التطورات الأخيرة في أدوات استهداف الجينات يجعل إنتاج بالضربة القاضية (KO) الأرانب ممكن. في العمل الحالي، ونحن ولدت خمسة أرانب ئي (آبو) C-III KO باستخدام الزنك Nucleases فنجر (ZFN). أظهر هذا العمل الذي ZFN هو طريقة فعالة للغاية لإنتاج الأرانب KO.
ئي (آبو) C-III (ApoCIII) تتواجد على سطح الكيلومكرونات البلازما (CM)، منخفضة جدا كثافة البروتين الدهني (VLDL) والبروتينات الدهنية عالية الكثافة (HDL). وقد تم الاعتراف بأن مستويات عالية من بلازما ApoCIII عامل خطر لأمراض القلب والأوعية الدموية constitutea (الأمراض القلبية الوعائية). ارتفاع مستوى ApoCIII البلازما غالبا ما يرتبط مع مقاومة الانسولين والبدانة، وفرط ثلاثي غليسيريد الدم. لقد تم الحصول على المعرفة لا تقدر بثمن على أدوار ApoCIIIin الأيض الدهون والأمراض القلبية الوعائية من نماذج الماوس المعدلة وراثيا بما في ذلك ApoCIII بالضربة القاضية (KO) الفئران، ومع ذلك، لوحظ أن عملية التمثيل الغذائي للبروتين شحمي في الفئران مختلفة عن البشر في كثير من الجوانب. ومن غير المعروف حتى الآن ما إذا البلازما مرتفعة ApoCIII مباشرة تصلب الشرايين. عملنا على تطوير الأرانب ApoCIII KO في هذه الدراسة بناء على فرضية أن الأرانب يمكن أن تكون بمثابة reasonablemodelfor دراسة استقلاب الشحوم الإنسان وتصلب الشرايين. الزنك الاصبع نوكلياز (ZFN) مجموعات استهداف أرنب ا ف بتعرضوا لoCIIIgene في المختبر التحقق من صحة الجنين قبل حقن مكروي. تم حقن مرنا إلى السيتوبلازم من 35 أرنب الأجنة مرحلة pronuclear، وتقييم معدلات طفرة في الدولة الكيسة. ستة عشر مثانات بلاستولية التي تم يعاير، تم التوصل إلى نسبة مرضية طفرة 50٪ (8/16) في موقع الاستهداف، ودعم استخدام مجموعة 1 لفي التجارب المجراة. المقبل، ونحن microinjected الأجنة مع 145 مجموعة 1 مرنا، ونقل هذه الأجنة إلى 7 الأرانب المتلقي. بعد 30 يوما من الحمل، ولدوا 21 مجموعات، منها تأكدت خمسة أرانب كما ApoCIII KO بعد PCR المقايسات التسلسل. كان معدل الحيوان KO (# لدت مجموعات KO / الكل) 23.8٪. كفاءة الإنتاج الكلي هو 3.4٪ (5 kits/145 الأجنة المنقولة). تظاهر العمل الحالي التي ZFN هو طريقة فعالة للغاية لإنتاج الأرانب KO. هذه الأرانب ApoCIII KO هي موارد جديدة لدراسة أدوار ApoCIII في الأيض الدهون.
ئي (آبو) C-III (ApoCIII) هو-O الغليكوزيلاتي إفرازية البروتين الصغيرة التي يتم تصنيعه بشكل رئيسي في الكبد والأمعاء. أنه يتواجد على سطح الكيلومكرونات البلازما (CM)، منخفضة جدا كثافة البروتين الدهني (VLDL) والبروتينات الدهنية عالية الكثافة (HDL). وقد تم الاعتراف ApoCIII كعامل خطر للإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية 1. المرضى الذين يعانون من نقص وراثي من ApoCIII لديهم انخفاض الدهون الثلاثية البلازما (TG) وانخفاض مستويات تحت الإكلينيكي الشريان التاجي وتصلب الشرايين 2،3. ارتفاع مستوى ApoCIII البلازما، من ناحية أخرى، وغالبا ما يرتبط مع مقاومة الانسولين والبدانة، وفرط ثلاثي غليسيريد الدم (HTG) 4،5.
