Summary
Мы описываем набор методов для изучения спонтанного поведения свободно плавающих слабо электрический рыбу в течение длительного периода времени, по синхронно измерения разряда электрический орган сроки животного, положение тела и осанку как точно и надежно в специально разработанной аквариума бака внутри сенсорной изоляция камеры.
Abstract
Долгосрочный поведенческая слежения может захватить и количественно природные поведения животных, в том числе те, которые происходят нечасто. Поведения, такие как разведка и социальных взаимодействий может быть лучше всего изучать, наблюдая необузданные, свободно ведут себя животные. Слабо электрическая рыба (ВЭФ) дисплей легко наблюдать разведочных и социального поведения, испуская электрический разряд органа (ПС). Здесь мы описываем три эффективных методов, чтобы синхронно измеряют EOD, положение тела и позу в свободное плавание ВЭФ в течение продолжительного периода времени. Во-первых, мы опишем построение экспериментальной бака внутри камере изоляции, призванной заблокировать внешние источники сенсорных стимулов, таких как свет, звук, и вибрации. Аквариум распределяли для размещения четырех испытательных образцов, и автоматизированные ворота дистанционно контролировать доступ животных к центральной арене. Во-вторых, мы описываем точный и надежный метод измерения ПС времени в режиме реального времени от свободно плавающих ВЭФ. Сигнальные искажения, вызванные движениями тела животного исправляются пространственного усреднения и височной стадии обработки. В-третьих, мы описываем подводную установку ближнего инфракрасного изображений наблюдать невозмущенные ночные поведения животных. Инфракрасные световые импульсы использовались для синхронизации времени между видео и физиологического сигнала в течение периода записи в длину. Наша автоматизированная программа отслеживания измеряет положение тела животного и позы надежно в водной сцене. В сочетании, эти методы позволяют долгосрочные наблюдения спонтанного поведения свободно плавающих слабо электрический рыбу в надежной и точной манере. Мы считаем, что наш метод может быть так же применяется к изучению других водных животных, соотнося свои физиологические сигналы с поисковых или социального поведения.
Introduction
История вопроса. Количественные эксперименты по поведению животных (например, вынужденный выбор, избегание шок, Т-лабиринт, и т.д..), Как правило, используются для расследования конкретных гипотез относительно навыков сенсорно-моторных, обучение и формирование памяти. Тем не менее, эти ограничительные эксперименты пропустить большую часть богатства естественного поведения животных и, вероятно, привести к упрощенным моделям основной нервной основе поведения. Опыты в более натуралистических условиях, следовательно, важным дополнением, по которому мы можем исследовать более полно вида поведения репертуар. Опыты с свободно движущихся животных, должны, однако, решения уникальных технических проблем, таких как движения, вызванной артефактов записи. В отличие от стимула, вызвали ответы, спонтанно происходит исследовательское поведение не может быть предсказано, таким образом испытуемые должны постоянно контролироваться и отслеживаться в течение длительного периода времени. Конкретные вопросы исследования чан, лучше всего осуществить с помощью тщательно отобранных организмов и доступных технических средств. Например, оптической записи и стимуляции методы, такие как генетически-кодированных датчиков кальция 1 и Optogenetics 2 были успешно применены свободно двигаться генетической модели организмов 3-5. Кроме того, миниатюрные нейронные системы телеметрии может записывать и стимулировать свободно перемещаться мелких животных 6,7.
Электрический рыбы. Виды ВЭФ генерировать разряды электрического органа (ЕСПЗ), которые позволяют им чувствовать свое непосредственное окружение или общаться на больших расстояниях. Временные закономерности ЕСПЗ отличаться в разных условиях, таких как самостоятельного движения 8,9, сенсорных стимулов 10,11 и социальных взаимодействий 12,13. Импульсного типа ВЭФ виды производят на поезд дискретных импульсов, в отличие видов махать типа, которые генерируют непрерывные квази-синусоидальной формы волны. В общем, пульс типа видов экспонат морэ переменная скорость ПС по сравнению с видами волна типа и EOD ставки животных точно отражать новизну содержимое своих сенсорных окрестностях 10,14. Видов импульсного типа можно сразу сократить интервал между импульса (IPI) в пределах одного цикла импульса в реагировать к новому сенсорной возмущения (новинка отклика 10,11,14). Продолжающийся электрический поведение этих рыб можно возмущается неконтролируемых сенсорных стимулов из внешних источников, и различные виды раздражителей, таких как вибрация, звук, свет, и свет, как известно запуска ответов новизны. Таким образом, особые меры предосторожности должны быть приняты, чтобы заблокировать или ослабить внешние сенсорные стимулы во время долгосрочного наблюдения свободное плавание ВЭФ. Таким образом, изменения в скорости EOD и траекторий движения может быть специально отнесены к стимулам, представленных экспериментатора.
Аквариум бак и изоляция камеры. Поэтому мы помещены несколько слоев Амортизирующая материалов уNDER большой аквариум бак (2,1 м х 2,1 м х 0,3 м), и окружили танк с изолированным корпусом блокировать внешние источники света, электрических помех, звук и теплового потока. ПС ставка зависит от температуры окружающей среды 15,16, при этом температура воды была жестко регулируется на тропический диапазоне (25 ± 1 ° С) для видов южноамериканских ВЭФ. Мы построили большой и мелкой (10 см глубина воды) бак для наблюдения пространственные разведочных поведения ВЭФ в основном ограничены в двух измерениях (рис. 1А). Танк был разделен на центральной арене, чтобы наблюдать пространственные поведения, и четырех угловых отсеков отдельно дом отдельных рыб (рис. 1В). Каждый отсек был построен водонепроницаемыми для предотвращения электрическую связь между физическими лицами. Доступ животных к центральной арене контролировалась извне четырех моторизованных ворот. Ворота были размещены между отсеками, и они стали водонепроницаемыми, когда закрываетсянейлоновыми крыла гаек. Нет металлические части были использованы подводные с ВЭФ чутко реагируют на металлы.
Запись ПС. ЕСПЗ генерируются в стереотипной манере активацией одного (в Mormyrids) или нескольких пространственно распределенных электрических органов (в Gymnotiforms) 17,18. Временные модуляции в скорости EOD может выявить нейронные деятельности более высокого уровня, так как мозговое кардиостимулятор получает прямые нервные сигналы от высших отделов головного мозга, таких как диэнцефального prepacemaker ядра, которое, в свою очередь получает аксональные прогнозы от переднего мозга 19. Однако сроки EOD должны быть тщательно экстрагируют из сырого сигнала записи, а не смещен движения искажений, вызванных животного. Электрическое поле порождается ВЭФ можно приблизить как диполь, поэтому EOD импульсные амплитуды на регистрирующих электродов зависят от относительных расстояний и направлений между животным и электродов 8,20. Самостоятельно MOVEM животногоЭнты изменить относительную геометрию между животным и электродами, при этом движения вызывают амплитуды EOD на различных электродов в изменяться с течением времени в летучем образом (см. фиг.2В в июне и соавт. 8). Кроме того, само-движения также изменить форму записанных EOD сигналов, потому что относительный вклад от другой набор электрических органов зависит от их расположения по длине тела и их местных кривизны введенной хвост изгиба. Искажения движения, вызванной в амплитуд и форм EOD может привести к неточных и ненадежных измерений временных EOD. Мы преодолели эти проблемы, пространственно среднем несколько сигналов EOD записанные в разных местах, и, добавив фильтр извлечения конверт точно определить время EOD из свободное плавание ВЭФ. Кроме того, наш метод также измеряет амплитуду EOD, которые указывают ли животное отдыхает или активно перемещения на основе изменения EODамплитуды с течением времени (см. рис 2E и 2F). Мы записали дифференциально усиленные сигналы от записи пар электродов для уменьшения синфазного шума. Поскольку импульсы EOD генерируются с нерегулярными интервалами времени, событие временных рядов ПС имеют переменную частоту дискретизации. EOD временные ряды могут быть преобразованы в постоянной частоты дискретизации посредством интерполяции, если этого требует аналитической инструмент выбора.
