Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Långsiktig Behavioral Spårning av fritt Simning Svagt Electric Fish

Published: March 6, 2014 doi: 10.3791/50962
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 2,3
1Department of Physics, University of Ottawa, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Ottawa, 3Centre for Neural Dynamics, University of Ottawa

Summary

Vi beskriver en uppsättning tekniker för att studera spontana beteende fritt simma svagt elektriska fiskar under en längre tid, genom att synkront mäta djurets elektrisk urladdning organ timing, kroppsställning och hållning både exakt och tillförlitligt i en specialdesignad akvarium tanken inne i en sensorisk isoleringskammare.

Abstract

Långsiktiga beteende spårning kan fånga och kvantifiera naturliga djurbeteenden, inklusive de som förekommer sällan. Beteenden såsom prospektering och sociala interaktioner kan bäst studeras genom att observera ohämmad, fritt beter djur. Svagt elektriska fiskar (WEF) display tydligt observer undersökande och sociala beteenden genom att släppa ut elorgel urladdning (EOD). Här beskriver vi tre effektiva tekniker för att synkront mäta EOD, kroppsposition, och hållning av en fritt simmande WEF under en utsträckt tidsperiod. Först beskriver vi byggandet av en experimentell tank inne i en isoleringskammare för att blockera externa källor av sensoriska stimuli som ljus, ljud och vibrationer. Akvariet delades för att rymma fyra provkroppar, och automatiska dörrar fjärrstyra djurens tillgång till den centrala arenan. För det andra, beskriver vi en exakt och tillförlitlig realtids EOD timing mätmetod från att fritt simma WEF. Signal snedvridningar orsakade av djurets kroppsrörelser korrigeras med rumslig medelvärdes och tidssteg bearbetning. För det tredje, beskriver vi en undervattens nära infraröd avbildning setup för att observera ostörda nattliga djurbeteenden. Infraröd ljuspulser användes för att synkronisera tiden mellan videon och den fysiologiska signalen under en lång inspelningstid. Vår automatiserad mjukvara mäter djurets kroppsställning och hållning tillförlitligt i en vattenscen. I kombination, dessa tekniker möjliggör långsiktig observation av spontana beteende fritt simma svagt elektriska fiskar på ett tillförlitligt och exakt sätt. Vi tror att vår metod kan tillämpas på samma sätt som studier av andra vattenlevande djur genom att relatera sina fysiologiska signaler med förberedande eller sociala beteenden.

Introduction

Bakgrund. Kvantitativa experiment på djurens beteende (t.ex. tvångs val, chock undvikande, T-labyrinten, osv.) Är vanligtvis används för att undersöka specifika hypoteser rörande sensorisk-motoriska färdigheter, inlärning och minnesbildning. Dessa restriktiva experiment missar mycket av den rikedom av naturliga djurs beteende och kommer sannolikt att leda till överförenklade modeller av den underliggande neurala grunden för beteende. Experiment under mer naturalistiska förhållanden är därför ett viktigt komplement som vi kan utforska mer fullständigt en art beteenderepertoar. Försök med fritt rörliga djur måste dock ta itu med unika tekniska utmaningar som rörelseutlöst inspelning artefakter. Till skillnad från stimulans framkallade svar, kan spontant förekommande undersökande beteende inte förutsägas, och därför försökspersoner måste ständigt övervakas och spåras under en längre tid. Specifika forskningsfrågor can bäst hanteras genom noggrant utvalda organismer och tillgängliga tekniska verktyg. Till exempel optisk inspelning och stimuleringstekniker såsom genetiskt kodade kalcium givare 1 och optogenetics 2 har med framgång tillämpats på fritt rörliga genetiska modellorganismer 3-5. Alternativt kan miniatyriserade neurala telemetrisystem registrera och stimulera fritt rörliga smådjur 6,7.

Elektrisk fisk. WEF arter genererar elektriska urladdningar organ (EODS), som tillåter dem att känna sin närmiljö eller att kommunicera över större avstånd. Tidsmässiga mönster EODS varierar under olika förhållanden såsom själv rörelser 8,9, sensoriska stimuli 10,11 och sociala interaktioner 12,13. Pulstyp WEF arter producerar ett tåg av diskreta pulser, i motsats till våg-typ species som genererar kontinuerliga kvasi-sinusformade vågformer. I allmänhet pulstyp arter uppvisar More rörlig EOD takt i förhållande till arten wave-typ, och djurens EOD avgifterna speglar tätt nyhet innehållet i deras sensoriska omgivning 10,14. Puls-typ arter kan omedelbart förkorta interpulsintervall (IPI) inom en enda puls cykel som svar på en ny sensorisk störning (nyhet svar 10,11,14). Den pågående elektriska beteendet hos dessa fiskar kan störas av okontrollerade sensoriska stimuli från externa källor, och olika typer av stimuli som t.ex. vibrationer, ljud, elektricitet, och ljus är kända trigger nyhet svar. Därför måste speciella försiktighetsåtgärder vidtas för att blockera eller dämpa yttre sensoriska stimuli under en långvarig observation av frisimmande WEF. På detta sätt kan förändringar i EOD takt och rörelsebanor specifikt hänföras till stimuli som presenteras av försöksledaren.

Akvarium tank och isoleringskammaren. Vi placerade därför flera lager av vibrationsdämpande material under ett stort akvarium tank (2,1 mx 2,1 mx 0,3 m), och omges tanken med ett isolerat hölje för att blockera externa ljuskällor, elektriskt brus, ljud-och värmeflöde. EOD räntan beror på den omgivande temperaturen 15,16, alltså vattentemperaturen var hårt reglerad i ett tropiskt område (25 ± 1 ° C) för Sydamerikanskt WEF arter. Vi konstruerade en stor och grund (10 cm vattendjup) tank för att observera rumsliga undersökande beteenden av WEF huvudsakligen bundna i två dimensioner (Figur 1A). Tanken delades in i en central arena för att observera rumsliga beteenden, och fyra hörnfack till sig hysa fiskar (Figur 1B). Varje fack byggdes vattentätt för att förhindra elektrisk kommunikation mellan individer. Djur tillgång till den centrala arenan styrdes från utsidan med fyra motoriserade grindar. Grindarna placerades mellan facken, och de blev vattentäta när de låstmed nylonvingmuttrar. Inga metalldelar användes under vatten sedan WEF känsliga för metaller.

EOD inspelning. EODS genereras på ett stereotypt sätt genom aktivering av enstaka (i Mormyrids) eller flera rumsligt fördelade elektriska organ (i Gymnotiforms) 17,18. Temporal modulationer i EOD kurs kan avslöja neurala aktiviteter på högre nivå, eftersom märg pacemaker får direkt neurala input från högre hjärnregioner som diencephalic prepacemaker kärnan, som i sin tur tar emot axonal prognoser från framhjärnan 19. Dock måste EOD timing noggrant heras från en rå inspelning vågform och inte påverkade av djurets rörelse snedvridningar. Det elektriska fältet som genereras av en WEF kan approximeras som en dipol, alltså EOD pulsamplituder vid registreringselektroderna beror på de relativa avstånd och orienteringar mellan djuret och elektrod 8,20. Animal själv movement ändra den relativa geometrin mellan djuret och elektroderna och på så sätt rörelser orsaka EOD amplituder vid olika elektroderna för att variera över tiden i ett flyktigt sätt (se Figur 2B i juni et al. 8). Dessutom själv rörelser förändras också formen på inspelade EOD vågformer, eftersom de relativa bidragen från olika uppsättningar av de elektriska organen beroende av sina platser längs kroppslängden och deras lokala krök införts av svans böjning. Den rörelse-inducerad snedvridningar i EOD amplituder och former kan leda till felaktiga och otillförlitliga mätningar EOD timing. Vi har övervunnit dessa problem genom att rumsligt medelvärdes flera EOD vågformer inspelade på olika platser, och genom att lägga ett kuvert utvinning filter för att exakt bestämma EOD timing från en frisimmande WEF. Dessutom vår teknik mäter också de EOD amplituder, som indikerar huruvida ett djur ska vila eller aktivt flytta baserat på förändringen av EODamplituder över tiden (se figur 2E och 2F). Vi spelade in differentiellt förstärkta signaler från inspelningen elektrodparen för att minska common mode-brus. Eftersom EOD pulser genereras med oregelbundna tidsintervall, EOD händelse tidsserier ha en variabel samplingshastighet. Den EOD tidsserier kan omvandlas till en konstant samplingsfrekvens genom interpolation om det krävs av ett analytiskt verktyg för val.