الجينات خروج المغلوب (KO) هي وسيلة قوية لدراسة وظيفة الجين. بما يتفق مع الملاحظات في السكان متحولة الإنسان، أدى خروج المغلوب من الجينات في الفئران ApoCIII إلى الحد من البلازما TG والحماية من HTG بعد الأكل 6. هذا الدور الإيجابي للApoCIII ظهرأن تكون مستقلة من ئي E (APOE)، والقصور الذي يعتري كل من الفئران وAPOE ApoCIII محمية أيضا من الدهون بعد الأكل 7. على الرغم من أن وفرت هذه النماذج الماوس ApoCIII KO معلومات لا تقدر بثمن على الوظائف المحتملة من ApoCIII في البشر، لوحظ أن عملية التمثيل الغذائي للبروتين شحمي من الفئران يختلف عن نظيره لدى البشر في كثير من الجوانب. على سبيل المثال، يفتقر الماوس البلازما الكوليسترول نقل استر البروتين (CETP)، انزيم الرئيسية المشاركة في نقل VLDL، LDL، HDL و8. وبالتالي، فمن الضروري لتطوير نموذج حيواني المناسبة لزيادة فهم دور الفسيولوجية للApoCIII في الجسم الحي.
الأرنب هو الكلاسيكية الأنواع نموذج حيواني 9-11. لديها فترة قصيرة من الحمل (30-31 يوما)، وحجم القمامة الكبيرة (4-12/litter) ويمكن أن يكون مقر ملائم في منشأة في الأماكن المغلقة. بالمقارنة مع الفئران والأرانب هي أقرب إلى البشر phylogenetically 10. الأهم من ذلك، مثل هو جين تاوولكن على عكس الرجل الفئران والأرانب والثدييات-LDL الغنية ولها مستويات كبيرة من CETP 10،12. وعلاوة على ذلك، فهي عرضة للالغنية بالكوليسترول النظام الغذائي الناجم عن تصلب الشرايين مع آفات مماثلة لتلك التي ظهرت في تصلب الشرايين الإنسان 13. لهذه الأسباب، ونحن افترضنا أن الأرانب ApoCIII KO يمكن أن تكون بمثابة نموذج أفضل من نظرائهم الماوس الخاصة بهم للتحقيق في أدوار ApoCIIIplay في استقلاب الدهون وتصلب الشرايين لدى البشر.
إنتاج الجينات المستهدفة المعدلة وراثيا كان (GTT) الأرانب تحديا. ويرجع ذلك أساسا إلى عدم وجود سلالة الجرثومية نقل الخلايا الجذعية الجنينية (ESC)، وكفاءة منخفضة للغاية من نقل نواة الخلية الجسدية (SCNT) في الأرانب هذا. ESC هو الأداة الرئيسية لتوليد الفئران GTT، في حين وأنها طبقت بنجاح SCNT لتوليد الحيوانات KO في الأنواع التي تفتقر إلى سلالة الجرثومية المجالس الاقتصادية والاجتماعية تحيل، بما في ذلك الخنازير والأغنام والماشية، ولكن ليس الأرانب. مؤخرا الزنك فنجر نوكلياز (ZFN)، ترانظهرت SCRIPTION المنشط على غرار المستجيب نوكلياز (TALEN) 14، والجيش الملكي النيبالي نوكلياز داخلية الإرشادية (RGEN) 15 وسيلة قوية للتحرير كما الجينوم. هذه nucleases، ما يسمى ب "مقص الجزيئية"، هي فعالة في توليد فواصل المزدوج حبلا (DSB) في الجينوم التي يمكن أن تؤدي إلى KO وظيفية من الجينات المستهدفة أو تستخدم لدمج تسلسل الحمض النووي في موضع محدد في الجينوم في عدد من الأنواع 16. في عام 2011، من بين أول تطويع التكنولوجيا ZFN، ونحن ولدت بيروكسية تنشيط مستقبلات غاما ناشر (PPARγ) خلايا الخنازير KO عبر هذا النهج ولدت بنجاح الخنازير PPARγ KO بعد استخدام هذه الخلايا لSCNT 17. في نفس العام، أفيد كفاءة المناعي اضطراب الجينات واستبدال المستهدفة في الأرانب أيضا باستخدام ZFN 18.
