Summary
Den senaste utvecklingen inom riktad genmodifiering verktyg som gör produktionen av knockout (KO) kaniner möjligt. I föreliggande arbete har vi genererat fem apolipoprotein (Apo) C-III KO kaniner med användning av zinkfinger nukleaser (ZFN). Detta arbete visade att ZFN är en mycket effektiv metod för att producera KO kaniner.
Abstract
Apolipoprotein (Apo) C-III (ApoCIII) befinner sig på ytan av plasma kylomikron (CM), mycket låg density lipoprotein (VLDL) och hög densitet (HDL). Det har konstaterats att höga nivåer av plasma ApoCIII INNEBÄR riskfaktor för kardiovaskulära sjukdomar (CVD). Förhöjda plasma ApoCIII nivå ofta korrelerar med insulinresistens, fetma, och hypertriglyceridemi. Ovärderlig kunskap om roller ApoCIIIin lipid ämnesomsättning och hjärtkärlsjukdom har erhållits från transgena musmodeller inklusive ApoCIII knockout (KO) möss, men det noteras att omsättningen av lipoprotein i möss är annorlunda än människor i många aspekter. Det är inte känt förrän nu om förhöjda plasma ApoCIII är direkt atherogenic. Vi arbetade för att utveckla ApoCIII KO kaniner i föreliggande studie baserad på hypotesen att kaniner kan fungera som en reasonablemodelfor studerar mänsklig lipid metabolism och åderförkalkning. Zink finger nukleas (ZFN) uppsättningar inriktning kanin ApoCIIIgene utsattes för in vitro validering före embryomikroinjektion. MRNA injicerades till cytoplasman av 35 kanin Pronukleära scenembryon, och utvärderat mutationshastigheter på blastocysten staten. Av sexton blastocyster som analyserades, var en tillfredsställande 50% mutationshastighet (8/16) på inriktningen webbplatsen uppnås, stödja användningen av Set 1 för in vivo-experiment. Därefter injiceras vi 145 embryon med Set 1 mRNA, och överfört dessa embryon till 7 mottagande kaniner. Efter 30 dagars dräktighet, var 21 satser födda, varav fem bekräftades som ApoCIII KO kaniner efter PCR-sekvenseringsanalyser. Den KO djur hastighet (# KO kit / totalt född) var 23,8%. Den totala produktionseffektivitet är 3,4% (5 kits/145 embryon). Föreliggande arbete visade att ZFN är en mycket effektiv metod för att producera KO kaniner. Dessa ApoCIII KO kaniner är nya resurser för att studera de roller ApoCIII i lipid ämnesomsättning.
Introduction
Apolipoprotein (Apo) C-III (ApoCIII) är en liten O-glykosylerat utsöndrat protein som syntetiseras huvudsakligen i levern och tarmen. Den befinner sig på ytan av plasma kylomikron (CM), mycket låg density lipoprotein (VLDL) och hög densitet (HDL). ApoCIII har erkänts som en riskfaktor för hjärt-kärlsjukdom 1. Patienter med ärftlig brist på ApoCIII har låg plasma triglycerider (TG) nivåer och minskad subklinisk kranskärls åderförkalkning 2,3. Förhöjda plasma ApoCIII nivå, å andra sidan, korrelerar ofta med insulinresistens, fetma, och hypertriglyceridemi (HTG) 4,5.
Gene knockout (KO) är ett kraftfullt medel för att studera funktionen av en gen. I överensstämmelse med observationerna i humana muterade populationer, knockout av ApoCIII genen i möss ledde till en minskning av plasma TG och skydd mot postprandial HTG 6. En sådan positiv roll ApoCIII dökvara oberoende av apolipoprotein E (ApoE), som mus med brist på både ApoE och ApoCIII skyddas också från postprandial hyperlipidemi 7. Även om dessa modeller ApoCIII KO möss har gett ovärderlig information om möjliga funktioner ApoCIII hos människor, kan det noteras att omsättningen av lipoprotein av möss är annorlunda än människor i många aspekter. Till exempel, mus saknar plasma kolesterylester transferprotein (CETP), en viktig enzym som är involverat i transport av VLDL, LDL och HDL 8. Därför är det nödvändigt att utveckla en lämplig djurmodell för att ytterligare förstå den fysiologiska roll ApoCIII in vivo.