Запись видео. Хотя запись ПС может контролировать валовую двигательную активность животного, видеозапись позволяет прямые измерения положения тела животного и позы. Ближней инфракрасной области (БИК) освещение (λ = 800 ~ 900 нм) позволяет невозмущенную визуальное наблюдение свободно плавающих рыб 21,22, так как WEFs наиболее активны в темноте, и их глаза не чувствительны к NIR спектра 23,24. Большинство цифровых датчики изображения (например, CMOS или CCD) может захватить NIR спектр с wavelengtч Диапазон между 800-900 нм, после удаления Инфракрасный (ИК) блокирующий фильтр 25. Некоторые высокого класса потребительского класса веб-камеры предлагают высокой четкости, широкий угол обзора и хорошую низкой освещенности, который может производить качество изображения сравнимо с или выше профессионального уровня ИК камер, доступных на гораздо большие затраты. Кроме того, некоторые веб-камеры потребительского класса в комплекте с записи программного обеспечения, которое позволяет расширенную продолжительность записи путем сжатия видео без потери качества. Большинство профессионального уровня камеры предлагают времени синхронизации TTL импульсных выходов или TTL триггер импульсных входов 26 для выравнивания времени между видео с оцифрованных сигналов, но эта функция, как правило, отсутствует в потребительского класса веб-камер. Однако сроки между видеозаписи и сигнала цифровой преобразователь может быть точно подобраны по совместительству захвата периодически мигает ИК-подсветкой с камерой и сигнала цифрового преобразователя. Начальная и конечная сроки ИК импульса может использоватьсясек двух калибровочных время маркеры для преобразования числа видеокадров в единицу времени сигнал цифрового преобразователя и наоборот.
Освещение и фон. Захвата через воду изображение может быть технически сложным из-за отражения света на поверхности воды. Поверхность воды может действовать как зеркало, чтобы отразить визуальную сцену над водой, и темных визуальные особенности подводный, таким образом над водой сцена должна быть оказана невыразительный, чтобы предотвратить визуальный помех. Для того, чтобы изображение весь аквариум, камера должна быть размещены непосредственно над водой, и она должна быть скрыта за потолком над небольшим отверстием просмотра, чтобы предотвратить свое отражение на поверхности воды. Более того, поверхность воды может производить блики и неравномерного освещения, если источники света неправильно проецируется. Непрямое освещение может достичь равномерную яркость по всей аквариуме, нацеливая источники света к потолку, так что потолок и окружающая вальLs может отражать и рассеивают световые лучи, не достигнув поверхности воды. Выберите ИК-осветитель, который соответствует спектральной чувствительности камеры (например, 850 нм пик длины волны). Электрические помехи от источников света могут быть минимизированы с помощью светодиодов и размещения их источники питания постоянного тока за пределами клетки Фарадея. Поместите белый фон под баком, так как рыба контрастирует хорошо в белом фоне в ЧМР длин волн. Точно так же, использование матового белого цвета на внутренних поверхностях сурдокамере обеспечивает равномерное и яркое фоновую подсветку.
Отслеживания видео. После записи видео, автоматизированная алгоритм изображение слежения может измерять позиции и положения тела животного в течение долгого времени. Отслеживая видео может быть автоматически выполнена либо готового к использованию программного обеспечения (Точка зрения или Ethovision), или программируемой пользователем программного обеспечения (OpenCV или MATLAB Image Processing Toolbox). В качестве первого шага отслеживания изображения,действительный площадь слежения должна быть определена, рисуя геометрическую форму, чтобы исключить из нее часть снаружи (маскировки операцию). Далее, изображение животного должен быть изолирован от фона вычитанием фоновое изображение из изображения, содержащего животное. Вычитается изображение преобразуется в двоичном формате путем применения пороговой интенсивности, так что центр тяжести и осью ориентации может быть вычислена из бинарных морфологических операций. В Gymnotiforms 27-29 и Mormyrids 30-32, плотность electroreceptor является самым высоким вблизи области головы, поэтому положение головы в любой момент указывает местоположение самой высокой остроты слуха. Места головная и хвостовая может быть автоматически определяется путем применения операции поворот изображения и ограничительной рамки. Концы головы и хвоста можно было отличить друг от друга вручную определяя их в первом кадре, а также отслеживать их расположения от сравнения двух последовательных кадров.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эта процедура отвечает требованиям университета Оттавы комитета по уходу за животными. Нет конфликта интересов не объявляется. Пожалуйста, обратитесь к Таблице материалов и реагентов для марок и моделей оборудования и материалов, перечисленных ниже. Пользовательские письменные Spike2 и MATLAB скрипты и выборочные данные предоставляются в Дополнительной файла.
1. Аквариум и изоляция палата установки
- Анти-V ibration этаж. Построить поверхность анти-вибрации (2,1 м х 2,1 м), складывая резиновые прокладки, акустическая пенополистирола, морской панель фанеры и пенополиуретана колодки от основания до вершины (рис. 1А). Положите четыре деревянных шпильки (5 см х 10 см) на фанерной панели для поддержки края баком аквариума.
- Этаж обогреватель. Положите электрически экранированный нагревательный элемент над термически градуированной пены (см. рис 1D дно). Накройте нагревательный элемент с металломLIC сетка для электрического экранирования.
- Пространственное бак. Построить широкий и неглубокий аквариум бак (1,8 м х 1,8 м х 30 см) с использованием 1,3 см толщиной Закаленное стекло, Г-образный алюминиевый каркас и аквариум силикон (см. рисунок 1А). Обложка с нижней стороны бака с большой лист белом фоне, чтобы обеспечить высокую контрастность изображений (см. протокол 3).
- Разделите аквариум в центральной арене (диаметр 1,5 м) и четырех угловых отделений (см. рисунок 1В), установив стен (22,5 см в высоту) из акриловые листы (Matte White, толстые 0,64 см).
- Бенд четыре акриловые листы (22,5 см х 102,7 см), применяя тепло, чтобы создать четыре криволинейных участков стены, и прикрепить их к днищу емкости с помощью силиконового затыкают, чтобы отделить центральную арену от четырех угловых отсеков. Оставьте 20 см пространство между криволинейных участков для установки затвора.
- Отдельные соседних угловых отсеков, установив четыре двойных стен Wiй пробелы 15 см, которые обеспечивают дополнительную электрическую изоляцию и места для подводных датчиков, таких как гидрофоном.
- Соберите четыре моторизованные ворота, и установить их между угловыми отсеков и центральной арене.
- Соберите четыре дверных рам, как показано на рисунке 1С. Создайте шесть скважин (0,64 см в глубину) на каждой дверной рамы, вставлять нейлон желудь гайки (0,64 см диаметр резьбы) и закрепите их с эпоксидной смолой.