Videoinspelning. Även EOD inspelning kan övervaka en grov rörelse aktiviteten hos ett djur, tillåter videoinspelning direkta mätningar av ett djurs kroppsställning och hållning. Nära infraröda (NIR) ljus (λ = 800 ~ 900 nm) medger oberörd visuell observation av fritt simmande fiskar 21,22, eftersom WEFs är mest aktiva i mörker och deras ögon är inte känsliga för NIR-spektrum 23,24. De flesta digitala bildsensorer (t.ex. CMOS eller CCD) kan fånga NIR-spektrum med wavelength intervallet mellan 800 till 900 nm, efter avlägsnande av en infraröd (IR) spärrfilter 25. Vissa avancerade konsument-grade webbkameror erbjuder HD-, bred betraktningsvinkel och bra låg-ljuskänslighet, vilket kan ge en bildkvalitet som är jämförbar med, eller bättre än proffs IR-kameror som finns på mycket högre kostnader. Dessutom är vissa konsument-grade webbkameror levereras med inspelning mjukvara som tillåter en utökad inspelningstiden genom att komprimera video utan kvalitetsförlust. De flesta proffskameror erbjuder tidssynkronisering TTL pulsutgångar eller utlösa TTL pulsingångar 26 för inriktning timing mellan video med de digitaliserade signaler, men denna funktion är i allmänhet frånvarande i konsument-grade webbkameror. Däremot kan tidpunkten mellan en videoinspelning och en signal digitizer exakt motsvaras av samtidigt fånga ett periodiskt blinkande IR-LED med kameran och signal digitizer. Den ursprungliga och den slutliga IR puls timing kan användas ens två tidskalibreringsmarkörer för konvertering av video ramnummer till signal digitizer tidsenhet och vice versa.

Belysning & bakgrund. Bild fånga genom vatten kan vara tekniskt utmanande på grund av ljusreflexer vid vattenytan. Vattenytan kan fungera som en spegel för att reflektera en visuella scenen ovanför vattenytan, och dunkla visuella funktioner under vattnet, alltså scenen ovanför vattenytan skall smältas odefinierbar att förhindra visuell interferens. För att bilden hela akvariet, behöver en kamera som placeras direkt ovanför vattnet, och det ska vara dolt bakom taket över en liten visning hål för att förhindra dess reflektion på vattenytan. Dessutom kan vattenytan producera bligar och olikformig belysning om ljuskällor är felaktigt projiceras. Indirekt belysning kan uppnå en jämn ljusstyrka över hela akvariet genom att rikta ljuskällorna mot taket, så att taket och den omgivande walls kan reflektera och sprida ljusstrålarna innan det når vattenytan. Välj en IR-strålkastare som matchar spektrala känslighet på kameran (t.ex. 850 nm topp våglängd). Elektriska störningar från ljuskällorna kan minimeras genom att använda LED-lampor och placera sina DC nätaggregat utanför Faradays bur. Placera en vit bakgrund under tanken, eftersom fisk kontrast bra i en vit bakgrund på NIR-våglängder. På liknande sätt, användning av matt vit färg på de inre ytorna av isoleringskammaren ger jämn och ljus bakgrundsbelysning.

Video spårning. Efter en videoinspelning, kan en automatisk bild spårning algoritm mäter djurets kroppspositioner och ställningar över tid. Spårningen video kan automatiskt utföras av antingen färdiga att använda programvara (Viewpoint eller Ethovision) eller programmerbar programvara (OpenCV eller MATLAB Bildbehandling verktygslåda). Som ett första steg i bild-spårning,ett giltigt spårning område måste definieras genom att rita en geometrisk form för att utesluta området utanför (maskerings operation). Därefter behöver ett djurs bild för att vara isolerade från bakgrunden genom att subtrahera en bakgrundsbild från en bild innehållande djuret. Den subtraherade bilden omvandlas till ett binärt format genom att applicera en intensitet tröskel, så att tyngdpunkten och orienteringsaxeln kan beräknas från binära morfologiska operationer. I Gymnotiforms 27-29 och Mormyrids 30-32 är electroreceptor densitet högsta nära huvudet regionen, alltså huvudpositionen i varje ögonblick indikerar en placering av den högsta sensorisk skärpa. Huvud och svans platser kan automatiskt bestäms genom tillämpning av bildrotation och bounding-box verksamhet. Huvud och svans ändarna skulle kunna särskiljas från varandra genom att manuellt definiera dem i den första ramen, och genom att hålla reda på sina platser från att jämföra två på varandra följande ramar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Detta förfarande uppfyller kraven i universitetet i Ottawa Djurvård kommittén. Inget jäv deklareras. Se tabellen för Material och reagens för de märken och modeller av den utrustning och material som anges nedan. Anpassad skriftliga Spike2 och MATLAB-skript, och exempeldata finns i Supple fil.