Kaninen är en klassisk modell djurart 9-11. Den har en kort dräktighetsperiod (30-31 dagar), stor kullstorlek (4-12/litter) och kan hållas bekvämt i en inomhus anläggning. Jämfört med möss, kaniner är fylogenetiskt närmare människor 10. Huvudsakligen liknande humannen men till skillnad från möss, kaniner är LDL rika däggdjur och har betydande nivåer av CETP 10,12. Dessutom är de känsliga för kolesterol-rik kost-inducerad ateroskleros med skador liknande de som ses i mänsklig åderförkalkning 13. Av dessa skäl antog vi att ApoCIII KO kaniner kan tjäna som en bättre modell än deras mus motsvarigheter att undersöka rollerna för ApoCIIIplay i lipidmetabolism och ateroskleros hos människa.
Produktion av genen riktade transgena (GTT) kaniner har varit en utmaning. Detta är främst på grund av bristen på könsceller sänder embryonala stamceller (ESC), och den extremt låga verkningsgrad somatisk kärnöverföring (SCNT) i kaniner. ESK är det främsta verktyget för att generera GTT möss, medan och SCNT har med framgång tillämpats för att generera KO djur i arter som saknar könsceller sänder ekonomiska och sociala råd, bland annat grisar, får och nötkreatur, men inte kaniner. Nyligen Zinc Finger Nuclease (ZFN), Tranteckning Activator-Liksom Effector Nuclease (TALEN) 14, och RNA Guidad Endonukleas (RGEN) 15 dykt upp som kraftfullt medel för genom redigering. Dessa nukleaser, så kallade "molekylära saxar", är effektiva i att skapa dubbelsträngbrott (DSB) i arvsmassan som kan leda till en funktionell KO av de riktade genen eller som används för att integrera en DNA-sekvens på ett specifikt ställe i genomet i ett antal arter 16. Under 2011 bland de första att anpassa ZFN teknik, vi genererade peroxisomproliferator-activated gamma (PPARy) KO svinceller via detta tillvägagångssätt och framgångsrikt genererade PPARy KO grisar efter att använda dessa celler för SCNT 17. Under samma år, var effektiv immunglobulingen störningar och riktade ersättare i kaniner också använder ZFN rapporterade 18.
I den aktuella studien har fem ApoCIII KO kaniner genereras som bekräftas av PCR-sekvensering, med hjälp av ZFN Set 1 (se figur 1
Protocol
Alla djur underhåll, skötsel och användning förfaranden granskades och godkändes av University kommittén för användning och underhåll av djur vid universitetet i Michigan.
1. ZFN Design och urval
- Tillförsel av den genomiska sekvensinformation av genen av intresse (t.ex. kanin ApoCIII) till tillverkaren. Välj ZFN set (er) för experimenten bygger på ZFN poäng.
2. Kanin embryosamlings
- Superovulate sexuellt mognat (6-18 månader) New Zealand White (NZW) kvinnliga kaniner genom subkutan (sc) injektion av FSH två gånger / dygn med en dos av 3 mg för de två första injektionerna, 5 mg för de kommande två injektioner och 6 mg för de senaste två injektioner.
- Administrera en enda intravenös (iv) injektion av 200 IE hCG vid 72 timmar efter den första FSH injektionen för att framkalla ägglossning. Mate de superovulated honorna med en manlig kanin omedelbart efter hCG-injektionen.
- Euthanize de superovulated donator kaniner med natriumpentobarbital (150 mg / kg, iv) vid 16 till 18 h efter insemination (psi).
- Åter äggledare ampuller genom att försiktigt samla in hela äggledare och äggstockar struktur.
- Spola varje äggledare med 10 ml manipulation medium för HEPES-buffrad TCM 199 kompletterat med 10% fetalt bovint serum, genom att injicera mediet från livmodern slutet av äggledaren. Samla det spolade mediet vid äggstock-ändöppning äggledaren till en petriskål.
