在基因靶向工具最近发展使得生产淘汰赛(KO)的兔子可能。在目前的工作中,我们使用生成的锌指核酸酶(ZFN)五,载脂蛋白(APO)C-III KO兔。这项工作表明,ZFN是一个以生产KO兔高效的方法。
载脂蛋白(APO)C-III(ApoCIII)位于血浆乳糜微粒(CM)的表面上,极低密度脂蛋白(VLDL)和高密度脂蛋白(HDL)。人们已经认识到,高水平的血浆ApoCIII constitutea风险因子的心血管疾病(CVD)。升高的血浆ApoCIII水平往往关联与胰岛素抵抗,肥胖,高甘油三酯血症和。上的ApoCIIIin脂质代谢和心血管疾病的作用非常宝贵的知识已经从转基因小鼠模型,包括ApoCIII敲除(KO)小鼠获得的,但是,应该注意的是脂蛋白的小鼠的代谢是由人类在许多方面不同。它不知道到现在为止升高血浆ApoCIII是否是直接动脉粥样硬化。我们致力于发展ApoCIII KO兔的基础上,兔子可以作为reasonablemodelfor研究人类脂质代谢和动脉粥样硬化的假设本研究。锌指核酸酶(ZFN)靶向套鸭兔oCIIIgene经受体外验证之前,胚胎显微注射。该基因被注入到35兔原核期胚胎的细胞质,并评估了突变率在囊胚状态。分别测定了16囊胚,在目标网站满意50%的突变率(8/16)达到了,配套使用设置1的体内实验。接下来,我们145显微注射胚胎设为1的mRNA,并转移这些胚胎7收件人兔子。经过30天的妊娠期,21套出生,其中五人后的PCR测序分析证实为ApoCIII KO兔。劫动物率(#KO包/总出生)为23.8%。整体生产效率为3.4%(5 kits/145胚胎转移)。目前的工作表明,ZFN是一个以生产KO兔高效的方法。这些ApoCIII KO兔子是新颖的资源来研究脂质代谢ApoCIII的角色。
载脂蛋白(APO)C-III(ApoCIII)是一种主要在肝脏中合成和小肠小O-糖基化的分泌蛋白。它位于血浆乳糜微粒(CM)的表面上,极低密度脂蛋白(VLDL)和高密度脂蛋白(HDL)。 ApoCIII已被公认为是心血管疾病1的一个危险因素。患者ApoCIII的遗传性缺陷具有低血浆甘油三酯(TG)水平,降低亚临床冠状动脉粥样硬化2,3。升高的血浆ApoCIII水平,另一方面,经常关联与胰岛素抵抗,肥胖,和高甘油三酯血症(HTG)4,5。
基因敲除(KO)是一个强有力的手段,研究了基因的功能。为符合人类突变人群的观察,ApoCIII基因在小鼠基因敲除导致减少血浆TG和保护餐后HTG 6。 ApoCIII这样的积极作用显现是独立的载脂蛋白E(ApoE基因)的,视为缺乏载脂蛋白E既与ApoCIII的小鼠也免受餐后高脂血症7。虽然这些ApoCIII KO小鼠模型提供了宝贵的信息ApoCIII在人体中的可能的功能,应该注意的是小鼠的脂蛋白的代谢是由人类在许多方面不同。例如,小鼠缺乏血浆胆固醇酯转移蛋白(CETP),参与VLDL,LDL的运输的主要酶,和高密度脂蛋白8。因此,有必要开发一种合适的动物模型,以进一步了解ApoCIII 在体内的生理作用。
兔子是一个经典模型动物物种9-11。它有一个短的酝酿期(30-31天),大窝产仔数(4-12/litter),可在室内设施方便地放置。相较于小鼠,兔在系统发育上更接近人类10。重要的是,像胡人,但不像老鼠,兔子是低密度脂蛋白丰富的哺乳动物和有大量的胆固醇酯转运蛋白水平10,12中。此外,他们很容易受到富含胆固醇的饮食引起动脉粥样硬化的病变相似,看到在人类动脉粥样硬化13。基于这些原因,我们推测ApoCIII KO兔子可以作为一个比他们的鼠标同行更好的模型来研究在人类脂质代谢和动脉粥样硬化ApoCIIIplay的角色。
生产基因靶向转基因(GTT)兔子一直是个挑战。这主要是由于缺乏生殖系传递的胚胎干细胞(ESC),并在兔体细胞核转移(SCNT)的效率极低。 ESC是主要的工具来生成GTT小鼠,而和体细胞核移植已成功地应用于产生KO动物物种缺乏生殖系传递的胚胎干细胞,包括猪,羊,牛,但不是兔子。最近锌指核酸酶(ZFN),陈scription活化剂-样效应核酸酶(TALEN)14,和RNA指导核酸内切酶(RGEN)15出现了基因组编辑作为有力手段。这些核酸酶,即所谓的“分子剪刀”,是有效率的产生双链断裂(DSB)在基因组中,可以导致靶基因的功能KO或用于DNA序列在基因组中的特定位点整合一些物种16。 2011年,首批适应ZFN技术,我们利用这些细胞进行体细胞核移植17后生成过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)KO猪细胞通过这种方法,成功地产生PPARγKO猪。同年,高效免疫球蛋白基因破坏和有针对性的更换兔也使用ZFN报18。
在本研究中,产生了5 ApoCIII KO兔证实通过PCR测序,用ZFN设为1( 见图1 </sTRONG>。对流程图的图示)。这些动物是新颖的资源来研究脂质代谢ApoCIII的角色。