- Отрежьте четыре дверных панелей из акрила и резиновых листов, и создать шесть отверстий (0,64 см диаметр) на акриловой и резиновых панелей для запирающего механизма. Присоединиться к акриловые и резиновые панели, используя силиконовую замазку.
- Установите акриловая петли присоединиться дверные панели с дверными коробками.
- Гора размахивая руками на сервомоторов, и установить их на верхней части дверных рам (см. рисунок 1С). Сделать петли с помощью кабельных стяжек для связывания размахивая руками, чтобы дверных панелях.
- Расположите ворота сборок на гапс создается между криволинейных участках стены, и закрепите их с помощью силикона конопачение.
- Подключите все серводвигатели к сервоконтроллера, и подключить его к источнику питания и компьютеру через активного расширения USB кабеля. Проверьте ворота с помощью управления программное обеспечение, поставляемое с сервопреобразователя.
- После того, как силикон затвердеет, проверить на герметичность, заблокировав все ворота с нейлоновыми винтами и заполнение один отсек за один раз.
- Изоляция камеры. Построить сурдокамере окружить аквариум и блокировать внешние источники света, звука и электрических помех (см. рисунок 1D).
- Сделайте три стеновых панелей (2 м х 2 м х 5 см) и четыре дверных панелей (1,9 м х 0,95 м х 5 см). Для каждой панели, присоединиться алюминиевые молдинги (5 см х 2,5 см), чтобы создать прямоугольную рамку, и клепать белый гофрированный пластиковую панель на алюминиевой раме. Заполните акустические сланцы стекловолокна в панелях и рядом с черным гофрированным пластиковой панели.
- Установите три стеновых панелей на антивибрационной этаже, и установить фортепиано петли присоединиться четыре дверных панелей на стеновых панелях.
- Окружите изоляции камеру с алюминиевыми ячейками, и земля сетки со всех сторон, чтобы создать клетку Фарадея.
- Контроль влажности. Установите малошумящий вытяжной вентилятор (рис. 1F вверху), чтобы удалить лишнюю влажность наращивание от отопления. Поместите вытяжной вентилятор не менее 2 м от места записи, и установить воздуховод между камерой изоляции и вытяжного вентилятора.
- Регулярно контролировать и поддерживать условия резервуар для воды и животных.
- Поддерживать постоянные условия воды в 10 см глубиной, 100 мкСм / см проводимости и рН 7,0 путем добавления воды или соли исходного раствора (см. Кнудсен 33 за рецепт). Добавить мешок измельченной кораллов, если рН падает ниже 6,5.
- Установите вертикальные аквариума фильтры, которые могут работать с мелкой воде для очистки иаэрации целей (Рисунок 1F внизу). Отключите фильтры и взял их из центральной арене во время записи сессий.
- Доставка живых Mealworms на дне резервуара путем присоединения их на присосками с резинками. Избегайте свободно плавающие охотится, таких как blackworms, чтобы предотвратить бесконтрольное кормление бездомных жертв во время записи.
2. ПС слежения
- Установка Электроды. Соберите восемь графитовых электродов и пространство их пропорционально на изогнутой стене центрального арене.
- Получить чертеж провода (15 см в длину; Марс углерода 2 мм Тип HB) и сбрить внешнее покрытие из главных ролей.
- Вырезать восемь 10 см сегменты коаксиального кабеля (RG-174), оберните сердцевину кабеля вокруг одного конца графитовых стержнях, и применять термоусадочные трубки над ними для сильной и стабильной электрического соединения. Прикрепите BNC разъемы джек на противоположных концах (рис. 2А слева). </ Li>
- Расположите электроды на стене, записывая на пленку, и применять тонкие полосы клейкой лентой на поверхности электродов для защиты от силикона. Нанести силиконовый конопачение постоянно держать электроды, и удалить все ленту, прежде силиконовых затвердевает (рис. 2 справа).
- Построить восемь кабельные сборки путем измерения расстояния от каждого электрода к усилителю, и резки коаксиальных кабелей (RG-54) в длину. Прикрепите подключаемые разъемы BNC на обоих концах кабеля.
- Используйте кабельные сборки для подключения все электроды к усилителю. Дифференциально усилить путем спаривания два 90 ° ориентированные электроды (см. рисунок 2В), и на первом все коаксиальные защитные провода, подключив их к клетке Фарадея.
- Установка усиления усилителя ниже предела насыщения сигнала, а также применять полосовой фильтр (200 Гц-5 кГц), чтобы удалить шум. Оцифровка четыре записи электродных пар при 40 KS / сек.
- Онлайнобработки сигналов. В инструкции написаны для программного обеспечения Spike2, и настройки параметров оптимизированы для Gymnotus зр. (См. рисунок 2С для резюме).
- Добавить постоянного удаления процесс (τ = 0,1 сек) для всех каналов записи.
- Добавить исправить процесс все записи каналов.
- Создание виртуального канала путем суммирования всех четырех каналов записи.
- Выписка одномодальное конверт за EOD импульса, добавив RMS (среднеквадратичное-квадрат,
) Процесса (τ = 0,25 мс) в виртуальном канале, для генерирования один пик за EOD цикла однозначно определить время импульса. - Создать realmark канал из виртуального канала и запишите время и значения амплитуд пиков, после установки соответствующего порога, чтобы захватить все EOD импульсов шства без отсутствует пульс, избегая при этом ложных срабатываний.
- Монитор мгновенную скорость УВБ в реальном времени с помощью установки опции отображения канала в realmark канала с режимом мгновенной частоты.
- Контролировать движение рыб в реальном времени с помощью дублирования realmark канал, и установить опцию отображения в режиме сигнала.
- Количественная уровень активности от СКЗ амплитуды склоне EOD путем создания виртуального канала из realmark канала (0,01 сек периодом выборки), и добавить наклон (τ = 0,25 мс) и RMS (τ = 0,5 мс) процессы.
- Экспорт realmark канал в программном обеспечении Spike2 в формате MATLAB.
) Процесса (τ = 0,25 мс) в виртуальном канале, для генерирования один пик за EOD цикла однозначно определить время импульса. 3. Синхронное Отслеживание Видео
- Создайте фон сцены.
- Скрыть любой объект, который бросает отражение на поверхности воды, покрывая с матовой белой столешницы фильма.
- Установите Matte Whiteгофрированная пластиковая панель 15 см ниже потолка, чтобы скрыть камеру и вентиляционное отверстие.
- Печать моделей сетки на большом листе белой бумаги для калибровки камеры, и положить его под танк, чтобы обеспечить высокую контрастность фона.
- Установите источники света.
- Получить ИК светодиод и, удалить встроенные вентиляторы для снижения уровня шума. Драйв светодиод с текущим регулированием источника питания постоянного тока, помещенных вне клетки Фарадея.
- Установить ИК светодиодная подсветка для съемки в темноте, и белые светодиодные фонари для вождения суточный световой цикл в тестовом рыбы. Прямые все источники света к потолку, чтобы достичь косвенное и равномерное освещение (рис. 3А).
- Регулировать суточный световой цикл при движении белый светодиод с таймером управлением (например, 12 ч on/12 час выключено).
- Установите камеру непосредственно над аквариумом.
- Получить НИР-чувствительная камера, или удалить блокирующий Filte ИКR разбивая тонкий лист тонированного стекла на задней стороне линз. Убедитесь, что угол обзора достаточно широк, чтобы изображение вся центральная арена.