- Observera och identifiera återvunna embryon i den spolas mediet, tvätta embryon tre gånger i manipulation mediet, hålla dem i manipulation medium vid 38,5 ° C i luft, och observera dem under ett stereomikroskop för förekomst av befruktning. Förbered för mikroinjektion på Pronukleära scenembryon 19-21 h psi
3. Beredning av ZFN mRNA
- Rena den resulterande mRNA innan resuspension i RNas-fri 0,1 x TE (1 mM Tris-Cl pH8,0, 0,1 mM EDTA). Mät koncentration och lagra mRNA vid -80 ° C fram till användning.
- Förbered mRNA kodar ZFN pair (4-10 ng / ul i en mMTris-Cl, 0,1 mM EDTA vid pH 7,5), alikvot in i 10 | il injektionsflaskor. Förvara dem vid -80 ° C tills produkten ska användas. Innan mikroinjektion, tina RNA flaskan (s), och hålla den på is.
4. Embryo Mikroinjektion
- Förbered mikroinjektion plattform genom att placera en 5 l droppe av manipulation medium på en 1-väl kammare bild som har mediekammaren bort. Täck mediet droppe med mineralolja och plats på den uppvärmda mikroskop scenen.
- Placera hålla pipett (120 nm i diameter) i hållaren arm mikromanipulator och placera den i droppe manipulation medium.
- Tillverka injektion mikropipetter genom att värma och dra borosilikatglas kapillärrör i en mikropipett avdragare enhet. Fyll på mRNA som skall injiceras i injektions pipett.
- Slå på tryckluften som är ansluten till en mikroinjektor.
- Placera injektions pipett i injektionshållaren, satte den på mikromanipulator och placera den i droppe manipulation medium.
- Setup microinjector, med följande förslag på parametrar: holdP = 2 psi, InjP = 20 psi, ClearP = 60 psi, Injtime = 1 sek, vilket kommer att resultera i en injektionsvolym på 1-5 pl.
- Öppna toppen på injektionspipetten genom att försiktigt knacka den mot anläggningen pipett.
- Överför embryon (30-50) till mikromanipulation droppe på plattformen. Använd innehavet pipetten för att fånga ett embryo och rikta in injektionsnålen, embryo och innehavet pipetten längs x-axeln.
- Under 400X förstoring, avancera injektionen pipetten genom embryot. Var noga med att undvika kärnan. När plasmamembranet är genomborrad, tryck fotpedal injicera. Efter injektion, dra ut nålen, släpp embryot. Upprepa processen för alla återstående embryos.
- Tvätta injicerade embryon tre gånger i embryoodlingsmedium, som består av Earles balanserade saltlösning (EBSS) kompletterad med icke-essentiella aminosyror (NEAA), essentiella aminosyror (EAA), 1 mM L-glutamin, 0,4 mM natriumpyruvat, och 10% FBS.
- Inkubera embryon vid 38,5 ° C i 5% CO2 i luft under 1-2 tim innan de kirurgiskt fördes till äggledarna hos en synkroniserad mottagare kvinnlig NZW kanin (se steg 5.1). Alternativt, kultur embryon tills de når blastocyststadiet innan de används för in vitro-validering eller analyser.
5. Embryo Transfer
- Välj en kvinnlig NZW kanin 5-12 månader gammal, vid god hälsa, som väger ca. 4,0 till 5,0 kg som mottagar djur. Administrera gonadotropinfrisättande hormon (GnRH) injektion intramuskulärt (im, 50 mcg / ml, 0,3 ml / djur) till mottagaren vid samma tidpunkt med den hos hCG-injektion till donatordjuret (er) (se steg 2.2). Efter avslutad mikroinjektion, förbereda mottagaren kanin för embryoöverföring (normalt 16-24 timmar efter GnRH injektion). Söva kaninen med 10-40 mg / kg ketamin (im), och / eller förångas isofluran (2-4%) vid inandning. Skydda kaninens ögon från överdriven torkning genom anbringande av en steril oftalmisk salva. Observera djuret tills den är helt medvetslös, dvs. svarar inte på pedalreflexer, klämma foten pad används för att kontrollera om avsaknaden av pedal reflex som är en indikation på adekvat anestesi.