في هذه الدراسة، تم إنشاؤها خمسة أرانب ApoCIII KO ما أكده PCR التسلسل، وذلك باستخدام مجموعة ZFN 1 (انظر الشكل 1 </sترونج>. للمخطط تدفق التوضيح). هذه الحيوانات هي موارد جديدة لدراسة أدوار ApoCIII في الأيض الدهون.
في العمل الحالي، تم إنشاؤها خمسة أرانب ApoCIII KO باستخدام التكنولوجيا ZFN. سبق التقرير فقط من إنتاج أرانب GTT تستخدم أيضا تقنية ZFN 18. وأكد أن العمل الحالي ZFN مفيد بشكل فعال لاستهداف الجينات في الأرانب.
في هذه الدراسة، فإن معدل وراثيا (مجموعات ايجابية / مجموع ولد) is23.8٪ (5/21)، والذي هو مشابه لذلك من التقرير السابق ZFN في الأرانب (30.8٪، و 16/52) 18، وتلك التي ذكرت استخدام ZFN في الأنواع الحيوانية الأخرى، بما في ذلك حمار وحشي الأسماك 19، 20 الفئران والجرذان والخنازير 21 17. هذه النسبة هي في الواقع أعلى من معدلات العديد من الدراسات إنتاج الأرانب المعدلة وراثيا التقليدية، التي تندرج عادة في حدود 5-20٪. على سبيل المثال، في محاولة لمنتج ApoCIII الأرانب المعدلة وراثيا عن طريق حقن مكروي الحمض النووي التقليدية، أقرع وآخرون الحصول على 3 مؤسسي إيجابية من 54 الجراء ولدت (5.6٪) 22.
يتفق مع النتائج السابقة، والطفرات في المواقع التي تستهدف هي المتغير، بما في ذلك الحذف أو الإدراج تتألف عدد مختلف من القواعد (تتراوح 1-21 في الأرانب خمسة KO). استنادا إلى المعلومات تسلسل معين من الحيوانات مؤسس، ومن المتوقع أن لا يقل عن أربعة (أي. تلك التي تحتوي على Δ1، +1، +1، أو Δ20 الطفرات) من شأنه أن يكون فقدان وظيفة من ApoCIII. الحيوان R-16 مع Δ21 قد لا يتم عرض فقدان الوظائف، كما توقع هذه الطفرة إلى سبب الخسارة الوحيدة من سبعة الأحماض الأمينية، ولكن ليس تحولا إطار القراءة. في نهاية المطاف، النمط الظاهري المقايسات اللازمة لتحديد ما إذا كانت هذه الحيوانات مؤسس عرض حقا فقدان الوظائف ApoCIII.
أيا من الأرانب KO خمسة ولدت في هذه الدراسة تتضمن التعديلات biallelic. ومن المثير للاهتمام، وهذا هو الحال في التقرير السابق أرنب ZFN أيضا. في المقابل، عند استهداف ZFNs α1 ،3-galactosyltransferase تم تطبيقها على خنزيرالخلايا، وتواتر استهداف أليل واحد تراوحت 7-46٪، مع ما يقرب من ثلث الطفرات خلق خطوة واحدة biallelic بالضربة القاضية 23. واتساقا مع ذلك، عندما تم تطبيق TALEN إلى الخلايا الليفية خنزير، عثر على التعديلات biallelic في حوالي 15-40٪ من مجموع الحيوانات المستنسخة إيجابية 14. فمن الممكن أن الفشل في توليد الأرانب KO biallelic في هذه الدراسة قد تشير إلى وجود اختلاف الأنواع (أي الأرانب مقابل الخنازير) لمثل هذه قدرة نوكلياز على الجينات الاستهداف. هو عليه، ومع ذلك، من الأرجح أن هذا هو ببساطة لأن عدد الأرانب KO ولدت في هذا المشروع صغير نسبيا. ونحن نعتقد أن ZFN قادر على توليد الطفرات bialleic في الأرانب، والتي ينبغي اعتبارها ميزة أخرى محتملة من إنتاج الأرانب GTT ZFN القائمة. وهناك حاجة إلى مزيد من التجارب لتأكيد هذه القدرة من ZFN في الأرانب.
