Den senaste utvecklingen inom riktad genmodifiering verktyg som gör produktionen av knockout (KO) kaniner möjligt. I föreliggande arbete har vi genererat fem apolipoprotein (Apo) C-III KO kaniner med användning av zinkfinger nukleaser (ZFN). Detta arbete visade att ZFN är en mycket effektiv metod för att producera KO kaniner.
Apolipoprotein (Apo) C-III (ApoCIII) befinner sig på ytan av plasma kylomikron (CM), mycket låg density lipoprotein (VLDL) och hög densitet (HDL). Det har konstaterats att höga nivåer av plasma ApoCIII INNEBÄR riskfaktor för kardiovaskulära sjukdomar (CVD). Förhöjda plasma ApoCIII nivå ofta korrelerar med insulinresistens, fetma, och hypertriglyceridemi. Ovärderlig kunskap om roller ApoCIIIin lipid ämnesomsättning och hjärtkärlsjukdom har erhållits från transgena musmodeller inklusive ApoCIII knockout (KO) möss, men det noteras att omsättningen av lipoprotein i möss är annorlunda än människor i många aspekter. Det är inte känt förrän nu om förhöjda plasma ApoCIII är direkt atherogenic. Vi arbetade för att utveckla ApoCIII KO kaniner i föreliggande studie baserad på hypotesen att kaniner kan fungera som en reasonablemodelfor studerar mänsklig lipid metabolism och åderförkalkning. Zink finger nukleas (ZFN) uppsättningar inriktning kanin ApoCIIIgene utsattes för in vitro validering före embryomikroinjektion. MRNA injicerades till cytoplasman av 35 kanin Pronukleära scenembryon, och utvärderat mutationshastigheter på blastocysten staten. Av sexton blastocyster som analyserades, var en tillfredsställande 50% mutationshastighet (8/16) på inriktningen webbplatsen uppnås, stödja användningen av Set 1 för in vivo-experiment. Därefter injiceras vi 145 embryon med Set 1 mRNA, och överfört dessa embryon till 7 mottagande kaniner. Efter 30 dagars dräktighet, var 21 satser födda, varav fem bekräftades som ApoCIII KO kaniner efter PCR-sekvenseringsanalyser. Den KO djur hastighet (# KO kit / totalt född) var 23,8%. Den totala produktionseffektivitet är 3,4% (5 kits/145 embryon). Föreliggande arbete visade att ZFN är en mycket effektiv metod för att producera KO kaniner. Dessa ApoCIII KO kaniner är nya resurser för att studera de roller ApoCIII i lipid ämnesomsättning.
Apolipoprotein (Apo) C-III (ApoCIII) är en liten O-glykosylerat utsöndrat protein som syntetiseras huvudsakligen i levern och tarmen. Den befinner sig på ytan av plasma kylomikron (CM), mycket låg density lipoprotein (VLDL) och hög densitet (HDL). ApoCIII har erkänts som en riskfaktor för hjärt-kärlsjukdom 1. Patienter med ärftlig brist på ApoCIII har låg plasma triglycerider (TG) nivåer och minskad subklinisk kranskärls åderförkalkning 2,3. Förhöjda plasma ApoCIII nivå, å andra sidan, korrelerar ofta med insulinresistens, fetma, och hypertriglyceridemi (HTG) 4,5.
Gene knockout (KO) är ett kraftfullt medel för att studera funktionen av en gen. I överensstämmelse med observationerna i humana muterade populationer, knockout av ApoCIII genen i möss ledde till en minskning av plasma TG och skydd mot postprandial HTG 6. En sådan positiv roll ApoCIII dökvara oberoende av apolipoprotein E (ApoE), som mus med brist på både ApoE och ApoCIII skyddas också från postprandial hyperlipidemi 7. Även om dessa modeller ApoCIII KO möss har gett ovärderlig information om möjliga funktioner ApoCIII hos människor, kan det noteras att omsättningen av lipoprotein av möss är annorlunda än människor i många aspekter. Till exempel, mus saknar plasma kolesterylester transferprotein (CETP), en viktig enzym som är involverat i transport av VLDL, LDL och HDL 8. Därför är det nödvändigt att utveckla en lämplig djurmodell för att ytterligare förstå den fysiologiska roll ApoCIII in vivo.