- Raka kaninens mage, tvätta med antiseptisk scrub, följt av antiseptisk lösning, och torka av det rakade området med steril gasbinda svampar.
- Utför operation under sterila förhållanden, spela vitala tecken på mottagarens kaninen ungefär var 15 min under hela operationen.
- För över 10-25 embryon till en mottagare djur, beroende på det tillgängliga antalet embryon.
- Vid slutet av denkirurgiska ingrepp, stänga muskellagret med bestruket absorberbara suturer. Sutur huden med antingen en subkutikulär sutur med användning av absorberbar sutur eller med enkla avbrutna hud suturer som använder nonabsorable sutur (t.ex. monofilament av nylon eller liknande).
- Håll djuret varmt och följa den tills dess sternala VILA uppnås.
- Övervaka djuret dagligen. Följ veterinärens anvisningar för att ta hand om djuret. Administrera meloxikam (sc 1,0 mg / kg) för att lindra smärta och / eller minska feber dagliga inlägg drift om bestämd behov av veterinären.
- Ta nonabsorable hud suturer vid cirka 10-14 dagar efter operationen.
6. Detektion av ZFN Inducerad genavbrott
- För in vitro-validering, utföra genotypning på de odlade embryon in vitro. Lyse enskilda embryon som utvecklats till morula / blastocyst stadier i 5 | il NP40-lösning (1% NP40 plus 1 ug / ml proteinas K i Taq-buffert) Under 0,5-1 timmar vid 55 ° C och 10 minuter vid 95 ° C.
- För genotypning av avkomman, samla öron hudprover från nyfödda kit, extrahera iskt DNA, och använda dem som mallar för PCR-sekvensering. Applicera Kwik-Stop till provtagningsområdet efter insamling för att stoppa blödning och minska obehag.
- Använd lys från steg 6,2 eller 6,3 som templat för PCR med användning av LA-Taq-och PCR-primerpar, som är belägna uppströms (5'-TGAGGCCGGGAAGGGAGCAGTCG-3 ') och nedströms (5'-GCCAGGCCCACCCACGGAACAGC-3') av ZFN målstället .
- Rena PCR-produkter och sekvensera dem med sekvenseringsprimer (5'-TCTGCACGCTTGGGGCTGGAG-3 ').
- Identifiera prover mutant genom att leta efter dubbel kurva i sekvensdiagram runt måls webbplatsen. Märk de med dubbla kurvor som "positivt".
- Klona "positiva" PCR-produkter in i TA-kloningsvektor, plocka upp 10-20 kloner, sekvens skären, och bekräfta mutation runt targeting stället.
Representative Results
In vitro validering av ZFN par
Sexton ZFN paren var ursprungligen tänkt. De riktade avbrott sekvens av Set 1 är belägen vid Exon 2 av kanin ApoCIII (Figur 2A). Tre par (Set 1, 2, och 3, figur 2A) valdes ut och utsattes för jäst MEL-en reporteranalys för att bestämma de ZFN aktiviteter (Figur 2B). Set 1 har en ZFN poäng på 224,2%, högre än Set 2 (196,9%) och Set 3 (177,8%) och mycket högre än tröskel val (dvs. 50% av den inre positiv kontroll). Därför Set 1 valdes för in vitro valideringsexperiment.
En särskild uppsättning behöver resultera i en positiv priser i embryon av 10% eller högre för att passera embryot validering in vitro, baserat på de interna valideringsvillkoren. MRNA (5 pg / ml) för Set 1 mikroinjicerades till cytoplasman i 35 Pronukleära skede kaninembryon (Figur 3A </ Strong>). Flushed embryon utan mikroinjektion behandling (n = 31) användes som kontrollgruppen. Arton embryon av mikroinjiceras gruppen utvecklade till BL skede på D5, av vilka sexton sekvenserades och åtta (BL # apoc-3, 4, 5, 7, 11, 13, 15, 17, fig 3B, understruken röd) som visas muterade sekvenser vid målinriktning stället (black-box, fig. 2B, övre raden, apoC3wt.seq). Den BL hastigheten för mikroinjiceras gruppen (51,4%) är lägre än den hos kontrollgruppen (77,4%), vilket indikerar en mindre nedsättning av utvecklings behörighet mikroinjicerade embryon. Den positiva mutationshastighet för mikroinjicerade embryon är 50,0% (8/16), mycket högre än tröskeln urvalet (dvs. 10%). Dessa resultat visade att Set 1 är ett effektivt ZFN set för att framkalla mutationer i måls platsen av kanin ApoCIII. Därför Set 1 valdes för in vivo produktion av ApoCIII KO kaniner.