في الختام، يدل على أن العمل الحالي Zالجينات FN مقرها تستهدف النهج هو فعالة في إنتاج الأرانب KO. على وجه الخصوص، ونحن ولدت خمسة أرانب ApoCIII KO مع معدل وراثيا مرضيا من 23.8٪. ويعتقد أن هذه الحيوانات لتوفير معلومات أكثر وضوحا حول دور هذا البروتين على الأيض الدهون في البشر من نماذج الماوس المقابلة. نتوقع استهداف الجين ZFN مقرها، وكذلك التكنولوجيات القائمة على نوكلياز أخرى مثل TALEN وRGEN، في الحيوانات nonmurine سيسهل بشكل كبير في تطوير نماذج حيوانية رواية لدراسة مختلف الأمراض التي تصيب الإنسان.
الشكل 1. تدفق الرسم البياني من إنتاج أرانب بالضربة القاضية باستخدام التكنولوجيا ZFN. إنتاج الأرانب KO باستخدام التكنولوجيا ZFN يبدأ مع اختيار الجينات في المصالح. يتم توفير المعلومات التسلسل، فقد تم تصميم مجموعات ZFN، وsubjected إلى الخميرة على أساس التحقق من صحة في المنزل. في نقطة تفتيش (CP) 1 (CP-1)، وسيتم توفير فقط تلك المجموعات مرت في المنزل التحقق من صحة (50٪ أو أعلى من السيطرة الإيجابية الداخلية) للمستخدمين للاختيار. إذا لم يكن هناك مجموعات تمر CP-1، قد تكون هناك حاجة تسلسل إضافية لتصميم مجموعات ZFN فعالة. ويتبع في المختبر التحقق من صحة الجنين لضمان مجموعة مختارة ZFN يمكن أن تحدث طفرات في مواقع مختارة (CP-2). وليس هذا فقط مجموعة ZFN (ق) أن تستخدم إذا كان يمر CP-2 (> = 10٪ معدلات الطفرة في الأجنة في المختبر). والفشل في CP-2 تتطلب إعادة تصميم مجموعات ZFN. وسوف تكون على استعداد المانحين الجنين وسيتم microinjected الأجنة مرحلة pronuclear مع مجموعات ZFN التحقق من صحتها. وسيتم نقل هذه الأجنة microinjected إلى المستلمين الجنين متزامنة. بعد فترة الحمل شهر واحد، سيتم مرمزة بالجينات حديثي الولادة (CP-3). إذا كان أي من الأطفال حديثي الولادة هي إيجابية، سيتم تنفيذ حقن مكروي إضافية. يستغرق 2-3 أشهر من بداية المشروع إلى CP-2، على افتراض نفشل س خلال العملية. يستغرق 2-3 أشهر إضافية من CP-2 إلى CP-3. ولذا فمن الممكن أن تولد أرنب خروج المغلوب في إطار زمني 4-6 الشهر باستخدام تكنولوجيا ZFN. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الشكل 2. تصميم ZFN. ثلاث مجموعات ZFN (مجموعة 1 و 2 و 3) تم تصميمها استهداف سلاسل مختلفة على اكسون 1 أو 2 من اكسون الأرنب ApoCIII (A). وتعرض جميع المجموعات الثلاث إلى الخميرة MEL-1 مراسل مقايسة لتحديد الأنشطة ZFN. وفقا لبروتوكولات تصنيع، وتعتبر ZFNs التي تظهر الأنشطة> 50٪ من تلك السيطرة الإيجابية الداخلية للتصنيع كما مفيدة لفي المختبر والمجراة الجينوم التحرير التجارب.وكانت أنشطة ZFN 224.2٪ لمجموعة 1، 196.9٪ للمجموعة 2 و 177.8٪ للمجموعة 3 (ب)، لذلك تم اختيار مجموعة 1 في الدراسة الحالية. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الرقم 3. في المختبر التحقق من صحة الجنين من ZFN. تم microinjected مرنا (5 ميكروغرام / مل) من مجموعة 1 إلى السيتوبلازم من 35 pronuclear الأجنة مرحلة أرنب (A). واستخدمت أجنة مسح دون علاج حقن مكروي (ن = 31)، والسيطرة على المجموعة. كان معدل التنمية BL 77.4٪ في مجموعة المراقبة. في المجموعة microinjected، كان معدل 51.4٪ BL. من 16 BLS تعرض لPCR التسلسل، 8 (50٪) تم تحديدها على أنها إيجابية، مما يشير إلى مجموعة 1 هو مجموعة ZFN فعالة للحث على الطفرات في targeموقع تينغ (B، apoc3wt.seq، أسود محاصر) من ApoCIII في الأرانب. و BLS التي تحتوي على الطفرات هي BL-APOC # 3، 4، 5، 7، 11، 13، 15، و (أكد B والأحمر) 17. و BLS المتبقية (# APOC-2، 6، 9، 10، 12، 14 و 16) لم يكن لديك الطفرات في موقع الاستهداف. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الشكل 4. إنتاج الأرانب ApoCIII KO. تم نقل مائة وخمسة وأربعين الأجنة microinjected مع مجموعة ZFN 1 إلى 7 mRNAs والأرانب المتلقي شبه الحوامل (A). تم نقل الأجنة الطازجة مسح (ن = 75) دون ZFN حقن مكروي إلى المستلمين (ن = 6)، والسيطرة على المجموعة. معدل الأجل تحسب على النحو مجموعات المدى الكل / مجموع الأجنة في المجموعة التجربة هو 14.5٪ (21/145)، في حين أن معدل 29.3٪ (22/75) في السيطرة على المجموعة (A). من أصل 21 مجموعات ولد في المجموعة microinjected، وخمسة (R1، R9، R11، R12 R16 و) تم تحديد مجموعات KO إيجابية بعد PCR التسلسل (B). تشمل indels في موقع الاستهداف اثنين الإدراج (+1 لكل R9 وR11) وثلاثة الحذف (Δ1، Δ 20، Δ 21 لR1، R12 R16 و، على التوالي). اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
The authors have nothing to disclose.
وقد تم تمويل هذا العمل جزئيا من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (HL105114، HL088391، NS066652، وHL068878 لYEC)، ورابطة القلب الأميركية (الوطنية للتنمية 0835237N عالم لJZ). ويدعم ماليا YEC كما هبت فريدريك Huetwell أستاذ الطب القلب والأوعية الدموية في جامعة ميتشيغان مركز طبي (UMMC). هذا العمل المستخدمة الخدمات الأساسية التي يدعمها مركز لنماذج متقدمة للعلوم بالحركة والتداوي (CAMTraST) في UMMC.
APOC3-ZFN | Sigma Aldrich | CSTZFNY-1KT | Target Gene: APOC3, Lot Number: 12201118MN |
mMESSAGE kit | Invitrogen | AM1344M | mRNA synthesis |
MEGAclear Kit | Invitrogen | AM1908M | mRNA purification |
Follicle-stimulating hormone | Bioniche Life Sciences | Folltropin-V | Treating embryo donor rabbits |
Human chorionic gonadotropin | Intervet | Chorulon | Treating embryo donor rabbits |
Gonadotropin-releasing hormone | Prospecbio | HOR-255 | Treating embryo recipient rabbits |
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) | Thermo Fisher Scientific | SH30029.02 | Embryo culture, base medium |
MEM (nonessential amino acid) | Sigma Aldrich | M7145 | Embryo culture, supplements |
BME AMINO ACIDS solution | Sigma Aldrich | B6766 | Embryo culture, supplements |
Glutamine | Gibco | 25030-149 | Embryo culture, supplements |
Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | Embryo culture, supplements |
Fetal bovine serum | Sigma Aldrich | 12003C | Embryo culture, supplements |
HEPES buffered TCM 199 | Gibco | 12350039 | Embryo manipulation medium |
Incubator | Eppendorf | Galaxy 170 | Embryo culture equipment |
Micromanipulator | Eppendorf | TransferMan NK 2 | Embryo manipulation equipment |
Micropipette puller | Sutter Instruments Inc. | P-1000 | Embryo manipulation equipment |
Microinjector | Tritech Research | MINJ-D | Embryo manipulation equipment |
Borosilicate glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-6 | Embryo manipulation supply |
Euthasol (pentobarbitol sodium) | Virbac AH, Inc. | ANADA#200-071 | Euthanization of embryo donor rabbits |