- Сделайте небольшое отверстие просмотра в середине потолочной панели, и поместите камеру непосредственно над отверстием.
- Установите белый кольцо на страже вокруг объектива, если источники света генерировать блики.
- Сделать времени синхронизируются видеозапись.
- Разместить ИК-подсветкой в одном из четырех танковых углах генерировать импульсы синхронизации времени (1 Продолжительность мс, 10 сек периода). Добавить нагрузки ограничения резистор (1 кОм) в серии, и управлять ИК-светодиод с цифровой выходной порт дигитайзер оборудования.
- Используйте записи видео программное обеспечение в комплекте с камерой, если таковой имеется. Выберите самое высокое качество записи (например, сжатия без потерь) и самые высокие разрешения, поддерживаемые.
- Запустите видеозапись непосредственно перед началом записи УВБ и остановить запись видео непосредже после записи EOD.
- После записи преобразования номера кадров изображений на единицу времени дигитайзер по линейной интерполяции между первой и последней световых импульсов, захваченных дигитайзера сигнала и видеозаписи.
- Автоматизированная отслеживания изображения
Инструкции написаны для MATLAB обработки изображения инструментов, и использовать его функций. Сценарий пользовательских MATLAB снабжен этого представления для автоматизированного отслеживания изображения.- Импорт видео. Импортировать файл записи видео непосредственно в рабочем пространстве MATLAB, используя "Videoreader. Читать" функцию.
- Создание составного фоновое изображение путем объединения двух кадров изображения. Замените область изображения, занимаемое животного с пустующего образу и подобию аналогичного области от другого кадра (см. рисунок 3B).
- Укажите область изображения для отслеживания, опираясь круговую маску вокруг центральной арене, чтобы исключить AREA пределами (рис. 3В внизу), и умножить на константу (г десятичного) установить минимальный порог для разности интенсивности. Например, установка RINT = 0,85 будет подавлять флуктуаций интенсивности 15% = (1 - R INT) ниже фоновом режиме.
- Вычитание изображения. Вычесть изображения кадра (= IM к) от фонового изображения (IM = 0), чтобы получить разностное изображение (= ΔIM К). Используйте целое без знака точность вычислений для хранения значений интенсивности изображения в качестве неотрицательных целых чисел.
- Сегмент разница изображение путем применения пороговой интенсивности определяется из функции graythresh. Очистите бинарное изображение с помощью функции bwmorph и выберите самый большой каплю, соответствующий животного после расчета всех областей больших двоичных объектов с помощью функции regionprops.
- Определите центр тяжести и основную ориентациюXis из крупнейших каплей, применяя функцию regionprops, и повернуть изображение, чтобы выровнять большую ось с осью х. Разделите изображение на головной и хвостовой частей в центре тяжести (рис. 3D вверху).
- Определите основную ось головной части, и вращать все изображение, чтобы выровнять с ось х (рис. 3D внизу слева). Установите ограничивающие-боксы вокруг головы и хвоста части параллельно их основных осей с помощью функции regionprops.
- Определить средние у-координаты капля на левой, центральной и правой вертикальных ребер ограничивающих прямоугольников (зеленые точки на рисунке 3D нижней), и назначить их на пять очков объектов (руководитель-наконечник, в середине головы, середины тела , средне-хвост, хвост-наконечник).
- Процесс последовательных кадров после обрезки кадра изображения с центром в центре тяжести животного определяется из его предыдущего кадра.
- Вручную назначить ориентацию головы для первого кадра, и использовать Betwe скалярного произведенияан ориентационных векторов из двух последовательных кадров для автоматического определения ориентации головы. Проверьте результат, и вручную переворачивать ориентацию головы, если неправильно назначены.
- Участок траектории животных путем присоединения штаб-советы, и гладкой с помощью средней и средней фильтры (п = 3), если она имеет нервный вид. Наложение траекторию с фоновым изображением, и интерполировать рыбы средних линий с использованием пять очков функций (см. рис 2E).
- Вычислить среднюю скорость УВБ в каждый момент времени захвата изображения передискретизации мгновенную скорость EOD (100 частоту дискретизации Гц) и в среднем (временное окно 0,0625 сек). Участок траекторию в псевдо-цветов, определенных по времени соответствием EOD скорости, и наложить с фоновым изображением (см. рисунок 2F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
EOD отслеживания результатов
Записанные EOD сигналы из разных пар электродов варьировалась в амплитуды и формы, как и ожидалось от их уникальных позиций и ориентаций (Рисунок 2C лучших). Использование нескольких пар электродов обеспечивается сильный прием сигнала на всех возможных положениях и ориентациях ВЭФ в резервуаре. Конверт сигнала (рис. 2C снизу, зеленая линия) всегда содержится один пик за EOD цикла, который служил в качестве надежного меткой времени для точного определения интервалов между импульсом и мгновенную скорость EOD (= IPI -1). Последовательные EOD пики присоединились и линейной интерполяции с постоянными временными интервалами (рис. 2D лучших, черный след), и мгновенная скорость ЭОД же с интерполяцией с постоянными временными интервалами (рис. 2D нижних, розовый следовых). Процедура повторной выборки постоянная времени облегчает синхронизацию времени бытьТвин траекторию движения и сигнал EOD, и позволяет использовать с большим количеством аналитических инструментов для постоянно выборочных данных временных рядов. Амплитуды EOD, записанные на внешних электродов оставалась постоянной в то время как животное было в состоянии покоя (рис. 2E верхней), но изменяться с течением времени, пока животное перемещается в связи с изменением дипольного местоположение и ориентацию (рис. 2F сверху). Таким образом, движение рыбы может быть выведено из наблюдая изменение амплитуд EOD с течением времени. Скорость ПС базовый оставалась низкой в то время как рыба была в состоянии покоя (рис. 2E нижней), но скорость ПС стал значительно выше, в то время как рыба активно плавали (Рисунок 2F вверху). Наше наблюдение согласуется с положительной корреляции между скоростью EOD и движения рыбы, как сообщалось ранее 8,9,34,35.
Результаты отслеживания Видео
Траектория и средние линии животного показаны на рис Юр 3E с первой и последней кадров изображения накладываются. Время-ход изменения осанки был захвачен в то время как рыба была резко поворачивая в течение двух секунд, и рыба средние линии нанесены каждые 200 мсек. Рыба средней линии правильно начал в головном кончиком и прекращается в кончика хвоста рыбы. Рыбные изображения тесно согласованные с автоматически отслеживаются средних линий, несмотря на тени литых животным. Рисунок 3F иллюстрирует изменяющегося во времени средний уровень EOD (τ = 0,0625 сек) в цвете, который накладывается со временем соответствием траектории голове рыбы -наконечник. Во время продолжительности поворотом 2 сек, средняя скорость EOD достигла своего пика в то время как животное было в середине поворота фазы, и скорость уменьшилась к концу поворота. Этот представитель результат показывает, что наш метод может быть успешно применен для изучения взаимосвязи между самонаводящимися движений и модуляции ПС курса в течение свободное плавание.