Kaninen är en klassisk modell djurart 9-11. Den har en kort dräktighetsperiod (30-31 dagar), stor kullstorlek (4-12/litter) och kan hållas bekvämt i en inomhus anläggning. Jämfört med möss, kaniner är fylogenetiskt närmare människor 10. Huvudsakligen liknande humannen men till skillnad från möss, kaniner är LDL rika däggdjur och har betydande nivåer av CETP 10,12. Dessutom är de känsliga för kolesterol-rik kost-inducerad ateroskleros med skador liknande de som ses i mänsklig åderförkalkning 13. Av dessa skäl antog vi att ApoCIII KO kaniner kan tjäna som en bättre modell än deras mus motsvarigheter att undersöka rollerna för ApoCIIIplay i lipidmetabolism och ateroskleros hos människa.
Produktion av genen riktade transgena (GTT) kaniner har varit en utmaning. Detta är främst på grund av bristen på könsceller sänder embryonala stamceller (ESC), och den extremt låga verkningsgrad somatisk kärnöverföring (SCNT) i kaniner. ESK är det främsta verktyget för att generera GTT möss, medan och SCNT har med framgång tillämpats för att generera KO djur i arter som saknar könsceller sänder ekonomiska och sociala råd, bland annat grisar, får och nötkreatur, men inte kaniner. Nyligen Zinc Finger Nuclease (ZFN), Tranteckning Activator-Liksom Effector Nuclease (TALEN) 14, och RNA Guidad Endonukleas (RGEN) 15 dykt upp som kraftfullt medel för genom redigering. Dessa nukleaser, så kallade "molekylära saxar", är effektiva i att skapa dubbelsträngbrott (DSB) i arvsmassan som kan leda till en funktionell KO av de riktade genen eller som används för att integrera en DNA-sekvens på ett specifikt ställe i genomet i ett antal arter 16. Under 2011 bland de första att anpassa ZFN teknik, vi genererade peroxisomproliferator-activated gamma (PPARy) KO svinceller via detta tillvägagångssätt och framgångsrikt genererade PPARy KO grisar efter att använda dessa celler för SCNT 17. Under samma år, var effektiv immunglobulingen störningar och riktade ersättare i kaniner också använder ZFN rapporterade 18.
I den aktuella studien har fem ApoCIII KO kaniner genereras som bekräftas av PCR-sekvensering, med hjälp av ZFN Set 1 (se figur 1 </strong>. för flödesdiagram illustrationen). Dessa djur är nya resurser för att studera de roller ApoCIII i lipid ämnesomsättning.
I föreliggande arbete har fem ApoCIII KO kaniner genereras med hjälp av ZFN teknik. Tidigare den enda rapporten om produktionen av GTT kaniner också använt ZFN teknik 18. Den nuvarande arbete bekräftade att ZFN är användbart för att effektivt nå gener i kaniner.
I den aktuella studien, den transgena hastighet (positiv kits / totalt fött) is23.8% (5/21), som är jämförbar med den för den tidigare ZFN rapport hos kaniner (30,8%, 16/52) 18, och de rapporterade av att använda ZFN i andra djurarter, inklusive zebrafisk 19, möss 20, råttor 21 och svin 17. Denna kurs är i själva verket högre än de nivåer av många konventionella transgen kanin produktionsstudier, som normalt faller i intervallet 5-20%. Till exempel, i ett försök att produkten ApoCIII transgena kaniner via konventionella DNA-mikroinjektion, Ding et al. Erhölls tre positiva grundare av 54 födda ungar (5,6%) 22.
I överensstämmelse med tidigare fynd, de mutationer vid de riktade platser är variabel, inklusive deletioner eller inser bestående olika antal baser (mellan 1-21 på de fem KO kaniner). Baserat på den specifika sekvensinformation av grundardjur, är det förutspås att minst fyra (dvs. Sådana som innehåller Δ1, +1, +1, eller Δ20 mutationer) skulle ha funktionsförlust ApoCIII. Animal R-16 med Δ21 får inte visa funktionell förlust, eftersom denna mutation förutspås endast orsaka förlust av sju aminosyror, men inte en läsning ram skift. Ytterst fenotyp analyser är nödvändiga för att avgöra om dessa grundardjur visar verkligen förlusten av ApoCIII funktioner.