1. Akvarium tank och isolering Chamber Setup

  1. Anti-v ibration golvet. Konstruera en anti-vibrationsytan (2,1 mx 2,1 m) genom att stapla gummikuddar, akustisk frigolit, marin plywood panel, och polyuretanskum kuddar från botten till toppen (Figur 1A). Lägg fyra träreglar (5 cm x 10 cm) på plywoodpanelen för att stödja kanterna på akvariet.
  2. Golvvärmare. Lägg ett elektriskt skärmad värmeelement över termiskt graderad stoppning (se figur 1D botten). Täck värmeelementet med en metalllic mesh för elektrisk skärmning.
  3. Spatial tanken. Konstruera ett brett och grunt akvarium tank (1,8 mx 1,8 mx 30 cm) med 1,3 cm tjockt härdat glas paneler, L-formad aluminiumram och akvarium silikon (se figur 1 A). Täck undersidan av tanken med ett stort ark med vit bakgrund för att ge hög avbildning kontrast (se protokoll 3).
  4. Dela upp akvariet i en central arena (1,5 mi diameter) och fyra hörnfack (se figur 1B) genom att installera väggar (22,5 cm hög) gjorda av akrylskivor (matt vit, 0,64 cm tjock).
    1. Böj fyra akrylskivor (22,5 cm x 102,7 cm) genom att tillämpa värme för att skapa fyra krökta väggsektioner och ansluta dem till tankens botten med hjälp av silikon täta att separera den centrala arenan från de fyra hörnfack. Lämna 20 cm utrymme mellan de böjda sektionerna för grinden installationen.
    2. Separata angränsande hörnfack genom att installera fyra dubbla väggar with 15 cm mellanrum, som ger extra elektrisk isolering och platser för undervattenssensorer såsom en hydrofon.
  5. Montera fyra motoriserade grindar, och installera dem mellan hörnfack och den centrala arenan.
    1. Montera fyra dörrkarmar som visas i figur 1C. Skapa sex brunnar (0,64 cm djup) på varje dörrkarm, bädda nylonkupolmuttrar (0,64 cm tråd diameter) och fäst dem med epoxy.
    2. Skär fyra dörrpaneler från akryl-och gummibaserade tätskikt, och skapa sex hål (0,64 cm diameter) på akryl och paneler gummi för låsmekanismen. Gå med i akryl och paneler gummi med silikon fogtätning.
    3. Installera akryl gångjärn för att ansluta dörrpanelerna med dörrkarmar.
    4. Montera svängande armar på servomotorer, och installera dem på toppen av dörrkarmar (se figur 1C). Gör loopar med buntband för att koppla de svängande armarna till dörrpanelerna.
    5. Placera grind församlingar på gaps skapas mellan de böjda väggsektionerna, och fäst dem med silikon fogtätning.
    6. Anslut alla servomotorer till en servo controller, och anslut den till en strömkälla och en dator via en aktiv USB-förlängningskabel. Testa portarna med hjälp av styrprogram medföljer servo controller.
    7. Efter silikon härdar, kontrollera vattentäthet genom att låsa alla grindar med nylonskruvar och fylla ett fack i taget.
  6. Isolering kammaren. Konstruera en isoleringskammare för att omge akvariet och blockera externa källor av ljus, ljud och elektriskt brus (se fig. 1D).
    1. Gör tre väggpaneler (2 mx 2 mx 5 cm) och fyra dörrpaneler (1,9 mx 0,95 mx 5 cm). För varje panel, gå med aluminiumlister (5 cm x 2,5 cm) för att skapa en rektangulär ram, och nit en vit korrugerad plast panel på aluminiumramen. Fyll akustiska glasfiber Batts i panelerna, och nära med en svart korrugerad plast panel.
    2. Montera tre väggpaneler på anti-vibrationsgolvet, och installera piano gångjärn för att ansluta sig till de fyra dörrpaneler på väggpaneler.
    3. Omge isoleringskammaren med aluminium maskor, och jord maskor på alla sidor för att skapa en Faradays bur.
  7. Fuktreglering. Installera en lågbullrande frånluftsfläkt (Figur 1F överst) för att ta bort överflödig fukt byggs upp från uppvärmning. Placera fläkten på minst 2 m från inspelningsplatsen, och installera en luftkanal mellan isoleringskammaren och frånluftsfläkt.
  8. Rutinmässigt övervaka och upprätthålla villkoren i tank vatten och djur.
    1. Behåll konstant vattenförhållanden vid 10 cm djup, 100 ^ S / cm ledningsförmåga och pH 7,0 genom tillsats av vatten eller salt stamlösning (se Knudsen 33 för receptet). Lägg en påse med krossad korall om pH sjunker under 6,5.
    2. Montera vertikala akvariefilter som kan arbeta från grunt vatten för rengöring ochluftningsändamål (Figur 1F botten). Koppla bort filtren och ta dem ur den centrala arenan under inspelningen.
    3. Leverera direktmjölmask på botten av tanken genom att fästa dem på sugkoppar med resårer. Undvik fritt flytande bytesdjur såsom blackworms att förhindra okontrollerad utfodring av herrelösa bytesdjur under inspelning.

2. EOD Spårning

  1. Elektroder installation. Montera åtta grafitelektroder och utrymme dem jämnt på den böjda väggen i den centrala arenan.
    1. Skaffa dra ledningarna (15 cm i längd, Mars Carbon 2 mm typ HB) och raka av det yttersta skiktet av ledningarna.
    2. Skär åtta 10 cm segment av koaxialkabel (RG-174), vira kabelkärnan runt ena änden av grafitstavarna, och tillämpa krympslang över dem för stark och stabil elektrisk anslutning. Anslut BNC jack-kontakter på motsatta ändar (figur 2A vänster). </ Li>
    3. Placera elektroderna på väggen genom att tejpa, och tillämpa tunna remsor av maskeringstejp på elektrodytorna för att skydda från silikon. Applicera silikon fogtätning att permanent hålla elektroderna, och ta bort all tejp innan silikon hårdnar (Figur 2A höger).
  2. Bygga åtta kablage genom att mäta avståndet från varje elektrod till förstärkaren enheten, och skära koaxialkablar (RG-54) i längder. Anslut BNC-kontaktdon i båda ändarna av kablarna.
  3. Använd kablage för att koppla alla elektroder till förstärkaren enheten. Differentiellt förstärka genom att para ihop två 90 ° orienterade elektroder (se figur 2B), och jord alla koaxiala skärmtrådar genom att ansluta dem till Faradays bur.
  4. Ställ in förstärkarens förstärkning under den signal mättnadsgränsen, och applicera ett bandpassfilter (200 Hz-5 kHz) för att ta bort brus. Digitalisera de fyra inspelningselektrodparen vid 40 kS / sek.
  5. Onlinesignalbehandling. Instruktionerna är skrivna för Spike2 programvaran, och parameterinställningar är optimerade för Gymnotus sp. (Se figur 2C för sammanfattning).
    1. Lägg till en DC avlägsna process (τ = 0,1 sek) till alla inspelningskanaler.
    2. Lägg till nya rectify process till alla inspelningar kanaler.
    3. Skapa en virtuell kanal genom att summera alla fyra inspelningskanaler.
    4. Utdrag en unimodal kuvert per EOD puls genom att lägga till en RMS (root-mean-squared, ) Process (τ = 0,25 ms) till den virtuella kanalen, för alstring av en enda topp per EOD cykel för att otvetydigt fastställa den pulstidsinställning.
    5. Skapa en realmark kanal från den virtuella kanalen och registrera den tid och värdena för de högsta amplituderna, efter att en lämplig tröskel för att fånga alla EOD pulser wiDC-layout saknas en puls, och samtidigt undvika falska positiva.
    6. Övervaka den momentana EOD hastigheten i realtid genom att ställa in kanalvisning alternativ på realmark kanal till en momentan frekvensläge.
    7. Övervaka fiskrörelser i realtid genom att duplicera realmark kanalen, och ställ in alternativet display till en läge vågform.
    8. Kvantifiera en aktivitetsnivå från RMS i EOD amplitud lutningen genom att skapa en virtuell kanal från realmark kanalen (0,01 sek samplingsperiod), och till lutning (τ = 0,25 ms) och RMS (τ = 0,5 ms) processer.
    9. Exportera realmark kanalen i Spike2 programvaran till MATLAB-format.