т "FO: держать-together.within-страницу =" всегда ">
Рисунок 1. Аквариум бак и изоляция камеры установки.) Экспериментальная камера состоит из анти-вибрации этаж, баком аквариума, и сурдокамере. Б) Аквариум бак был разделен на центральной арене для проведения экспериментов и четыре угловых отсеков для жилищного человека рыба. Каждый отсек был построен водонепроницаемыми для предотвращения электрическую связь между животными. C) моторизованные ворота иллюстрируется под разными углами перспективных. Ворота становится водонепроницаемым, когда блокируется шести крыла орехов, которые сжимают резиновую прокладку (светло-коричневый лист). После разблокирования ворота могут управляться дистанционно с помощью серводвигателя на самом верху. D) Камера изоляция была собрана путем присоединения трех жвсе панели и четыре дверные панели, которые обеспечивают доступ к баком аквариума с двух сторон. Нижняя панель показывает деревянные рельсы для поддержки танковых ребер и размещение этаж нагревателя. Слой алюминия сетки охватывает обогреватель, чтобы оградить его электрического шума. E) Стены и дверные панели из сурдокамере были построены из алюминиевых рам для структурной поддержки (3). Внутренние поверхности камеры покрыты белыми пластиковыми панелями (5), чтобы отразить внутренние источники света и экстерьеров покрыты черными пластиковыми панелями (2), чтобы блокировать внешние источники света. Алюминиевая сетка (1) охватывает наружные стены, чтобы блокировать внешний электрический шум. Стена заполнена акустических сланцы стекловолокна (4) F) фото вверху показана установка вентиляции воздуха для удаления избытка влажности, образуемый от нагревания;., А нижняя фото показана установка фильтрации воды для очистки, распространяя и аэрации резервуар для воды между экспериментальныйсессий. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 2. ПС настройки записи и показательные результаты.) Левая панель иллюстрирует электродный узел, состоящий из тонкой графитового электрода, коротком отрезке коаксиального кабеля, а также BNC Джек. Правая панель показывает электродов инструкции вложений. Клейкая лента используется для временного позиционировать электродный узел, и силикон уплотнение применялось постоянно держать электрод. B) электрической схеме. Два 90 ° ориентированные электроды в паре, дифференциально усиливается и фильтруется. Четыре канала записи были оцифрованы пределами Фарадея свозраст. C) Иллюстрация из шагов обработки сигналов EOD. Верхние следы показать сырые сигналов от четырех электродов пар, которые исправлены и суммируются для получения серый след ниже. Унимодальные конверты извлекаются из серого сигнала, используя "среднеквадратичное квадрат» (RMS) фильтра (зеленая линия). Амплитуда и АПИ EOD определяются из конверта пиков. D) изменяющегося во времени EOD амплитуды (вверху) и мгновенная скорость ПС (внизу) показаны на более длительном временном масштабе, чем C). Амплитуды EOD и мгновенная скорость (= IPI -1) интерполируются через равные промежутки времени, присоединившись к огибающей пики (черные следы). Е) То же, что D), но нанесены на более длительном временном масштабе в то время как рыба была в состоянии покоя. F) То же, что E), а рыба была активно плавающие. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 3. Настройка отслеживания видео и показательные результаты.) Установка освещения и камеры показано на рисунке. Инфракрасный (ИК) и видимые источники света прикреплены на стенах и указал на потолке, так, чтобы поверхность потолка отражает и рассеивает свет для проецирования равномерное освещение по всей бака. Камера скрыта выше потолочной панели, чтобы предотвратить отражение на поверхности воды. ИК-светодиод расположен на одном из четырех углов цистерны для генерации импульсов синхронизации времени. B) Создание составного фоновое изображение показано. Два кадра изображений (фотографии сверху) объединяются в составной фоновое изображение (внизу слева), заменив регион, содержащий животное (такКрышка красный квадрат) с областью без животного (пунктирная красный квадрат). Площадь за пределами центральной арене замаскировано в черном (внизу справа). C) выделение рыбы очертания. Кадр изображения (вверху слева) вычитается из фонового изображения (вверху справа), чтобы произвести разностного изображения (внизу слева), и преобразуется в бинарном изображении (внизу справа) путем применения порог интенсивности. D) Измерения положения тела и позы проиллюстрированы. Двоичный образ животного (BLOB) вращался привести свое большую ось с осью х (вверху справа), и с центром в его тяжести. Капля была отделена в голову (красный) и хвост (синий) части, и каждая часть была отдельно вращается для определения его ограничительной рамки. Капля была ориентирована на раме животного ссылки (внизу слева), и пять очков объектов (головной станцией, среднего голова, среднего тело, среднего хвост, хвост-конец) были определены из серединах ограничительной рамки края. Е) Покадровый имвозраст рыб средних линий нанесены каждые 200 мсек. Первые и последние кадры изображения накладываются во время поворота на 2 сек. F) Средняя ставка ПС представлена в псевдо-цвета и с наложенными на траектории головы рыбы. Те же изображения используются как в Е). Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Значение наших методов. Таким образом, мы впервые описал строительство большого аквариума бака и сурдокамере наблюдать спонтанные разведочных поведения произведенные ВЭФ. Далее, мы продемонстрировали технику записи и отслеживания скорости УВБ и государства движение от безудержного рыбы в режиме реального времени с использованием нескольких пар электродов. Наконец, мы описали инфракрасный метод записи видео через воды в синхронизированной по времени способом, и алгоритм отслеживания изображения для измерения положения тела и осанку. В качестве экспериментального препарата, ВЭФ предлагает важное преимущество для исследования активных сенсорных наведением поведения, демонстрируя легко количественно скорость EOD, что равняется к активному частотой дискретизации electrosensory. Сочетание этих методов может позволить точное и надежное долгосрочное наблюдение 8 спонтанных поведения от безудержного ВЭФ. Кроме того, большинство из нашей установке могут быть построены FRом широко доступны строительные материалы и легко получаемые электронные компоненты. Методы, описанные здесь были разработаны и прошли проверку на соответствие наши экспериментальные требования в течение последних лет. Поэтому мы рекомендуем эти методы для будущих исследований спонтанных разведочных поведения от свободное плавание ВЭФ.
Изоляция камеры. Камера изоляция обеспечивает хорошо контролируемых экспериментальных условиях, блокируя внешние источники света, вибрации, звука и электрических помех с разной степенью эффективности. Спектакль блокировки света был протестирован путем размещения моторизованный камеру в темную камеру изоляции, и никакие внешние утечки света не наблюдалось с камеры после проверки всех мест с помощью пульта дистанционного управления панорамированием. Гашения вибрации поверхность устанавливается под бак условии ослабления от внешних вибраций, направляемых от пола и укладки нескольких резиновых и пены слоев была эффективна для блокирования наиболеевнешние события вибрации. Тем не менее, периодические события вибрации, как громко закрывания двери в близлежащих районах сделал вызвать новизны ответов в редких случаях. Хотя таблица антивибрационные воздуха может обеспечивает превосходную производительность изоляции от фоновых колебаний, было бы слишком дорого, чтобы купить воздушный стол, достаточно большой для нашей баком аквариума. Таким образом, мы поместили гидрофонный под водой, чтобы обнаружить, включают события, когда крупные внешние вибрации, запускаемые новизны ответов. Для дальнейшего минимизировать влияние шума за пределами лаборатории, проводились наши эксперименты в часы-пик (после 6 вечера). Точно так же, внешний воздухе акустический шум ослаблялась через изоляция стенок камеры, наполненные стекловолокна Сланцы изоляции. Хотя мы не объективно количественной оценки функционирования затухания звука, большую часть фонового звука в лабораторной среде не могут возникнуть новизны ответов. В редких случаях, вдруг громкий звук от внешнего триггераред новинка ответ, но такое событие было обнаружено записи гидрофонов, и они редко произошло во время часов-пик. Аквариум бак условии достаточно большой площади для наших животных свободно плавать и исследовать. Размер бак был выбран в пропорции к длине видов мы использовали (до 30 см), но размер бака может быть уменьшено, если были использованы более мелкие животные. Мы выбрали Gymnotus зр. у разных видов импульсов типа для их больших размеров черепа, чтобы облегчить электрофизиологические записи в свободное плавание 36. Электрическая качество записи может улучшить с помощью более дорогостоящих медных сеток и защитных вытяжной вентилятор, используемый для контроля влажности.