Ingen av de fem KO kaniner som genererats i denna studie innehåller bialleliska modifieringar. Intressant nog är detta också fallet i den förra ZFN kanin rapport. Däremot var när ZFNs riktar α1 ,3-galaktosyltransferas tillämpas på grisceller, frekvensen för riktad till ett enda allel varierade från 7 till 46%, med cirka en tredjedel av de mutationer som skapar ett enda steg biallelisk knockouts 23. I överensstämmelse med detta, när TALEN applicerades på gris fibroblastceller ades de bialleliska modifikationer förekommer hos cirka 15-40% av den totala positiva kloner 14. Det är möjligt att misslyckandet att generera bialleliska KO kaniner i denna studie kan tyda på en art skillnad (dvs. kaniner vs grisar) för sådan kapacitet nukleas baserad riktad genmodifiering. Det är dock mer troligt att det är helt enkelt därför att antalet KO kaniner som genereras i detta projekt är relativt liten. Vi tror att ZFN kan generera bialleic mutationer i kaniner, vilket bör betraktas som en annan potentiell fördel med ZFN baserad GTT kaninproduktion. Ytterligare experiment behövs för att bekräfta en sådan kapacitet ZFN i kaniner.
Sammanfattningsvis demonstrerar föreliggande arbete att ZFN baserad riktad genmodifiering tillvägagångssätt är effektivt på att producera KO kaniner. I synnerhet vi genererat fem ApoCIII KO kaniner med en tillfredsställande transgen hastighet av 23,8%. Dessa djur tros ge mer meningsfull information om proteinets roll i lipid metabolism hos människa än motsvarande musmodeller. Vi förutspår ZFN baserad gen inriktning, liksom andra nukleas baserade tekniker som TALEN och RGEN, i nonmurine djur kommer att avsevärt underlätta utvecklingen av nya djurmodeller för att studera olika mänskliga sjukdomar.
Figur 1. Flödesschema för produktion av knockout kaniner använder ZFN teknik. Produktion av KO kaniner använder ZFN teknik börjar med valet av genen av intresse. Den sekvensinformation tillhandahålls, ZFN uppsättningarna är utformade, och subjsad för jäst baserad på intern validering. Vid incheckning punkt (CP) 1 (CP-1), kommer endast de apparater passerade intern validering (50% eller mer av den inre positiv kontroll) skall ges till användarna om valet. Om inga apparater passerar CP-1, kan ytterligare sekvens behövas för att utforma effektiva ZFN-apparater. En in vitro embryo validering följs för att säkerställa den valda ZFN set kan framkalla mutationer på utvalda platser (CP-2). ZFN set (s) kommer endast att användas om den passerar CP-2 (> = 10% mutation klassar i in vitro embryon). Fel vid CP-2 kommer att kräva en redesign av ZFN-apparater. Embryo donatorer kommer att förberedas och Pronukleära scenembryon kommer att injiceras med de validerade ZFN set. Dessa mikroinjicerade embryon överförs till synkroniserade embryo mottagare. Efter en månad dräktighetstiden, kommer nyfödda genotypas (CP-3). Om inget av de nyfödda är positiva, kommer ytterligare mikroinjektion utföras. Det tar 2-3 månader från projektstart till CP-2, förutsatt no fel under processen. Det tar ytterligare 2-3 månader från CP-2 till CP-3. Därför är det möjligt att generera en knockout kanin i en 4-6 månaders tid med hjälp av ZFN teknologi. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 2. ZFN design. Tre ZFN set (Set 1, 2, och 3) utformades inriktade på olika sekvenser på Exon 1 och exon 2 av kanin ApoCIII (A). Alla tre uppsättningar utsattes för jäst MEL-en reporteranalys för att bestämma de ZFN aktiviteter. Enligt tillverkarens protokoll, är ZFNs som visar> 50% verksamhet som tillverkningen interna positiva kontrollen anses vara användbara för in vitro-och in vivo genomredigeringsexperiment.De ZFN verksamheten var 224,2% för Set 1, 196,9% för Set 2 och 177,8% för Set 3 (B), därför Set 1 valdes i denna studie. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3. In vitro validering embryo till ZFN. MRNA (5 pg / ml) för Set 1 mikroinjicerades till cytoplasman i 35 Pronukleära skede kaninembryon (a). Flushed embryon utan mikroinjektion behandling (n = 31) användes som kontrollgruppen. Den BL utvecklingstakt var 77,4% i kontrollgruppen. I den idag injiceras gruppen, BL takten var 51,4%. Av 16 BLs utsattes för PCR-sekvensering, var 8 (50%) identifierades som positiv, vilket indikerar Set 1 är en effektiv ZFN uppsättning för att inducera mutationer på siktating webbplats (B, apoc3wt.seq, black-box) av ApoCIII i kaniner. BLS innehållande mutationer är BL # apoc-3, 4, 5, 7, 11, 13, 15, och 17 (B, röd understruket). De återstående BLs (# apoc-2, 6, 9, 10, 12, 14 och 16) inte har mutationer i måls platsen. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 4. Produktion av ApoCIII KO kaniner. Hundra och fyrtiofem embryon mikroinjicerade med ZFN Set 1 mRNA överfördes till 7 pseudo-gravid mottagande kaniner (A). Färskt spolas embryon (n = 75) utan ZFN mikroinjektion överfördes till mottagare (n = 6) som kontrollgruppen. Termen beräknad som total sikt kit / totala embryon i experimentgruppen är 140,5% (21/145), under det att priset är 29,3% (22/75) i kontrollgruppen (A). Av 21 satser födda i mikroinjicerade gruppen, fem (R1, R9, R11, R12 och R16) identifierades som positiva KO kit efter PCR-sekvensering (B). De indels på måls plats inkluderar två införanden (+1 för både R9 och R11) och tre strykningar (Δ1, Δ 20 Δ 21 för R1, R12 och R16, respektive). Klicka här för att visa en större bild .
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har delvis finansierats genom anslag från National Institutes of Health (HL105114, HL088391, NS066652 och HL068878 till YEC), American Heart Association (Nationella Scientist utvecklings 0835237N till JZ). YEC stöds finansiellt som begåvat Fredrik Huetwell professor i kardiovaskulär medicin vid University of Michigan Medical Center (UMMC). Detta arbete utnyttjas Core Services stöds av Centrum för avancerade modeller för Translational vetenskap och Therapeutics (CAMTraST) vid UMMC.
APOC3-ZFN | Sigma Aldrich | CSTZFNY-1KT | Target Gene: APOC3, Lot Number: 12201118MN |
mMESSAGE kit | Invitrogen | AM1344M | mRNA synthesis |
MEGAclear Kit | Invitrogen | AM1908M | mRNA purification |
Follicle-stimulating hormone | Bioniche Life Sciences | Folltropin-V | Treating embryo donor rabbits |
Human chorionic gonadotropin | Intervet | Chorulon | Treating embryo donor rabbits |
Gonadotropin-releasing hormone | Prospecbio | HOR-255 | Treating embryo recipient rabbits |
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) | Thermo Fisher Scientific | SH30029.02 | Embryo culture, base medium |
MEM (nonessential amino acid) | Sigma Aldrich | M7145 | Embryo culture, supplements |
BME AMINO ACIDS solution | Sigma Aldrich | B6766 | Embryo culture, supplements |
Glutamine | Gibco | 25030-149 | Embryo culture, supplements |
Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | Embryo culture, supplements |
Fetal bovine serum | Sigma Aldrich | 12003C | Embryo culture, supplements |
HEPES buffered TCM 199 | Gibco | 12350039 | Embryo manipulation medium |
Incubator | Eppendorf | Galaxy 170 | Embryo culture equipment |
Micromanipulator | Eppendorf | TransferMan NK 2 | Embryo manipulation equipment |
Micropipette puller | Sutter Instruments Inc. | P-1000 | Embryo manipulation equipment |
Microinjector | Tritech Research | MINJ-D | Embryo manipulation equipment |
Borosilicate glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-6 | Embryo manipulation supply |
Euthasol (pentobarbitol sodium) | Virbac AH, Inc. | ANADA#200-071 | Euthanization of embryo donor rabbits |