3. Synkroniserad video Spårning

  1. Skapa en bakgrundsscen.
    1. Göm alla föremål som kastar en reflektion på vattenytan genom att täcka med matt vit bänkskiva film.
    2. Installera en matt vitkorrugerade plastpanel 15 cm under taket för att dölja kameran och luftventilen.
    3. Skriv ut rutnät mönster på ett stort vitt papper för att kalibrera en kamera, och lägg den under tanken för att ge en hög kontrast bakgrund.
  2. Installera ljuskällor.
    1. Skaffa IR-LED-lampor och ta bort inbyggda fläktar för att minska buller. Kör lysdioden med en strömreglerad likströmskälla placerad utanför Faradays bur.
    2. Installera IR-LED-lampor för avbildning i mörker, och vita LED-lampor för att driva en dygns ljus cykel i testet fisk. Direkta alla ljuskällor mot taket för att uppnå indirekt och enhetlig belysning (figur 3A).
    3. Reglera dygnsljuscykeln genom att köra den vita LED-lampor med en tidsstyrd brytare (t.ex. 12 tim on/12 tim av).
  3. Installera en kamera direkt ovanför akvariet.
    1. Skaffa en NIR-känslig kamera, eller ta bort en IR-blockerande filter genom att bryta en tunn skiva av färgat glas på baksidan av linsaggregatet. Se till att betraktningsvinkeln är tillräckligt bred för att bilden hela centrala arenan.
    2. Gör en liten visning hål i mitten av takpanelen, och placera kameran direkt ovanför hålet.
    3. Installera en vit ring vakt runt objektivet, om ljuskällorna genererar bligar.
  4. Gör en tidssynkroniserade videoinspelning.
    1. Placera en IR-LED på en av de fyra tank hörn för att generera tidssynkroniseringspulser (1 ms varaktighet, 10 sek period). Lägg ett belastningsbegränsande motstånd (1 kQ) i serie, och driva IR LED från en digital utgång av digitaliseraren hårdvara.
    2. Använd programvara videoinspelning medföljer kameran om det finns. Välj den högsta inspelningskvalitet (t.ex. förlustfri komprimering) och de högsta upplösningar som stöds.
    3. Starta videoinspelning omedelbart innan EOD inspelningen, och stoppa videoinspelning omedelbartbart efter EOD inspelningen.
    4. Efter inspelningen, konvertera bild ramnummer till digitaliseraren tidsenhet genom linjär interpolering mellan de första och de sista ljuspulser fångas av signaldigitaliserare och den videoinspelning.
  5. Automatisk bildspårning
    Instruktionerna är skrivna för MATLAB Bildbehandling verktygslåda, och utnyttja dess funktioner. En anpassad MATLAB-skript är försedd med denna ansökan för automatiserad spårning.
    1. Importera video. Importera en videoinspelning fil direkt till MATLAB arbetsytan med hjälp av "Videoreader. Läs"-funktion.
    2. Skapa en sammansatt bakgrundsbilden genom att kombinera två bildramar. Byt ut bildområde som upptas av ett djur med en icke upptagen bild av samma region från en annan ram (se figur 3B).
    3. Ange en bild regionen att spåra genom att rita en cirkulär mask runt den centrala arenan för att utesluta enrea utanför (Figur 3B botten), och multiplicera med en konstant (r int) för att fastställa en lägsta tröskel för intensitetsskillnaden. Till exempel ställer kriv = 0,85 kommer att undertrycka intensitetsvariationer 15% = (1 - r int) nedan bakgrunden.
    4. Bild subtraktion. Subtrahera en bildram (= IM k) från bakgrundsbilden (= IM 0) för erhållande av differensbilden (= ΔIM k). Använd heltal utan tecken numerisk precision för att lagra bildintensitetsvärden som icke-negativa heltal.
    5. Segment differensbilden genom att applicera en intensitetströskeln bestämdes från graythresh funktion. Rengör den binära bilden med bwmorph funktionen och välj den största fläcken motsvarar ett djur efter att beräkna alla blob områden med hjälp av regionprops funktionen.
    6. Bestäm tyngd och stora orienterings enXis för den största fläcken genom att tillämpa den regionprops funktion och rotera bilden så att huvudaxeln med x-axeln. Dela upp bilden till huvud-och stjärtdelar vid tyngd (Figur 3D överst).
    7. Bestäm huvudaxeln hos huvuddelen, och rotera hela bilden för att anpassa med x-axeln (figur 3D nederst till vänster). Montera begränsnings-boxar runt huvud och svans delar parallellt med sina huvudaxlar med hjälp av regionprops funktionen.
    8. Bestäm medianen y-koordinater för klump till vänster, mitten och höger vertikala kanterna av markeringsramarna (gröna prickar i figur 3D botten), och tilldela dem till fem funktionspunkter (huvud-tip, mid-head, mid-body , mid-svans, svansspetsen).
    9. Behandla varandra följande ramar efter att beskära en bild ram centrerad på djurets tyngd bestäms från sin tidigare ram.
    10. Tilldela manuellt huvudet orienteringen för den första bilden, och använda en punktprodukt betwesv orienterings vektorer från två på varandra följande ramar för att automatiskt bestämma huvudinriktning. Inspektera resultatet, och vända på huvudet orientering manuellt om felaktigt tilldelade.
  6. Rita ett djur bana genom att gå med huvudet-tips, och smidig med hjälp av median-och genomsnittsfilter (n = 3) om den har en skakis utseende. Lagra banan med en bakgrundsbild, och interpolera fisk midlines hjälp av fem funktionspunkter (se figur 2E).
  7. Beräkna den genomsnittliga EOD takt varje bildfångst tid genom omsampling den momentana EOD frekvens (100 Hz samplingsfrekvens) och i genomsnitt (0,0625 sek tidsfönster). Rita banan i pseudofärger bestäms från gång-matchade EOD takt, och lägga på med en bakgrundsbild (se figur 2F).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

EOD spårningsresultat

De inspelade EOD vågformer från olika elektrodparen varierade i amplituder och former som förväntat från deras unika positioner och orienteringar (figur 2C överst). Användningen av flera elektrodpar säkerställas stark signalmottagning vid alla möjliga positioner och orienteringar av WEF inom tanken. Kuvertet vågformen (figur 2C botten, grönt spår) alltid innehöll en enda topp per EOD cykel, som fungerade som en pålitlig tidsmarkör för exakt bestämma de inter-pulsintervall och den momentana EOD hastigheten (= IPI -1). De successiva EOD topparna anslöt och linjärt interpolerade vid konstanta tidsintervall (Figur 2D top, svart spår), och den momentana EOD räntan på samma interpole vid konstanta tidsintervall (Figur 2D botten, rosa spår). Den ständiga tids omsampling förfarandet underlättar tidssynkronisering varalan rörelsebanan och EOD-signalen, och gör det möjligt att dra nytta av ett större antal analytiska verktyg för tidsseriedata ständigt samplade. De EOD amplituder inspelade på externa elektroder var konstant medan ett djur var i vila (Figur 2E topp), men det varierat över tiden medan djuret flyttas på grund av förändrade dipol läge och orientering (figur 2F överst). Således kunde fisken rörelsen härledas från att observera förändringen av EOD amplituder över tiden. Baslinjen EOD takten fortsatt låg medan fisk var i vila (Figur 2E botten), men det EOD kurs blev betydligt högre medan fisken aktivt simmade (Figur 2F överst). Vår observation är i överensstämmelse med den positiva korrelationen mellan EOD hastigheten och fisken rörelse som tidigare rapporterats 8,9,34,35.

Video spårningsresultat

Djurets bana och midlines visas i Fig. ure 3E med den första och sista bildramar lagrade. Tids förlopp hållning förändring fångades medan fisk var plötsligt vänder i två sekunder, och fisk midlines plottas var 200 msek. Fisken mittlinjen startade korrekt vid huvudet-spets och avslutas vid svansspetsen av fisk. Fisk bilderna tätt överenskommits med automatiskt spårade midlines trots skuggorna gjutna av djuret. Figur 3F illustrerar tidsvarierande genomsnitts EOD hastighet (τ = 0,0625 sek) i färg, som är överlagrad med tidsmatchade banan för fisk huvud -tips. Under 2 sek vändtiden, nådde den genomsnittliga EOD takten sin topp medan djuret var i mitten av svängfasen, och priset sjönk mot slutet av svarvning. Denna representativa resultat visar att vår metod kan med framgång användas för att studera sambandet mellan självgående rörelser och EOD takt modulering under frisimmande.