Методика измерений ПС. Наша техника съемки ПС многоканальный разрешается точное и надежное измерение ПС синхронизации от свободно плавающих рыб. Используя наш метод, все импульсы EOD генерируемые свободно плавающих ВЭФ были обнаружены, не пропуская или добавление грехGLE импульса для продолжительности долгого записи шестичасовой (см. рисунок 12 в июне и др.. 8). В EOD записи меры не только скорость ПС, но и уровень активности с момента изменения пиковых амплитуд EOD записанные на внешних электродов. Записанные амплитуды EOD определяются относительной геометрии между животным и записывающих электродов, тем самым перемещения животных вызывают изменения в амплитудах EOD (фиг. 2F). Уровень активности была вычислена по изменчивости (RMS) амплитуды склоне EOD в скользящем окне (0,5 сек). Используя этот метод, видеозапись не будет необходимости для измерения уровня активности в течение длительного периода времени, и только запись ПС может быть достаточно. Вместо того чтобы использовать видеозапись, положение тела и позы ВЭФ может быть выведено из одних только записи EOD на основе мест электродов, геометрия танк, и теоретическая модель текущего диполя. Используя аналогичный recordiНастройка нг, Июнь др.. 20 предлагается в режиме реального времени метод электрического отслеживания для отслеживания нескольких WEFs в присутствии объекта, который сравнивает измеренные интенсивности сигнала на нескольких записи пар электродов с записей в таблице подстановки, содержащих предсказанные интенсивности сигнала при известных нынешних местах дипольных. Электрическая метод отслеживания предлагает повышенную надежность отслеживания в визуально суматоху среде, где животные часто получают закрыты программной панелью, или во время отслеживания нескольких животных. Натуралистические обитания ВЭФ содержат много визуальных препятствий, таких как водные растения и корни, где электрическое метод отслеживания могли бы обеспечить более надежную отслеживание с более простыми требованиями к установке, чем визуального слежения. В принципе, наш метод непосредственно применим к видам ВЭФ волна типа после изменения постоянных времени фильтра. Шаг устранение представит два режима за EOD цикла, так как сигнал ПС примерно синусоидальной видов волна типа. В этом случае, Мгновенная скорость ПС можно определить, пропуская через раз маркеры EOD игнорировать негативное фазу УВБ. ВЭФ может обнаружить записи электроды, когда они плавают недалеко от него, таким образом, мы избежали использования больших или металлических электродов, которые могут быть зондирования с большего расстояния 37, а вместо этого использовать тонкие графитовые электроды (диаметр 2 мм). Более тонкие коаксиальные кабели (RG-174) были использованы с электродными узлами, в гибкости, но более толстые коаксиальные кабели (RG-54) были использованы для подключения на большие расстояния для превосходной электрической защиты. Большая продолжительность записи ПС может быть достигнуто за счет снижения частоты дискретизации, но по более низкой временным разрешением в качестве компромисса. Среднее значение и изменчивость скорости EOD зависит от вида, таким образом временное окно для выравнивания мгновенную скорость EOD должна быть скорректирована соответствующим образом. Короче временное окно рекомендуется для видов, имеющих более короткую среднюю и меньшую изменчивость в АПИ (например Gymnotiforms), и более длительный период времени Windoж рекомендуется для видов, имеющих длительный среднее и высшее изменчивость в АПИ (например Mormyrids).
Освещение и настройки камеры. Видеозаписи обеспечить количественные и качественные поведенческие наблюдения, и здесь мы описали процедуры настройки, записи и обработки данных изображения. Установка Освещение играет важную роль в производстве высококачественные изображения, и свет угол проецирования является важным фактором для работы с изображениями подводных животных. Под неоптимальных условиях освещения, поверхность воды могут образовывать блики и отражения, которые могут создавать помехи работе отслеживания изображения, особенно когда животные генерировать поверхностные волны. Блики и отражения проблемы могут быть устранены путем проецирования источники света от нижней части бака. Для небольшого резервуара, массивы светодиодов могут быть размещены непосредственно под баком и блеск через диффузор панели, чтобы генерировать однородную интенсивность света 38. Аналогично для большего резервуара, источник света споместить ниже бака, и равномерной интенсивности света может быть достигнуто путем обеспечивают достаточное расстояние для света диффундировать 39. В нашей ситуации мы были вынуждены проецировать свет сверху резервуара из-за недостатка места, структурной устойчивости и размещения нагревателя под баке. Мы избежали бликов и отражений проблемы с помощью непрямого освещения, так что источники света были спроектированы к потолку. Оказывая верхнюю часть камеры безликая и матовый белый, не размышления не были видны на поверхности воды. Для изображения вся центральная арена, широкоугольный объектив может быть установлен на камеру, но некоторые линзы (рыбий глаз) может привести к значительному искажению баррель. Искажение баррель может быть исправлена с помощью сетки лист калибровки под баком для измерения координаты в пикселях местах сетки просматриваемые в центре резервуара. Вместе с соответствующими местах сетки в сантиметрах, матрица преобразования могут быть вычислены для совместногодый правильный искажения баррель 40. Мы рекомендуем камеры высокого разрешения, если размер животного намного меньше, чем размер резервуара, так что достаточное количество пикселей может быть получен от животного, чтобы правильно измерить его положение тела.
Отслеживания изображения и синхронизация времени. Алгоритм отслеживания изображения, описанный здесь использует операции область интересов, (ROI) для быстрого измерения положения тела и осанку. Операция ROI уменьшает размер изображения, подлежащих обработке, и ограничивает диапазон отслеживания вблизи места животных от предыдущего кадра. Мы извлекли положение тела (срединный), используя вращение изображения и ограничительной рамки операции вместо обычной работе изображение Скелетизация, который иногда не производить четко определенный единый среднюю линию. Рамка животного отсчета был расположен в середине головы ограничительной рамки, что позволяет эгоцентрическую поведенческий анализ. Основным источником ошибки в изображении trackiнг было связано с оптическим эффектом проекции на широком угле. В идеале, вертикальные движения животного не должно влиять на измерение 2D позиции, но чем дальше от центральной оси визуализации, тем больше часть вертикальном измерении прогнозируется на камеру. Преломления у поверхности воды уменьшается оптический эффект проекции на 28% в нашей установке изображений (высота камеры = 1,8 м, глубина воды = 10 см, радиус бак = 75 см), а также худшее ошибка позиция была ± 1,4 см в циркуляре забор. Сроки между EOD и видеозаписей были синхронизированы с помощью инфракрасных импульсов LED для учета времени дрейфа между видео и дигитайзер часов сигнал, и разное время запуска записи. Ожидаемая неопределенность в синхронизации времени между видео и взрывоопасных предметов записи пропорционально интервала захвата кадра, например, 15 кадров в сек скорость захвата (кадров в секунду) рамка приведет к времени выравнивания неопределенности ± 33 мсек. Такая степень тимэ точность достаточна для отслеживания медленную скользящую рыбу, но высокоскоростная камера может потребоваться для отслеживания быстрее движется животных. Мы рекомендуем светлого интенсивности света с увеличенной частотой кадров, так как время экспозиции датчика обратно пропорциональна частоте кадров.