在目前的工作,使用ZFN技术生成5 ApoCIII KO兔。以前生产GTT兔的只报告还使用了ZFN技术18。目前的工作证实,ZFN是有用的有效靶基因兔。
在本研究中,转基因率(正套/总出生)is23.8%(5/21),这相当于在兔子前面的ZFN报告(30.8%,16/52)18,和那些报道在其他动物物种,包括斑马鱼19,20的小鼠,大鼠21和17的猪使用ZFN的。这个速度实际上比许多传统的转基因兔生产的研究,这通常属于在5-20%范围内的比率较高。例如,在努力通过常规的DNA显微注射产品ApoCIII转基因兔,丁等人获得3个阳性创始人出54幼崽出生(5.6%)22。
与以前的研究结果,突变的靶向位点是可变的,包括缺失或插入含有不同数量的基础(从在五KO兔1-21)。根据创始人动物的特定序列的信息,可以预测,至少四个( 即 ,那些含Δ1,1,1,或Δ20突变)将有ApoCIII功能丧失。动物的R-16与Δ21可能不显示功能的损失,因为这突变被预测的7个氨基酸仅引起的损失,但不是一个读码框移位。最后,表型测定是必要的,以确定是否这些创始人动物确实显示ApoCIII功能的丧失。
概无在本研究中所产生的五个KO兔含有等位基因修改。有趣的是,这也是在以前的ZFN兔子报告的情况。相反,当目标的ZFNα1,3 – 半乳糖转移酶分别适用于猪细胞中,针对单个等位基因从7-46%之间,大约有三分之一的突变产生单步双等位基因敲除23的频 率。与此相一致,当TALEN应用于猪成纤维细胞中,被发现在总的阳性克隆14的约15-40%的双等位基因的修改。这是可能的故障,产生双等位基因KO兔在本研究中可以指示物种差异( 即兔与猪),用于基于核酸酶基因打靶的这种能力。它是,但是,更有可能的是这仅仅是因为在这个项目中产生的KO兔子的数量相对较少。我们相信,ZFN能够产生bialleic突变兔,其应被视为ZFN基于GTT兔生产的另一个潜在的优势。还需要进一步的实验来证实ZFN兔这种能力。
总之,目前的工作证明是ZFN基于基因打靶的方法是有效的生产KO兔。具体而言,我们产生5 ApoCIII KO兔的23.8%的满意率转基因。这些动物被认为提供的是关于人体脂质代谢这种蛋白质的作用比相应的小鼠模型更有意义的信息。我们预测ZFN基于基因打靶,以及其他基于核酸的技术,如TALEN和RGEN,在nonmurine动物将显著促进新型动物模型中研究各种人类疾病的发展。
图1。流程图生产中使用ZFN技术击倒兔的 。生产中使用ZFN技术KO兔开始与感兴趣的基因的选择。序列信息提供,ZFN集设计,和主旨ected以酵母为基础的内部验证。在检查点(CP)1(CP-1),只有那些通过内部验证(内部阳性对照的50%或更高)集将被提供给用户选择。如果没有设置通过CP-1,另外的序列可能需要设计有效的ZFN集。 体外胚胎验证其次,以确保所选择的ZFN集可以在选定的地点(CP-2)诱导突变。如果通过CP-2( 体外胚胎> = 10%的突变率)ZFN集(s)将只被使用。在失败的CP-2要求的ZFN集的重新设计。胚胎捐赠者将编写和原核阶段的胚胎会与验证ZFN套被显微注射。这些显微注射的胚胎将被转移到同步胚胎收件人。一个月后怀孕期,新生儿会进行基因分型(CP-3)。如果没有一个新生儿是积极的,额外的显微注射将被执行。这需要2-3个月从项目开始到CP-2,假设n过程中O故障。它从CP-2额外的2-3个月到CP-3。因此,有可能产生一个基因敲除兔子使用ZFN技术4-6个月的时间。 点击这里查看大图 。
图2。 ZFN设计 。三ZFN集(集1,2和3),其中针对于外显子1或兔ApoCIII(A)外显子2不同的序列。所有三组经受酵母MEL-1报告基因分析,以确定ZFN活动。根据制造商的协议,即显示该制造商的内部阳性对照的> 50%的活动的ZFN被视为用于在体外和体内的基因组编辑实验是有用的。该ZFN活动是为组1 224.2%,为组2 196.9%和集3(B)177.8%,因此设定1是在本研究中选择的。 点击这里查看大图 。
图3 在体外胚胎ZFN的验证 。套装1的mRNA表达(5微克/毫升),显微注射至35原核阶段的胚胎兔(A)的细胞质。冲洗无胚胎显微注射治疗组(n = 31)作为对照组。对BL发展率为77.4%,对照组。在显微注射组,BL率为51.4%。 16酰胺酶进行PCR测序,8(50%)被确定为阳性,说明台1是一种有效的ZFN集以诱导突变的圆盾婷网站(B,apoc3wt.seq,黑盒装)ApoCIII兔。含突变BLS的是BL#APOC-3,4,5,7,11,13,15,和17(B,红色下划线)。其余的BLS(#APOC-2,6,9,10,12,14和16)不要在靶向部位有突变。 点击这里查看大图 。