t "fo: keep-together.within-page =" alltid "> Figur 1
Figur 1. Akvarium tank och isolering kammar inställning. A) Den experimentella Kammaren består av en anti-vibrationsgolvet, akvariet, och en isoleringskammare. B) Den akvariet delades upp i den centrala arenan för att köra experiment och fyra hörn fack för bostäder enskilda fisk. Varje fack byggdes vattentätt för att förhindra elektrisk kommunikation mellan djur. C) Den motoriserade grinden illustreras på flera perspektiv vinklar. Grinden blir vattentät då låst av sex vingmuttrar som komprimerar gummipackningen (den ljusbruna blad). När olåst, kan grinden fjärrstyras av servomotorn på toppen. D) isoleringskammaren sattes samman genom att sammanfoga tre walla paneler och fyra dörrpaneler, som ger tillgång till akvariet från två sidor. Den nedre panelen visar Ledstång för att stödja tanken kanter och golvvärm placering. Ett skikt av aluminium mesh täcker värmaren för att skydda dess elektriska störningar. E) Väggar och dörrpaneler i isoleringskammaren konstruerades från aluminiumramar för strukturellt stöd (3). Insidan av kammaren täcks av vita plastpaneler (5) för att återspegla den interna ljuskällor och utsidan är täckta av svarta plastpaneler (2) för att blockera externa ljuskällor. En aluminium mesh (1) omfattar ytterväggarna för att blockera yttre elektriska störningar. Väggen är fylld med akustiska glasfiber Batts (4) F) Den översta bilden visar luftventilation setup för att ta bort överflödig fukt som genereras från värme,. Och den nedre bilden visar den vattenfiltrering setup för rengöring, diffuserande, och luftning av tanken vattnet mellan experimentellsessioner. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 2
Figur 2. EOD inspelning setup och representativa resultat. A) Den vänstra panelen visar elektrodenheten som består av en tunn grafitelektrod, ett kort segment av koaxialkabel, och en BNC Jack. Den högra panelen visar elektrodfäst instruktioner. Maskeringstejp används för att tillfälligt placera elektrodenheten, och silikon fogtätning tillämpades för att permanent hålla elektroden. B) kopplingsschema. Två 90 ° orienterade elektroder paras ihop, differentiellt förstärks och filtreras. Fyra inspelningskanaler digitaliserades utanför Faraday cålder. C) Illustration av signalbehandlingssteg EOD. De bästa spåren visar råa vågformer från fyra elektroder par, som åtgärdas och summeras för att producera den grå kurvan nedan. Unimodala kuvert extraheras från den grå vågform med hjälp av "Root-Mean-Square" (RMS) filter (grön kurva). De EOD amplituder och IPIs bestäms från kuverttopparna. D) De tidsvarierande EOD amplituder (topp) och den momentana EOD hastigheten (botten) visas på en längre tidsskala än C). De EOD amplituder och det momentana (= IPI -1) interpoleras med regelbundna tidsintervall genom att gå med kuvert toppar (svarta traces). E) Samma som D) men plottas på en längre tidsskala medan fisk var i vila. F) Samma som E) medan fisk var aktivt simmar. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 3
Figur 3. Video spårning setup och representativa resultat. A) Belysningen och kamerainställningar visas. Den infraröda (IR) och synliga ljuskällor är fästa på väggarna och pekade mot taket, så att takytan reflekterar och sprider ljuset för projicering jämn belysning över hela tanken. Kameran är dold ovanför takpanelen för att förhindra reflektion på vattenytan. En IR lysdiod är placerad vid en av de fyra tank hörn för att generera tidssynkroniseringspulser. B) Generera en sammansatt bakgrundsbild illustreras. Två bildramar (bilder på toppen) är kombinerade för att bilda den sammansatta bakgrundsbild (nederst till vänster) genom att ersätta den region som innehåller det djur (sålock röd fyrkant) med regionen utan djuret (streckad röd fyrkant). Området utanför den centrala arenan maskeras ut i svart (nederst till höger). C) isolering av fisk kontur. En bildramen (överst till vänster) subtraheras från bakgrundsbilden (överst till höger) för att producera differensbilden (nere till vänster), och omvandlas till den binära bilden (nederst till höger) genom att applicera en intensitetströskel. D) Mätning av kroppens position och kroppshållning illustreras. Den binära bild av djuret (BLOB) roterades att anpassa sin huvudaxel med x-axeln (överst till höger), och centrerad på dess tyngdpunkt. Den klump separerades till huvudet (röd) och svans (blå) delar, och varje del var för sig roteras för att bestämma dess omgivande rutan. Den klump var orienterad till djurets referensram (nederst till vänster), och fem har punkter (head-end, mid-huvud, mellankropp, mid-svans, svans-end) bestämdes från mittpunkterna i omgivande rutan kanter. E) Time-lapse imålder av fisk midlines ritas var 200 msek. De första och sista bildramar lagras under 2 sek vändtiden. F) Den genomsnittliga EOD takten är representerat i pseudo-färg och läggas över med banan för fiskens huvud. Samma bilder som i E). Klicka här för att visa en större bild .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Betydelsen av våra tekniker. Sammanfattningsvis har vi beskrivit första uppförandet av ett stort akvarium tank och en isoleringskammare för att observera spontana undersökande beteenden som produceras av WEF. Därefter visade vi tekniken att spela in och spåra EOD takt och rörelsetillstånd från ohämmad fisk i realtid med hjälp av flera elektrodparen. Slutligen beskrev vi infraröd videoinspelning teknik genom vatten i en tid-synkroniserat sätt och bilden spårningsalgoritm för att mäta kroppsställning och kroppshållning. Som en experimentell beredning, erbjuder WEF en viktig fördel för utredning aktiva sensoriska styrda beteenden genom att visa lätt kvantifierbara EOD takt, vilket är lika med den aktiva electrosensory samplingsfrekvens. Kombination av dessa tekniker kan göra det möjligt för exakt och tillförlitlig långsiktig observation 8 av spontana beteenden från ohämmad WEF. Dessutom kan de flesta av vår inställning konstrueras frOM allmänt tillgängliga byggmaterial och lätt att få elektroniska komponenter. De tekniker som beskrivs här har utvecklats och testats för att uppfylla våra experimentella krav under de senaste åren. Därför rekommenderar vi dessa tekniker för framtida studier av spontana undersökande beteenden från frisimmande WEF.

Isolering kammaren. Isoleringskammaren ger välkontrollerade experimentella förhållanden genom att blockera externa ljuskällor, vibrationer, ljud och elektriska störningar med varierande grad av effektivitet. Ljuset blockerande prestanda testades genom att placera en motordriven kamera inne i den mörka isoleringskammaren, och ingen extern ljusläckage observerades från kameran efter skanning alla platser med hjälp av fjärrkontroll pan-kontroll. Den vibrationsdämpande yta installeras under tanken förutsatt dämpning mot yttre vibrationer kanaliseras från golvet, och stapling av flera gummi och skumskikt var effektivt för att blockera de flestaexterna vibrationshändelser. Men intermittenta vibrationer evenemang såsom högt dörr stängning på närliggande ställen gjorde utlösa nyhet svar i sällsynta fall. Även om en anti-vibrationsluftbordet kunde leverera överlägsen isolering prestanda från bakgrundsvibrationer, skulle det vara dyrt att köpa en luft bord stort nog för vår akvariet. Därför placerade vi en hydrofon under vattnet för att upptäcka och exkludera händelser när stora externa vibrationer utlöste nyhet svar. För att ytterligare minimera inverkan av buller utanför laboratoriet, våra experiment genomförts under lågtrafik (efter 18:00). På samma sätt var extern luftburet akustiskt buller dämpas via isoleringskammarens väggar fyllda med glasfiber Batts isolering. Även om vi inte objektivt kvantifiera ljuddämpnings prestanda, de flesta bakgrundsljud i en labbmiljö inte utlösa nyhet svaren. I sällsynta fall, ett plötsligt högt ljud från utsidan triggered en nyhet svar, men en sådan händelse upptäcktes av hydrofoninspelning, och de sällan inträffade under lågtrafik timmar. Akvariet tank ges tillräckligt stort område för våra djur att fritt simma och utforska. Tankens storlek valdes i proportion till längden av arter vi använt (upp till 30 cm), men tanken storlek kan skalas ner om mindre djur användes. Vi valde Gymnotus sp. mellan olika pulsliknande arter för sin stora skallen storlek för att underlätta elektrofysiologiska inspelningar under frisimmande 36. Den elektriska inspelningskvalitet kan förbättras från att använda dyrare koppar maskor, och skyddar fläkten används för fuktreglering.