Будущая работа. Социальные взаимодействия между несколькими WEFs могут быть изучены путем отслеживания их сигналы EOD и местоположения тела, и система отслеживания необходимо правильно связать EOD с расположением и тем же лицом. В соответствии со способом локализации диполя описываемой июня др. 20. Используя аналогичные установки, места животных предполагаемые их сигналов EOD получил на нескольких электродов может быть согласована с визуального вывода отслеживания для правильной идентификации импульсов EOD от разных людей. Отслеживание Изображение нескольких животных может быть выполнена одного человека за один раз с помощью операции ROI. ROI может быть первоначально определены вокруг индивидуумаотслеживаться, и рентабельность инвестиций будет приложена в каждом кадре с обновленным положения тела. Другие рыбы будут исключены из изображений отслеживания анализа, когда он появляется за пределами ROI, и если появились внутри, изображения других рыб можно автоматически перемещать, проверив, касается ли его образ границу ROI. Иногда, два животных контактировать друг с другом и их изображения сливаются, и если да, то маску можно вручную обращается отделить изображение другого рыбы. Еще один интересный будущая работа является трехмерная отслеживания видео выявить последовательности замысловатые движения во время захвата добычи 22 или социальных взаимодействий. Maciver соавт. 22 используется две камеры для просмотра прямоугольную аквариум сверху и сбоку для реконструкции трехмерной модели тела. Однако этот подход не будет работать в нашем случае, так как есть перегородками, которые блокируют боковые виды и аквариум имеет гораздо большую ширину, чем глубины. Вместо этого, было бы больше AppliКабель для установки нескольких камер на потолке в другой точки зрения углов похожа на установку, используемой Hedrick 41. Для большей точности, преломляющая эффект представлен воды и косым углом камеры должны быть скорректированы путем калибровки изображения в трех измерениях. Наш визуальный метод отслеживания может быть применен для изучения электрический поток изображения на поверхности тела рыбы 42,43, когда рыба плавает неподалеку объект. Как изучены Хофманн и др. 26., Было бы интересно исследовать электрический поток изображения объекта в свободное плавание в зависимости от расстояния до объекта, формы, размера и материала. В конечном счете, наши методы в сочетании с нейронных записей от свободно плавающих рыб 44-46 может выявить новые идеи наблюдениями изменений в нервной деятельности и EOD скорости в то время как рыба участвует в разведке объекта или социальных взаимодействий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была щедро поддерживается естественным наукам и инженерным исследовательского совета Канады (NSERC) и Канадского института исследований в области здравоохранения (CIHR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aquarium Construction | |||
| Electrically shielded floor heater | ThermoSoft Corp., IL, USA | ThermoTile | www.thermosoft.com |
| Tempered glass panel | generic | 0.5 in thick, used for the aquarium construction | |
| Aquarium grade silicone | generic | ||
| Acrylic sheet | generic | 0.25 in thick, matte white | |
| Natural rubber sheet | generic | 0.25 in thick | |
| Servomotor | HTECHRCD Inc., Korea | HS-325HB, 180deg rotation | www.servocity.com |
| Servomotor arm mount | HITECHRCD Inc., Korea | 56362 Large Spline | www.servocity.com |
| Servomotor controller (6 channels) | Sparkfun | ROB-09664 | Micro Maestro 6-channel USB Servo Controller |
| Active USB extension cable | C2G | 38990 | 12 m USB 2.0 A Male to A Female 4-Port Active Extension Cable |
| Exhaust fan | Nutone | ILFK120 | www.homedepot.com |
| Vertical aquarium filter | Tetra, Germany | Whisper Internal Power Filter - 40i | |
| Crushed coral | Used to increase the pH of the tank water | ||
| EOD Recording Setup | |||
| Graphite Electrodes | Staedtler, Germany | Mars Carbon 2-mm type HB | Shave the outer coating |
| Physiological Amplifier/Filter | Intronix, Canada | 2015F | |
| Coaxial Cable | generic | RG174 | For electrodes assembly |
| Coaxial Cable | generic | RG54 | For wiring use |
| BNC jack connector for RG-174 | Amphenol Connex | 112160 | For electrodes assembly |
| BNC plug connector for RG-54 | Amphenol Connex | 112116 | For wiring use |
| Signal digitizer hardware | Cambridge Electronic Design, UK | Power MKII 1401 | |
| Signal digitizer software | Cambridge Electronic Design, UK | Spike 2. ver 7 | |
| Visual Tracking Setup | |||
| White LED light | IKEA, Sweden | DIODER 201.194.18 | www.ikea.com |
| Infrared LED light (850 nm) | Scene Electronics, China | S8100-60-B/C-IR | Remove built-in fan |
| USB webcam | Logitech Inc., CA, USA | C910 | Remove Infrared blocking filter |
| Motorized camera | Logitech Inc., CA, USA | Quickcam Orbit | Remove Infrared blocking filter |
| Video recording software | Logitech Inc., CA, USA | Logitech Quickcam Software | Download from www.logitech.com |
| MATLAB | Mathworks, MA, USA | 2012a | Image processing toolbox |
References
- Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat. Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., De Lecea, L. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature. 450 (7168), 420-424 (2007).
- Naumann, E. A., Kampff, A. R., Prober, D. A., Schier, A. F., Engert, F. Monitoring neural activity with bioluminescence during natural behavior. Nat. Neurosci. 13 (4), 513-520 (2010).
- Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8 (2), 147-152 (2011).
- Mavoori, J., Millard, B., Longnion, J., Daniel, T., Diorio, C. A miniature implantable computer for functional electrical stimulation and recording of neuromuscular activity. In IEEE international workshop on biomedical circuits and systems (BioCAS) 2004; Session: Functional Electrical Stimulators and Related Sensing Techniques. , (2004).
- Harrison, R. R., Fotowat, H., Chan, R., Kier, R. J., Olberg, R., Leonardo, A., Gabbiani, F. Wireless neural/EMG telemetry systems for small freely moving animals. IEEE TBioCAS. 5 (2), 103-111 (2011).
- Jun, J. J., Longtin, A., Maler, L. Precision measurement of electric organ discharge timing from freely moving weakly electric fish. J. Neurophys. 107 (7), 1996-2007 (2012).
- Forlim, C. G., Pinto, R. D. Noninvasive Realistic Stimulation/Recording of Freely Swimming Weakly Electric Fish: Movement Detection and Discharge Entropy to Infer Fish Behavior. , (2012).
- Caputi, A. A., Aguilera, P. A., Castelló, M. E. Probability and amplitude of novelty responses as a function of the change in contrast of the reafferent image in G. carapo. J. Exp. Biol. 206 (6), 999-1010 (2003).
- Pluta, S. R., Kawasaki, M. Multisensory enhancement of electromotor responses to a single moving object. J. Exp. Biol. 211 (18), 2919-2930 (2008).