Produktion av ApoCIII KO kaniner
MRNA of ZFN Set 1 mikroinjicerades till cytoplasman av kanin Pronukleära scenembryon, och överfördes 145 mikroinjicerade embryon till 7 pseudo-gravid mottagande kaniner (Figur 4A). Färskt spolas embryon (n = 75) utan ZFN mikroinjektion överfördes till mottagare (n = 6) som kontrollgruppen. Efter 30 dagars dräktighet, var 21 satser födda i mikroinjicerade gruppen. PCR-sekvensering identifierades fem (apoC3-R1, R9, R11, R12 och R16) som positiva KO kit (Figur 4B). Termen beräknad som total sikt kit / totala embryon är 14,5% (21/145), medan priset är 29,3% (22/75) i kontrollgruppen. Den KO beräknad som totala KO kit / total term är 23,8% (5/21). En KO kit (apoC-R16) avled fem dagar efter förlossningen (20,0%, 1/5). Den indelsat inriktningen webbplatsen inkluderar två infogningar och tre strykningar, de areΔ1, +1, +1, Δ20 och Δ21, för kaniner # R1, R9, R11, R12 och R16, respektive (Figur 4B).
Bioinformatics analys användes för att identifiera potentiella ZFN off-mål med 7 eller färre obalans att Set 1 sekvens, som beskrivits tidigare 17. Endast en förutspådde möjlig utanför målområdet, som ligger på kromosom 14, identifierades med 7 inkompatibla bps. PCR-analys upptäckt några off-mål händelser i någon av de grundande djuren.
Discussion
I föreliggande arbete har fem ApoCIII KO kaniner genereras med hjälp av ZFN teknik. Tidigare den enda rapporten om produktionen av GTT kaniner också använt ZFN teknik 18. Den nuvarande arbete bekräftade att ZFN är användbart för att effektivt nå gener i kaniner.
I den aktuella studien, den transgena hastighet (positiv kits / totalt fött) is23.8% (5/21), som är jämförbar med den för den tidigare ZFN rapport hos kaniner (30,8%, 16/52) 18, och de rapporterade av att använda ZFN i andra djurarter, inklusive zebrafisk 19, möss 20, råttor 21 och svin 17. Denna kurs är i själva verket högre än de nivåer av många konventionella transgen kanin produktionsstudier, som normalt faller i intervallet 5-20%. Till exempel, i ett försök att produkten ApoCIII transgena kaniner via konventionella DNA-mikroinjektion, Ding et al. Erhölls tre positiva grundare av 54 födda ungar (5,6%) 22.
I överensstämmelse med tidigare fynd, de mutationer vid de riktade platser är variabel, inklusive deletioner eller inser bestående olika antal baser (mellan 1-21 på de fem KO kaniner). Baserat på den specifika sekvensinformation av grundardjur, är det förutspås att minst fyra (dvs. Sådana som innehåller Δ1, +1, +1, eller Δ20 mutationer) skulle ha funktionsförlust ApoCIII. Animal R-16 med Δ21 får inte visa funktionell förlust, eftersom denna mutation förutspås endast orsaka förlust av sju aminosyror, men inte en läsning ram skift. Ytterst fenotyp analyser är nödvändiga för att avgöra om dessa grundardjur visar verkligen förlusten av ApoCIII funktioner.