EOD mätteknik. Vår flerkanals EOD inspelningsteknik tillåten korrekt och tillförlitlig EOD timing mätning från fritt simmar fiskar. Med hjälp av vår teknik, alla EOD pulser som genereras av fritt simmar WEF upptäckts utan att missa eller lägga en syndGLE puls för en sex timmar lång inspelningstid (se figur 12 i juni et al. 8). De EOD inspelningsåtgärder inte bara EOD ränta, men även aktivitetsnivån från tidsvarierande EOD toppamplituder inspelade på externa elektroder. De inspelade EOD amplituder bestäms av den relativa geometrin mellan ett djur och registreringselektroderna, alltså djurförflyttningar framkalla förändringar i EOD amplituder (Figur 2F). Aktivitetsnivån beräknades från variationen (RMS) i EOD amplitud lutningen inom ett rörligt fönster (0,5 sek). Med denna metod skulle videoinspelning inte krävas för att mäta aktivitetsnivå under en längre tidsperiod, och EOD inspelningen ensam kan vara tillräckligt. Istället för att använda en videoinspelning, kan kroppens position och hållning av WEF härledas från EOD inspelning enbart baserat på elektrod platser, geometri en tank, och en teoretisk modell av en aktuell dipol. Med användning av en liknande RECORDIng inställning, Jun et al. 20 föreslog en realtids elektriska spårningsmetod för att spåra flera WEFs i närvaro av ett föremål, som jämför uppmätta signalintensiteterna vid flera inspelningselektrodparen med uppslagstabellposter som innehåller förutsedda signalintensiteter på kända nuvarande dipol platser. Den elektriska tracking metoden ger förbättrad spårning tillförlitlighet i en visuellt rörig miljö där djuren får ofta hindras från insyn, eller under spårning flera djur. WEF: s naturalistiska miljöer innehåller många visuella hinder som vattenlevande växter och rötter, där den elektriska spårningsmetoden kan ge mer tillförlitlig spårning med enklare installationskrav än visuell spårning. I princip är vår metod är direkt tillämpliga på wave-typ WEF arter efter att byta filtertidskonstanter. Den rättelse steget kommer att införa två lägen per EOD cykel, eftersom EOD vågformen är ungefär sinusformad i wave-typ arter. I detta fall, Kan den momentana EOD hastigheten bestämmas genom att hoppa över varannan EOD tidsmarkörer för att ignorera negativa EOD fasen. WEF kan upptäcka inspelningselektroderna när de simmar i närheten, alltså vi undvikit att använda stora eller metallelektroder som kan förnimmas från längre bort 37, och i stället använt tunna grafitelektroder (2 mm diameter). Tunnare koaxialkablar (RG-174) användes med elektrodaggregaten för flexibilitet, men tjockare koaxialkablar (RG-54) användes för ledningsdragning över långa sträckor för överlägsen elektrisk skärmning. Längre EOD inspelningstiden kan uppnås genom att sänka samplingshastigheten, men på en lägre tidsupplösning som en kompromiss. Medelvärdet och variabiliteten av EOD-graden varierar mellan arter och därigenom tidsfönstret för att utjämna den momentana EOD hastigheten måste justeras på lämpligt sätt. En kortare tidsfönster rekommenderas för arter som har kortare medelvärdet och mindre variabilitet i IPIs (t.ex. Gymnotiforms), och en längre tid window rekommenderas för arter som har längre medelvärde och högre variabilitet i IPIs (t.ex. Mormyrids).

Belysning och kamerainställningar. Videoinspelningar ger kvantitativa och kvalitativa beteende-observationer, och här har vi beskrivit förfarandena för att upprätta, inspelning och bearbetning av bilddata. Belysning inställning spelar en viktig roll i att producera bilder av hög kvalitet, och ljusprojektionsvinkeln är en viktig faktor för avbildning vattensdjur. Under suboptimala ljusförhållanden, kan vattenytan bildar bligar och reflektioner som kan störa bilden spårning särskilt när djuren genererar ytvågor. Bländning och reflektionsproblem kan elimineras genom att projicera ljuskällorna från botten av en tank. För en liten tank, kan matriser av LED placeras direkt under tanken och lysa igenom en diffusor panel för att skapa en enhetlig ljusintensitet 38. På samma sätt för en större tank, en ljuskälla cen placeras under tanken, och jämn ljusintensitet kan uppnås genom att tillräckligt avstånd för lätt att sprida 39. I vår inställning, var vi tvungna att projicera ljuset ovanifrån tanken på grund av utrymmesbrist, strukturell stabilitet och värme placering under tanken. Vi undvek de irriterande reflexer problem genom att använda indirekt belysning, så att ljuskällorna projicerades mot taket. Genom att göra den övre delen av kammaren formlös och matt vit, inga reflektioner var synliga på vattenytan. För att bilden hela centrala arenan, ett vidvinkelobjektiv kan monteras på kameran, men vissa objektiv (fish-eye lins) kan orsaka betydande fat förvrängning. Tunnan distorsion kan korrigeras med hjälp av en kalibrerings rutnät blad under tanken för att mäta bildpunktskoordinater för gallerplaceringarna visade på tankens centrum. Tillsammans med motsvarande galler platser i centimeter, kan en transformationsmatris beräknas att samarbetarrect pipan distorsion 40. Vi rekommenderar högupplösta kameror om ett djur storleken är mycket mindre än tankens storlek, så att tillräckligt antal bildpunkter kan erhållas från djuret att korrekt mäta sin kroppshållning.

Bild spårning och tidssynkronisering. Bilden spårningsalgoritmen som beskrivs här använder sig av regionen av intresse (ROI) funktion för att snabbt mäta kroppsställning och kroppshållning. ROI operation minskar bildstorleken som skall behandlas, och begränsar spårningsområde nära djuret plats från föregående bildruta. Vi extraherade kroppshållning (mittlinjen) med hjälp av bildrotation och bounding-box verksamhet i stället för den vanliga bild skeletonization drift, vilket ibland misslyckats med att producera en väldefinierad enda mittlinjen. Djurets referensram var belägen i mitten av huvudet omgivande rutan, som medger egocentriska beteendeanalys. Den huvudsakliga felkällan i bilden tracking berodde på det optiska projektions effekt vid en vidvinkel. Helst ska djurets vertikala rörelser inte påverka 2D-positionsmätning, men ju längre bort från den centrala avbildningsaxel, är större delen av den vertikala dimensionen projiceras på kameran. Den brytning vid vattenytan minskade den optiska projektionseffekten med 28% i vår avbildning setup (kamerahöjd = 1,8 m, vattendjup = 10 cm, tank radie = 75 cm), och den sämsta positionen felet var ± 1,4 cm i cirkulär staket. Tidpunkten mellan ammunitions-och videoinspelningar synkroniserades med hjälp av infraröda LED-pulser att ta hänsyn till den tid som avdrift mellan video-och signal digitizer klockor, och olika inspelningsstarttider. Den förväntade osäkerheten i tidssynkronisering mellan videon och EOD-inspelningar är proportionell mot ram fånga intervall, till exempel 15 bilder per sekund (fps) ram fånga hastighet resulterar i tidsinriktnings osäkerhet på ± 33 ms. En sådan grad av time precision är tillräcklig för att spåra långsammare rör sig fisk, men en höghastighetskamera kan krävas för att spåra snabbare rörliga djur. Vi rekommenderar ljusare ljusintensiteten med en ökad bildhastighet, eftersom tiden sensorn exponeringen är omvänt proportionell mot den bildfrekvens.