- Heiligenberg, W. Electrolocation and jamming avoidance in a Hypopygus (Rhamphichthyidae, Gymnotoidei), an electric fish with pulse-type discharges. J. Comp. Phys. A. 91 (3), 223-240 (1974).
- Capurro, A., Malta, C. P. Noise autocorrelation and jamming avoidance performance in pulse type electric fish. Bull. Math. Biol. 66 (4), 885-905 (2004).
- Post, N., von der Emde, G. The "novelty response" in an electric fish: response properties and habituation. Phys. Behav. 68 (1), 115-128 (1999).
- Toerring, M. J., Serrier, J. Influence of water temperature on the electric organ discharge (EOD) of the weakly electric fish Marcusenius cyprinoides (Mormyridae). J. Exp. Biol. 74 (1), 133-150 (1978).
- Ardanaz, J. L., Silva, A., Macadar, O. Temperature sensitivity of the electric organ discharge waveform in Gymnotus carapo. J. Comp. Phys. A. 187 (11), 853-864 (2001).
- Rodríguez-Cattaneo, A., Pereira, A. C., Aguilera, P. A., Crampton, W. G., Caputi, A. A. Species-specific diversity of a fixed motor pattern: the electric organ discharge of Gymnotus. PLoS One. 3 (5), (2008).
- Bennett, M. V. L. Fish physiology. Hoar, W. S., Randall, D. J. , Academic Press. NY. 493-574 (1971).
- Wong, C. J. Afferent and efferent connections of the diencephalic prepacemaker nucleus in the weakly electric fish, Eigenmannia virescens: interactions between the electromotor system and the neuroendocrine axis. J. Comp. Neurol. 383 (1), 18-41 (1997).
- Jun, J. J., Longtin, A., Maler, L. Real-time localization of moving dipole sources for tracking multiple free-swimming weakly electric fish. PLoS One. 8 (6), (2013).
- Rasnow, B., Assad, C., Hartmann, M. J., Bower, J. M. Applications of multimedia computers and video mixing to neuroethology. J. Neuro. Methods. 76 (1), 83-91 (1997).
- MacIver, M. A., Nelson, M. E. Body modeling and model-based tracking for neuroethology. J. Neuro. Methods. 95 (2), 133-143 (2000).
- Douglas, R. H., Hawryshyn, C. W. Behavioral studies of fish vision: an analysis of visual capabilities. In The Visual System of Fish. Douglas, R., Djamgoz, M. , Chapman & Hall. London. 373-418 (1990).
- Ciali, S., Gordon, J., Moller, P. Spectral sensitivity of the weakly discharging electric fish Gnathonemus petersi using its electric organ discharges as the response measure. J. Fish Biol. 50 (5), 1074-1087 (1997).
- Ratledge, D. An Introduction to Webcam Imaging. Digital Astrophotography: The State of the Art. , 31-44 (2005).
- Hofmann, V., Sanguinetti-Scheck, J. I., Gómez-Sena, L., Engelmann, J. From static electric images to electric flow: Towards dynamic perceptual cues in active electroreception. J. Phys. Paris. 107, 95-106 (2013).
- Castelló, M. E., Aguilera, P. A., Trujillo-Cenóz, O., Caputi, A. A. Electroreception in Gymnotus carapo: pre-receptor processing and the distribution of electroreceptor types. J. Exp. Biol. 203 (21), 3279-3287 (2000).
- Caputi, A. A., Castelló, M. E., Aguilera, P., Trujillo-Cenóz, O. Electrolocation and electrocommunication in pulse gymnotids: signal carriers, pre-receptor mechanisms and the electrosensory mosaic. J. Phys. 96 (5), 493-505 (2002).
- Pusch, R., et al. Active sensing in a mormyrid fish: electric images and peripheral modifications of the signal carrier. J. Exp. Biol. 211 (6), 921-934 (2008).
- Harder, W. Die beziehungen zwischen elektrorezeptoren, elektrischem organ, seitenlinienorganen und nervensystem bei den Mormyridae (Teleostei, Pisces). Z. Vgl. Physiol. 59 (3), 272-318 (1968).
- Bacelo, J., Engelmann, J., Hollmann, M., Gvonder Emde,, Grant, K. Functional foveae in an electrosensory system. J. Comp. Neurol. 511 (3), 342-359 (2008).
- Hollmann, M., Engelmann, J., Von Der Emde, G. Distribution, density and morphology of electroreceptor organs in mormyrid weakly electric fish: anatomical investigations of a receptor mosaic. J. Zool. 276 (2), 1469-7998 (2008).
- Knudsen, E. I. Spatial aspects of electric fields generated by weakly electric fish. J. Comp. Phys. 99 (2), 103-118 (1975).
- Kramer, B. Spontaneous discharge rhythms and social signalling in the weakly electric fish Pollimyrus isidori (Cuvier et Valenciennes) (Mormyridae, Teleostei). Behav. Ecol. Sociobiol. 4 (1), 66-74 (1978).
- Stoddard, P. K., Markham, M. R., Salazar, V. L., Allee, S. Circadian rhythms in electric waveform structure and rate in the electric fish Brachyhypopomus pinnicaudatus. Physiol. Behav. 90 (1), 11-20 (2007).
- Canfield, J. G. Methods for chronic neural recording in the telencephalon of freely behaving fish. J. Neurosci. Methods. 133 (1-2), 127-134 (2004).
- Chen, L., House, J. L., Krahe, R., Nelson, M. E. Modeling signal and background components of electrosensory scenes. J. Comp. Physiol. A. 191 (4), 331-345 (2005).
- Emran, F., Rihel, J., Dowling, J. E. A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities. J. Vis. Exp. (20), (2008).
- Windsor, S. P., Tan, D., Montgomery, J. C. Swimming kinematics and hydrodynamic imaging in the blind Mexican cave fish (Astyanax fasciatus). J. Exp. Biol. 211 (18), 2950-2959 (2008).
- Shapiro, L. G., Stockman, G. C. Computer vision. , Prentice Hall. Upper Saddle River, NJ. 367-368 (2001).
- Hedrick, T. L. Software techniques for two- and three-dimensional kinematic measurements of biological and biomimetic systems. Bioinsp. Biomim. 3 (3), 034001 (2001).
- Babineau, D., Lewis, J. E., Longtin, A. Spatial acuity and prey detection in weakly electric fish. PLoS Comp. Biol. 3 (3), (2007).
- Sanguinetti-Scheck, J. I., Pedraja, E. F., Cilleruelo, E., Migliaro, A., Aguilera, P., Caputi, A. A., Budelli, R. Fish geometry and electric organ discharge determine functional organization of the electrosensory epithelium. PLoS One. 6 (11), (2011).
- Castello, M. E., Caputi, A., Trujillo‐Cenóz, O. Structural and functional aspects of the fast electrosensory pathway in the electrosensory lateral line lobe of the pulse fish Gymnotus carapo. J. Comp. Neurol. 401 (4), 549-563 (1998).
- Canfield, J. G., Mizumori, S. J. Y. Methods for chronic neural recording in the telencephalon of freely behaving fish. J. Neurosci. Methods. 133 (1), 127-134 (2004).
- Pereira, A. C., Centurión, V., Caputi, A. A. Contextual effects of small environments on the electric images of objects and their brain evoked responses in weakly electric fish. J. Exp. Biol. 208 (5), 961-972 (2005).