Ingen av de fem KO kaniner som genererats i denna studie innehåller bialleliska modifieringar. Intressant nog är detta också fallet i den förra ZFN kanin rapport. Däremot var när ZFNs riktar α1 ,3-galaktosyltransferas tillämpas på grisceller, frekvensen för riktad till ett enda allel varierade från 7 till 46%, med cirka en tredjedel av de mutationer som skapar ett enda steg biallelisk knockouts 23. I överensstämmelse med detta, när TALEN applicerades på gris fibroblastceller ades de bialleliska modifikationer förekommer hos cirka 15-40% av den totala positiva kloner 14. Det är möjligt att misslyckandet att generera bialleliska KO kaniner i denna studie kan tyda på en art skillnad (dvs. kaniner vs grisar) för sådan kapacitet nukleas baserad riktad genmodifiering. Det är dock mer troligt att det är helt enkelt därför att antalet KO kaniner som genereras i detta projekt är relativt liten. Vi tror att ZFN kan generera bialleic mutationer i kaniner, vilket bör betraktas som en annan potentiell fördel med ZFN baserad GTT kaninproduktion. Ytterligare experiment behövs för att bekräfta en sådan kapacitet ZFN i kaniner.
Sammanfattningsvis demonstrerar föreliggande arbete att ZFN baserad riktad genmodifiering tillvägagångssätt är effektivt på att producera KO kaniner. I synnerhet vi genererat fem ApoCIII KO kaniner med en tillfredsställande transgen hastighet av 23,8%. Dessa djur tros ge mer meningsfull information om proteinets roll i lipid metabolism hos människa än motsvarande musmodeller. Vi förutspår ZFN baserad gen inriktning, liksom andra nukleas baserade tekniker som TALEN och RGEN, i nonmurine djur kommer att avsevärt underlätta utvecklingen av nya djurmodeller för att studera olika mänskliga sjukdomar.
Figur 1. Flödesschema för produktion av knockout kaniner använder ZFN teknik. Produktion av KO kaniner använder ZFN teknik börjar med valet av genen av intresse. Den sekvensinformation tillhandahålls, ZFN uppsättningarna är utformade, och subjsad för jäst baserad på intern validering. Vid incheckning punkt (CP) 1 (CP-1), kommer endast de apparater passerade intern validering (50% eller mer av den inre positiv kontroll) skall ges till användarna om valet. Om inga apparater passerar CP-1, kan ytterligare sekvens behövas för att utforma effektiva ZFN-apparater. En in vitro embryo validering följs för att säkerställa den valda ZFN set kan framkalla mutationer på utvalda platser (CP-2). ZFN set (s) kommer endast att användas om den passerar CP-2 (> = 10% mutation klassar i in vitro embryon). Fel vid CP-2 kommer att kräva en redesign av ZFN-apparater. Embryo donatorer kommer att förberedas och Pronukleära scenembryon kommer att injiceras med de validerade ZFN set. Dessa mikroinjicerade embryon överförs till synkroniserade embryo mottagare. Efter en månad dräktighetstiden, kommer nyfödda genotypas (CP-3). Om inget av de nyfödda är positiva, kommer ytterligare mikroinjektion utföras. Det tar 2-3 månader från projektstart till CP-2, förutsatt no fel under processen. Det tar ytterligare 2-3 månader från CP-2 till CP-3. Därför är det möjligt att generera en knockout kanin i en 4-6 månaders tid med hjälp av ZFN teknologi. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 2. ZFN design. Tre ZFN set (Set 1, 2, och 3) utformades inriktade på olika sekvenser på Exon 1 och exon 2 av kanin ApoCIII (A). Alla tre uppsättningar utsattes för jäst MEL-en reporteranalys för att bestämma de ZFN aktiviteter. Enligt tillverkarens protokoll, är ZFNs som visar> 50% verksamhet som tillverkningen interna positiva kontrollen anses vara användbara för in vitro-och in vivo genomredigeringsexperiment.De ZFN verksamheten var 224,2% för Set 1, 196,9% för Set 2 och 177,8% för Set 3 (B), därför Set 1 valdes i denna studie. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3. In vitro validering embryo till ZFN. MRNA (5 pg / ml) för Set 1 mikroinjicerades till cytoplasman i 35 Pronukleära skede kaninembryon (a). Flushed embryon utan mikroinjektion behandling (n = 31) användes som kontrollgruppen. Den BL utvecklingstakt var 77,4% i kontrollgruppen. I den idag injiceras gruppen, BL takten var 51,4%. Av 16 BLs utsattes för PCR-sekvensering, var 8 (50%) identifierades som positiv, vilket indikerar Set 1 är en effektiv ZFN uppsättning för att inducera mutationer på siktating webbplats (B, apoc3wt.seq, black-box) av ApoCIII i kaniner. BLS innehållande mutationer är BL # apoc-3, 4, 5, 7, 11, 13, 15, och 17 (B, röd understruket). De återstående BLs (# apoc-2, 6, 9, 10, 12, 14 och 16) inte har mutationer i måls platsen. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 4. Produktion av ApoCIII KO kaniner. Hundra och fyrtiofem embryon mikroinjicerade med ZFN Set 1 mRNA överfördes till 7 pseudo-gravid mottagande kaniner (A). Färskt spolas embryon (n = 75) utan ZFN mikroinjektion överfördes till mottagare (n = 6) som kontrollgruppen. Termen beräknad som total sikt kit / totala embryon i experimentgruppen är 140,5% (21/145), under det att priset är 29,3% (22/75) i kontrollgruppen (A). Av 21 satser födda i mikroinjicerade gruppen, fem (R1, R9, R11, R12 och R16) identifierades som positiva KO kit efter PCR-sekvensering (B). De indels på måls plats inkluderar två införanden (+1 för både R9 och R11) och tre strykningar (Δ1, Δ 20 Δ 21 för R1, R12 och R16, respektive). Klicka här för att visa en större bild .
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete har delvis finansierats genom anslag från National Institutes of Health (HL105114, HL088391, NS066652 och HL068878 till YEC), American Heart Association (Nationella Scientist utvecklings 0835237N till JZ). YEC stöds finansiellt som begåvat Fredrik Huetwell professor i kardiovaskulär medicin vid University of Michigan Medical Center (UMMC). Detta arbete utnyttjas Core Services stöds av Centrum för avancerade modeller för Translational vetenskap och Therapeutics (CAMTraST) vid UMMC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APOC3-ZFN | Sigma Aldrich | CSTZFNY-1KT | Target Gene: APOC3, Lot Number: 12201118MN |
| mMESSAGE kit | Invitrogen | AM1344M | mRNA synthesis |
| MEGAclear Kit | Invitrogen | AM1908M | mRNA purification |
| Follicle-stimulating hormone | Bioniche Life Sciences | Folltropin-V | Treating embryo donor rabbits |
| Human chorionic gonadotropin | Intervet | Chorulon | Treating embryo donor rabbits |
| Gonadotropin-releasing hormone | Prospecbio | HOR-255 | Treating embryo recipient rabbits |
| Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) | Thermo Fisher Scientific | SH30029.02 | Embryo culture, base medium |
| MEM (nonessential amino acid) | Sigma Aldrich | M7145 | Embryo culture, supplements |
| BME AMINO ACIDS solution | Sigma Aldrich | B6766 | Embryo culture, supplements |
| Glutamine | Gibco | 25030-149 | Embryo culture, supplements |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | Embryo culture, supplements |
| Fetal bovine serum | Sigma Aldrich | 12003C | Embryo culture, supplements |
| HEPES buffered TCM 199 | Gibco | 12350039 | Embryo manipulation medium |
| Incubator | Eppendorf | Galaxy 170 | Embryo culture equipment |
| Micromanipulator | Eppendorf | TransferMan NK 2 | Embryo manipulation equipment |
| Micropipette puller | Sutter Instruments Inc. | P-1000 | Embryo manipulation equipment |
| Microinjector | Tritech Research | MINJ-D | Embryo manipulation equipment |
| Borosilicate glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-6 | Embryo manipulation supply |
| Euthasol (pentobarbitol sodium) | Virbac AH, Inc. | ANADA#200-071 | Euthanization of embryo donor rabbits |
References
- Ooi, E. M., Barrett, P. H., Chan, D. C., Watts, G. F. Apolipoprotein C-III: understanding an emerging cardiovascular risk factor. Clinical Science. 114, 611-624 (2008).