Framtida arbete. Social interaktion mellan flera WEFs kan studeras genom att spåra deras EOD-signaler och kropps platser, och uppföljningssystemet måste korrekt associera EOD med placeringen av samma individ. Enligt dipolen lokalisering metod som beskrivs av juni et al. 20 a med hjälp av liknande inställning, djurplatser utläsas av sina EOD-signaler tas emot på flera elektroder kan matchas till det visuella spårnings utgång för korrekt identifiera de EOD pulser från olika individer. Bild spårning av flera djur kan utföras en individ i taget med hjälp av ROI operationen. En ROI kan initialt definieras kring en individ tillspåras, och ROI kommer att flyttas vid varje bildruta med en uppdaterad kroppsställning. De andra fiskar kommer att uteslutas från bilden spårning analysen när den visas utanför ROI, och om verkade inne, kan de andra fiskarna image tas bort automatiskt genom att kontrollera om dess bild vidrör ROI gränsen. Ibland, två djur i kontakt med varandra och deras bilder samman, och i så fall kan en mask manuellt dras för att separera den andra fisken image. En annan intressant framtida arbete är det tredimensionella videospårning för att avslöja intrikata rörelsesekvenser under rov fånga 22 eller sociala interaktioner. MacIver et al. 22 används två kameror för att visa en rektangulär akvariet från toppen och sidan för att rekonstruera en tredimensionell kropp modell. Dock skulle denna metod fungerar inte i vårt fall, eftersom det finns skiljeväggar som blockerar sido åsikter och akvariet har mycket större bredd än djup. I stället skulle det vara mera tillämpkabel för att installera flera kameror på taket vid olika perspektiv vinklar liknar installationen som används av Hedrick 41. För större noggrannhet, skulle brytningseffekt som införts av vattnet och den sneda kameravinkeln måste korrigeras genom att kalibrera bilder i tre dimensioner. Vår visuell spårning metod kunna användas för att studera den elektriska bildflöde på fisk kroppsyta 42,43 när fisk simmar i närheten ett objekt. Som studerats av Hofmann et al. 26, skulle det vara intressant att undersöka objektets elektriska bildflöde under frisimmande beroende på objektets avstånd, form, storlek och material. I slutändan kan våra metoder i kombination med neurala inspelningar från fritt simmar fisken 44-46 avslöjar nya insikter genom observationer av förändringar i neural aktivitet och EOD takt medan fisken bedriver objekt prospektering eller sociala interaktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Detta arbete fick generöst stöd av naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada (NSERC) och den kanadensiska Institutes of Health Research (CIHR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aquarium Construction
Electrically shielded floor heater ThermoSoft Corp., IL, USA ThermoTile www.thermosoft.com
Tempered glass panel generic 0.5 in thick, used for the aquarium construction
Aquarium grade silicone generic  
Acrylic sheet generic 0.25 in thick, matte white
Natural rubber sheet generic 0.25 in thick
Servomotor HTECHRCD Inc., Korea HS-325HB, 180deg rotation www.servocity.com
Servomotor arm mount HITECHRCD Inc., Korea 56362 Large Spline www.servocity.com
Servomotor controller (6 channels) Sparkfun ROB-09664 Micro Maestro 6-channel USB Servo Controller
Active USB extension cable C2G 38990 12 m USB 2.0 A Male to A Female 4-Port Active Extension Cable
Exhaust fan Nutone ILFK120 www.homedepot.com
Vertical aquarium filter Tetra, Germany Whisper Internal Power Filter - 40i  
Crushed coral Used to increase the pH of the tank water
EOD Recording Setup
Graphite Electrodes Staedtler, Germany Mars Carbon 2-mm type HB Shave the outer coating
Physiological Amplifier/Filter Intronix, Canada 2015F  
Coaxial Cable generic RG174 For electrodes assembly
Coaxial Cable generic RG54 For wiring use
BNC jack connector for RG-174 Amphenol Connex 112160 For electrodes assembly
BNC plug connector for RG-54 Amphenol Connex 112116 For wiring use
Signal digitizer hardware Cambridge Electronic Design, UK Power MKII 1401  
Signal digitizer software Cambridge Electronic Design, UK Spike 2. ver 7  
Visual Tracking Setup
White LED light IKEA, Sweden DIODER 201.194.18 www.ikea.com
Infrared LED light (850 nm) Scene Electronics, China S8100-60-B/C-IR Remove built-in fan
USB webcam Logitech Inc., CA, USA C910 Remove Infrared blocking filter
Motorized camera Logitech Inc., CA, USA Quickcam Orbit Remove Infrared blocking filter
Video recording software Logitech Inc., CA, USA Logitech Quickcam Software Download from www.logitech.com
MATLAB Mathworks, MA, USA 2012a Image processing toolbox