图4。生产ApoCIII KO兔 。一百四十五胚胎显微注射ZFN设为1的mRNA被转移到7假孕收件人兔(A)。新鲜刷新胚胎(n = 75人),而不ZFN显微注射转移到收件人(N = 6)作为对照组。按总期限套件/总胚胎实验组术语率为14.5%(21/145),而速度是29.3%(22/75),对照组(A组)。出出生的显微注射组,5(R 1,R9,R11,R12和R16)在21试剂盒鉴定的PCR测序(B)后作为阳性KO试剂盒。在目标站点上的插入缺失包括两个插入(+1两个R9和R11)和三个缺失(Δ1,Δ20,Δ21,R1,R12和R16,分别)。 点击这里查看大图 。
The authors have nothing to disclose.
这项工作是部分由美国国立卫生研究院的赞助资金(HL105114,HL088391,NS066652和HL068878到YEC),美国心脏协会(National科学家开发0835237N到JZ)。 YEC的财政支持,因为心血管内科赋予弗雷德里克Huetwell教授在密歇根大学医学中心(UMMC)。这项工作动用Center支持Core Services中的平移科学和治疗(CAMTraST)在UMMC先进典型。
APOC3-ZFN | Sigma Aldrich | CSTZFNY-1KT | Target Gene: APOC3, Lot Number: 12201118MN |
mMESSAGE kit | Invitrogen | AM1344M | mRNA synthesis |
MEGAclear Kit | Invitrogen | AM1908M | mRNA purification |
Follicle-stimulating hormone | Bioniche Life Sciences | Folltropin-V | Treating embryo donor rabbits |
Human chorionic gonadotropin | Intervet | Chorulon | Treating embryo donor rabbits |
Gonadotropin-releasing hormone | Prospecbio | HOR-255 | Treating embryo recipient rabbits |
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) | Thermo Fisher Scientific | SH30029.02 | Embryo culture, base medium |
MEM (nonessential amino acid) | Sigma Aldrich | M7145 | Embryo culture, supplements |
BME AMINO ACIDS solution | Sigma Aldrich | B6766 | Embryo culture, supplements |
Glutamine | Gibco | 25030-149 | Embryo culture, supplements |
Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | Embryo culture, supplements |
Fetal bovine serum | Sigma Aldrich | 12003C | Embryo culture, supplements |
HEPES buffered TCM 199 | Gibco | 12350039 | Embryo manipulation medium |
Incubator | Eppendorf | Galaxy 170 | Embryo culture equipment |
Micromanipulator | Eppendorf | TransferMan NK 2 | Embryo manipulation equipment |
Micropipette puller | Sutter Instruments Inc. | P-1000 | Embryo manipulation equipment |
Microinjector | Tritech Research | MINJ-D | Embryo manipulation equipment |
Borosilicate glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-6 | Embryo manipulation supply |
Euthasol (pentobarbitol sodium) | Virbac AH, Inc. | ANADA#200-071 | Euthanization of embryo donor rabbits |