipulation medium |
Incubator | Eppendorf | Galaxy 170 | Embryo culture equipment |
Micromanipulator | Eppendorf | TransferMan NK 2 | Embryo manipulation equipment |
Micropipette puller | Sutter Instruments Inc. | P-1000 | Embryo manipulation equipment |
Microinjector | Tritech Research | MINJ-D | Embryo manipulation equipment |
Borosilicate glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-6 | Embryo manipulation supply |
Euthasol (pentobarbitol sodium) | Virbac AH, Inc. | ANADA#200-071 | Euthanization of embryo donor rabbits |