- Pollin, T. I., et al. A null mutation in human APOC3 confers a favorable plasma lipid profile and apparent cardioprotection. Science. 322, 1702-1705 (2008).
- Ginsberg, H. N., et al. Apolipoprotein B metabolism in subjects with deficiency of apolipoproteins CIII and AI. Evidence that apolipoprotein CIII inhibits catabolism of triglyceride-rich lipoproteins by lipoprotein lipase in vivo. The Journal of Clinical Investigation. 78, 1287-1295 (1986).
- Cohn, J. S., et al. Increased apoC-III production is a characteristic feature of patients with hypertriglyceridemia. Atherosclerosis. 177, 137-145 (2004).
- Cohn, J. S., Patterson, B. W., Uffelman, K. D., Davignon, J., Steiner, G. Rate of production of plasma and very-low-density lipoprotein (VLDL) apolipoprotein C-III is strongly related to the concentration and level of production of VLDL triglyceride in male subjects with different body weights and levels of insulin sensitivity. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 89, 3949-3955 (2004).
- Maeda, N., et al. Targeted disruption of the apolipoprotein C-III gene in mice results in hypotriglyceridemia and protection from postprandial hypertriglyceridemia. The Journal of Biological Chemistry. 269, 23610-23616 (1994).
- Jong, M. C., et al. Apolipoprotein C-III deficiency accelerates triglyceride hydrolysis by lipoprotein lipase in wild-type and apoE knockout mice. Journal of Lipid Research. 42, 1578-1585 (2001).
- James, J. F., Hewett, T. E., Robbins, J. Cardiac physiology in transgenic mice. Circ. Res. 82, 407-415 (1998).
- Duranthon, V., et al. On the emerging role of rabbit as human disease model and the instrumental role of novel transgenic tools. Transgenic Research. 21, 699-713 (2012).
- Fan, J., Watanabe, T. Transgenic rabbits as therapeutic protein bioreactors and human disease models. Pharmacol. Ther. 99, 261-282 (2003).
- Shiomi, M., Ito, T. The Watanabe heritable hyperlipidemic (WHHL) rabbit, its characteristics and history of development: a tribute to the late Dr. Yoshio Watanabe. Atherosclerosis. 207, 1-7 (2009).
- Morehouse, L. A., et al. Inhibition of CETP activity by torcetrapib reduces susceptibility to diet-induced atherosclerosis in New Zealand White rabbits. Journal of Lipid Research. 48, 1263-1272 (2007).
- Getz, G. S., Reardon, C. A. Animal models of atherosclerosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32, 1104-1115 (2012).
- Carlson, D. F., et al. Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).
- Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F., Marraffini, L. A. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology. 31, 233-239 (2013).
- Petersen, B. Update on 'molecular scissors' for transgenic farm animal production. Reproduction, Fertility, and Development. 25, 317-318 (2012).
- Yang, D., et al. Generation of PPARgamma mono-allelic knockout pigs via zinc-finger nucleases and nuclear transfer cloning. Cell Research. 21, 979-982 (1038).
- Flisikowska, T., et al. Efficient immunoglobulin gene disruption and targeted replacement in rabbit using zinc finger nucleases. PLoS ONE. 6, e21045 (2011).
- Foley, J. E., et al. Targeted mutagenesis in zebrafish using customized zinc-finger nucleases. Nature Protocols. 4, 1855-1867 (2009).
- Carbery, I. D., et al. Targeted genome modification in mice using zinc-finger nucleases. Genetics. 186, 451-459 (2010).
- Mashimo, T., et al. Generation of knockout rats with X-linked severe combined immunodeficiency (X-SCID) using zinc-finger nucleases. PLoS ONE. 5, e8870 (2010).
- Ding, Y., et al. Hypertriglyceridemia and delayed clearance of fat load in transgenic rabbits expressing human apolipoprotein CIII. Transgenic Research. 20, 867-875 (2011).
- Hauschild, J., et al. Efficient generation of a biallelic knockout in pigs using zinc-finger nucleases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 12013-12017 (2011).