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).
  2. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat. Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  3. Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., De Lecea, L. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature. 450 (7168), 420-424 (2007).
  4. Naumann, E. A., Kampff, A. R., Prober, D. A., Schier, A. F., Engert, F. Monitoring neural activity with bioluminescence during natural behavior. Nat. Neurosci. 13 (4), 513-520 (2010).
  5. Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8 (2), 147-152 (2011).
  6. Mavoori, J., Millard, B., Longnion, J., Daniel, T., Diorio, C. A miniature implantable computer for functional electrical stimulation and recording of neuromuscular activity. In IEEE international workshop on biomedical circuits and systems (BioCAS) 2004; Session: Functional Electrical Stimulators and Related Sensing Techniques. , (2004).
  7. Harrison, R. R., Fotowat, H., Chan, R., Kier, R. J., Olberg, R., Leonardo, A., Gabbiani, F. Wireless neural/EMG telemetry systems for small freely moving animals. IEEE TBioCAS. 5 (2), 103-111 (2011).
  8. Jun, J. J., Longtin, A., Maler, L. Precision measurement of electric organ discharge timing from freely moving weakly electric fish. J. Neurophys. 107 (7), 1996-2007 (2012).
  9. Forlim, C. G., Pinto, R. D. Noninvasive Realistic Stimulation/Recording of Freely Swimming Weakly Electric Fish: Movement Detection and Discharge Entropy to Infer Fish Behavior. , (2012).
  10. Caputi, A. A., Aguilera, P. A., Castelló, M. E. Probability and amplitude of novelty responses as a function of the change in contrast of the reafferent image in G. carapo. J. Exp. Biol. 206 (6), 999-1010 (2003).
  11. Pluta, S. R., Kawasaki, M. Multisensory enhancement of electromotor responses to a single moving object. J. Exp. Biol. 211 (18), 2919-2930 (2008).
  12. Heiligenberg, W. Electrolocation and jamming avoidance in a Hypopygus (Rhamphichthyidae, Gymnotoidei), an electric fish with pulse-type discharges. J. Comp. Phys. A. 91 (3), 223-240 (1974).
  13. Capurro, A., Malta, C. P. Noise autocorrelation and jamming avoidance performance in pulse type electric fish. Bull. Math. Biol. 66 (4), 885-905 (2004).
  14. Post, N., von der Emde, G. The "novelty response" in an electric fish: response properties and habituation. Phys. Behav. 68 (1), 115-128 (1999).
  15. Toerring, M. J., Serrier, J. Influence of water temperature on the electric organ discharge (EOD) of the weakly electric fish Marcusenius cyprinoides (Mormyridae). J. Exp. Biol. 74 (1), 133-150 (1978).
  16. Ardanaz, J. L., Silva, A., Macadar, O. Temperature sensitivity of the electric organ discharge waveform in Gymnotus carapo. J. Comp. Phys. A. 187 (11), 853-864 (2001).
  17. Rodríguez-Cattaneo, A., Pereira, A. C., Aguilera, P. A., Crampton, W. G., Caputi, A. A. Species-specific diversity of a fixed motor pattern: the electric organ discharge of Gymnotus. PLoS One. 3 (5), (2008).
  18. Bennett, M. V. L. Fish physiology. Hoar, W. S., Randall, D. J. , Academic Press. NY. 493-574 (1971).
  19. Wong, C. J. Afferent and efferent connections of the diencephalic prepacemaker nucleus in the weakly electric fish, Eigenmannia virescens: interactions between the electromotor system and the neuroendocrine axis. J. Comp. Neurol. 383 (1), 18-41 (1997).
  20. Jun, J. J., Longtin, A., Maler, L. Real-time localization of moving dipole sources for tracking multiple free-swimming weakly electric fish. PLoS One. 8 (6), (2013).
  21. Rasnow, B., Assad, C., Hartmann, M. J., Bower, J. M. Applications of multimedia computers and video mixing to neuroethology. J. Neuro. Methods. 76 (1), 83-91 (1997).
  22. MacIver, M. A., Nelson, M. E. Body modeling and model-based tracking for neuroethology. J. Neuro. Methods. 95 (2), 133-143 (2000).
  23. Douglas, R. H., Hawryshyn, C. W. Behavioral studies of fish vision: an analysis of visual capabilities. In The Visual System of Fish. Douglas, R., Djamgoz, M. , Chapman & Hall. London. 373-418 (1990).
  24. Ciali, S., Gordon, J., Moller, P. Spectral sensitivity of the weakly discharging electric fish Gnathonemus petersi using its electric organ discharges as the response measure. J. Fish Biol. 50 (5), 1074-1087 (1997).
  25. Ratledge, D. An Introduction to Webcam Imaging. Digital Astrophotography: The State of the Art. , 31-44 (2005).
  26. Hofmann, V., Sanguinetti-Scheck, J. I., Gómez-Sena, L., Engelmann, J. From static electric images to electric flow: Towards dynamic perceptual cues in active electroreception. J. Phys. Paris. 107, 95-106 (2013).
  27. Castelló, M. E., Aguilera, P. A., Trujillo-Cenóz, O., Caputi, A. A. Electroreception in Gymnotus carapo: pre-receptor processing and the distribution of electroreceptor types. J. Exp. Biol. 203 (21), 3279-3287 (2000).
  28. Caputi, A. A., Castelló, M. E., Aguilera, P., Trujillo-Cenóz, O. Electrolocation and electrocommunication in pulse gymnotids: signal carriers, pre-receptor mechanisms and the electrosensory mosaic. J. Phys. 96 (5), 493-505 (2002).
  29. Pusch, R., et al. Active sensing in a mormyrid fish: electric images and peripheral modifications of the signal carrier. J. Exp. Biol. 211 (6), 921-934 (2008).
  30. Harder, W. Die beziehungen zwischen elektrorezeptoren, elektrischem organ, seitenlinienorganen und nervensystem bei den Mormyridae (Teleostei, Pisces). Z. Vgl. Physiol. 59 (3), 272-318 (1968).
  31. Bacelo, J., Engelmann, J., Hollmann, M., Gvonder Emde,, Grant, K. Functional foveae in an electrosensory system. J. Comp. Neurol. 511 (3), 342-359 (2008).
  32. Hollmann, M., Engelmann, J., Von Der Emde, G. Distribution, density and morphology of electroreceptor organs in mormyrid weakly electric fish: anatomical investigations of a receptor mosaic. J. Zool. 276 (2), 1469-7998 (2008).
  33. Knudsen, E. I. Spatial aspects of electric fields generated by weakly electric fish. J. Comp. Phys. 99 (2), 103-118 (1975).
  34. Kramer, B. Spontaneous discharge rhythms and social signalling in the weakly electric fish Pollimyrus isidori (Cuvier et Valenciennes) (Mormyridae, Teleostei). Behav. Ecol. Sociobiol. 4 (1), 66-74 (1978).
  35. Stoddard, P. K., Markham, M. R., Salazar, V. L., Allee, S. Circadian rhythms in electric waveform structure and rate in the electric fish Brachyhypopomus pinnicaudatus. Physiol. Behav. 90 (1), 11-20 (2007).
  36. Canfield, J. G. Methods for chronic neural recording in the telencephalon of freely behaving fish. J. Neurosci. Methods. 133 (1-2), 127-134 (2004).
  37. Chen, L., House, J. L., Krahe, R., Nelson, M. E. Modeling signal and background components of electrosensory scenes. J. Comp. Physiol. A. 191 (4), 331-345 (2005).
  38. Emran, F., Rihel, J., Dowling, J. E. A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities. J. Vis. Exp. (20), (2008).
  39. Windsor, S. P., Tan, D., Montgomery, J. C. Swimming kinematics and hydrodynamic imaging in the blind Mexican cave fish (Astyanax fasciatus). J. Exp. Biol. 211 (18), 2950-2959 (2008).
  40. Shapiro, L. G., Stockman, G. C. Computer vision. , Prentice Hall. Upper Saddle River, NJ. 367-368 (2001).
  41. Hedrick, T. L. Software techniques for two- and three-dimensional kinematic measurements of biological and biomimetic systems. Bioinsp. Biomim. 3 (3), 034001 (2001).
  42. Babineau, D., Lewis, J. E., Longtin, A. Spatial acuity and prey detection in weakly electric fish. PLoS Comp. Biol. 3 (3), (2007).
  43. Sanguinetti-Scheck, J. I., Pedraja, E. F., Cilleruelo, E., Migliaro, A., Aguilera, P., Caputi, A. A., Budelli, R. Fish geometry and electric organ discharge determine functional organization of the electrosensory epithelium. PLoS One. 6 (11), (2011).
  44. Castello, M. E., Caputi, A., Trujillo‐Cenóz, O. Structural and functional aspects of the fast electrosensory pathway in the electrosensory lateral line lobe of the pulse fish Gymnotus carapo. J. Comp. Neurol. 401 (4), 549-563 (1998).
  45. Canfield, J. G., Mizumori, S. J. Y. Methods for chronic neural recording in the telencephalon of freely behaving fish. J. Neurosci. Methods. 133 (1), 127-134 (2004).
  46. Pereira, A. C., Centurión, V., Caputi, A. A. Contextual effects of small environments on the electric images of objects and their brain evoked responses in weakly electric fish. J. Exp. Biol. 208 (5), 961-972 (2005).

Tags

Neurovetenskap djurspårning svagt elektriska fiskar elektrisk urladdning orgel undervattens värmekamera automatiserad bild spårning sensorisk isolering kammare undersökande beteende
Långsiktig Behavioral Spårning av fritt Simning Svagt Electric Fish
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jun, J. J., Longtin, A., Maler, L.… More

Jun, J. J., Longtin, A., Maler, L. Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish. J. Vis. Exp. (85), e50962, doi:10.3791/50962 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter