Summary
Vi beskriver en række teknikker til at studere spontane adfærd svømme frit svagt elektrisk fisk over en længere periode ved synkront at måle dyrets udledning elektrisk orgel timing, kropsstilling og kropsholdning både nøjagtigt og pålideligt i en specielt designet akvarium tanken i en sensorisk isolation kammer.
Abstract
Langsigtet adfærdsmæssige tracking kan fange og kvantificere naturlige dyreadfærd, inklusive dem, der forekommer sjældent. Adfærd, såsom udforskning og sociale interaktioner kan bedst studeres ved at observere uhæmmet, frit opfører dyr. Svagt elektrisk fisk (WEF) display let observerbar sonderende og sociale adfærd ved at udsende elektrisk orgel afladning (EOD). Her beskriver vi tre effektive teknikker til at synkront måle EOD, kropsstilling, og kropsholdning af en fritsvømmende WEF i en længere periode. Først beskriver vi konstruktionen af en eksperimentel beholder inde i en isoleret kammer designet til at blokere eksterne kilder af sensoriske stimuli, såsom lys, lyd og vibrationer. Akvariet blev delt til at rumme fire prøvelegemer og automatiske kontrolposter fjernstyre dyrenes adgang til den centrale arena. For det andet beskriver vi en præcis og pålidelig real-time EOD timing målemetode fra frit svømme WEF. Signal fordrejninger som følge af dyrets kropsbevægelser er korrigeret med rumlig udjævning og stadier tidsmæssige behandling. For det tredje, beskriver vi en undervands nær-infrarød billeddannelse setup til at observere uforstyrrede natdyr adfærd. Infrarødt lys pulser blev brugt til at synkronisere tidsplanen mellem videoen og den fysiologiske signal over en lang optagelse varighed. Vores automatiske tracking software måler dyrets krop position og kropsholdning pålideligt i et akvatisk scene. I kombination af disse teknikker gør det muligt langsigtet observation af spontane adfærd svømme frit svagt elektrisk fisk på en pålidelig og præcis måde. Vi mener, at vores fremgangsmåde kan ligeledes anvendes til undersøgelse af andre akvatiske dyr ved at relatere deres fysiologiske signaler sonderende eller sociale adfærd.
Introduction
Baggrund. Kvantitative eksperimenter på dyrs adfærd (fx tvungen valg, chok undgåelse, T-labyrint, osv.) Er typisk brugt til at undersøge specifikke hypoteser om sansemotoriske færdigheder, indlæring og hukommelse dannelse. Men disse restriktive eksperimenter glip af meget af den rigdom af naturlige dyrs adfærd og vil sandsynligvis resultere i forsimplede modeller af den underliggende neurale grundlag for adfærd. Eksperimenter under mere naturalistiske forhold er derfor et vigtigt supplement, som vi kan udforske mere fuldstændigt en art adfærdsmæssigt repertoire. Eksperimenter med frit bevægelige dyr skal dog løse unikke tekniske udfordringer såsom bevægelse-induceret optagelse artefakter. I modsætning til stimulus-fremkaldte reaktioner, kan spontant forekommende udforskende adfærd ikke kan forudsiges, og dermed forsøgspersoner skal konstant overvåges og følges over en længere periode. Specifikke forskningsspørgsmål can bedst behandles ved nøje udvalgte organismer og tilgængelige tekniske redskaber. For eksempel har optisk registrering og stimulering teknikker såsom genetisk kodet calcium sensorer 1 og optogenetics 2 blevet anvendt med succes til frit at bevæge sig genetiske modelorganismer 3-5. Alternativt kan miniaturiserede neurale telemetrisystemer registrere og stimulere frit bevægelige smådyr 6,7.
Elektrisk fisk. WEF arter genererer elektriske udladninger orgel (EODS), som tillader dem at fornemme deres umiddelbare omgivelser eller til at kommunikere over større afstande. Tidsmæssige mønstre af EODS varierer under forskellige forhold som selvstændige bevægelser 8,9, sensoriske stimuli 10,11, og sociale interaktioner 12,13. Puls-type WEF arter producerer et tog af diskrete pulser, i modsætning til bølge-type arter, som genererer løbende kvasi-sinusformet kurver. I almindelighed, puls-typen arter udstille more variabel EOD rente i forhold til bølge-type arter og dyrenes EOD satser afspejler nøje nyhed indholdet af deres sensoriske omgivelser 10,14. Kan Puls-type arter straks forkorte inter-puls interval (IPI) inden for en enkelt puls cyklus i at reagere på en roman sensorisk forstyrrelse (nyhed svar 10,11,14). Den igangværende elektriske opførsel af disse fisk kan forstyrres af ukontrollerede sensoriske stimuli fra eksterne kilder, og forskellige former for stimuli, såsom vibrationer, lyd, elektricitet og lys er kendt trigger nyhed svar. Derfor skal der træffes særlige forholdsregler for at blokere eller dæmpe eksterne sensoriske stimuli i løbet af en langvarig observation af fritsvømmende WEF. På denne måde kan ændringer i EOD sats og bevægelse baner specifikt tildeles stimuli præsenteret af forsøgslederen.
Akvarium tank og isolation kammer. Vi har derfor lagt flere lag af vibrationer absorberende materiale under et stort akvarium akvarium (2,1 mx 2,1 mx 0,3 m), og omgivet tanken med en isoleret kabinet til at blokere eksterne kilder af lys, elektrisk støj, lyd og varme flux. EOD afhænger af den omgivende temperatur 15,16, og dermed vandtemperaturen var stramt reguleret på en tropisk område (25 ± 1 ° C) i Sydamerikansk WEF arter. Vi bygget en stor og lavvandet (10 cm vanddybde) tank for at observere rumlige sonderende adfærd af WEF primært begrænset i to dimensioner (figur 1a). Tanken blev delt ind i en central arena for at observere rumlige adfærd, og fire hjørne rum til separat huse enkelte fisk (figur 1B). Hvert rum blev bygget vandtæt for at forhindre elektrisk kommunikation mellem individer. Dyr adgang til den centrale arena blev styret udefra af fire motoriserede porte. Portene blev placeret mellem rummene, og de blev vandtæt når låstaf nylon wing-nødder. Ingen metaldele blev brugt under vandet siden WEF reagerer sensitivt på metaller.
EOD optagelse. EODS genereres i en stereotyp måde ved aktivering af en enkelt (i Mormyrids) eller flere rumligt fordelte elektriske organer (i Gymnotiforms) 17,18. Temporal modulationer i EOD rate kan afsløre et højere niveau neurale aktiviteter, da den medullære pacemaker modtager direkte neurale input fra højere områder af hjernen, såsom diencephalic prepacemaker kerne, som igen modtager aksonale fremskrivninger fra forhjernen 19. Dog skal EOD timing omhyggeligt udvindes fra en rå bølgeform optagelse og ikke påvirket af dyrets bevægelse fordrejninger. Det elektriske felt genereret af en WEF kan tilnærmes som en dipol, og dermed EOD impulsamplituder ved optagelse elektroder afhænger af de relative afstande og orienteringer mellem dyret og elektroderne 8,20. Dyrets selv-movemforældre ændre den relative geometri mellem dyret og elektroderne, og dermed bevægelser forårsage EOD amplituder på forskellige elektroder til at variere over tid i et volatilt måde (se figur 2B i Jun et al. 8). Desuden selvstændige bevægelser også ændre formen af indspillede EOD kurver, fordi relative bidrag fra forskellige sæt af de elektriske organer er afhængige af deres placeringer langs kroppen længde og deres lokale krumninger indført ved hale bøjning. Bevægelsessensorerne fordrejninger i EOD amplituder og figurer kan medføre unøjagtige og upålidelige EOD timing målinger. Vi overvandt disse problemer ved rumligt gennemsnit af flere EOD kurver optaget på forskellige steder, og ved at tilføje en konvolut udvinding filter til at præcist at afgøre, EOD timing fra en fritsvømmende WEF. Desuden er vores teknik måler også EOD amplituder, som viser, om et dyr hviler eller aktivt bevæger baseret på ændringen af EODamplituder over tid (se figur 2E og 2F). Vi indspillede differentielt forstærkede signaler fra optagelse elektrodeparrene at reducere common-mode støj. Da EOD impulser genereres med uregelmæssige tidsintervaller, EOD event tidsserier har en variabel samplingfrekvens. EOD tidsserier kan konverteres til en konstant samplingfrekvens ved interpolation hvis det kræves af en analytisk redskab valg.
Videooptagelse. Selvom EOD optagelse kan overvåge en grov bevægelse aktivitet af et dyr, videooptagelse tillader direkte målinger af et dyrs krop position og kropsholdning. Nær-infrarødt (NIR) belysning (λ = 800 ~ 900 nm), tillader uperturberede visuel observation af svømme frit fisk 21,22, da WEFs er mest aktive i mørke, og deres øjne ikke er følsomme over for NIR spektret 23,24. De fleste digitale billedsensorer (f.eks CMOS eller CCD) kan fange NIR spektret med wavelength interval mellem 800-900 nm, efter fjernelse af en infrarød (IR) blokerende filter 25. Visse high-end forbruger-grade webkameraer tilbyder high-definition, bred betragtningsvinkel og god lav lysfølsomhed, der kan producere en billedkvalitet svarende til eller bedre end professionel kvalitet IR kameraer til rådighed på meget større omkostninger. Desuden er visse forbruger-grade webkameraer bundlet med optagelse software, der tillader en udvidet optagelse varighed ved at komprimere video uden tab af kvalitet. De fleste professionel kvalitet kameraer tilbyder tidssynkronisering TTL puls udgange eller udløse TTL pulsindgange 26 til justering af timingen mellem video med de digitaliserede signaler, men denne funktion er generelt fraværende i forbruger-grade webcams. Dog kan timingen mellem en videooptagelse og et signal digitizer præcist modsvares af samtidig erobre et periodisk blinkende IR LED med kameraet og signal digitizer. Den oprindelige og den endelige IR puls timing kan bruges ens to gang kalibrering markører til at konvertere video frame numre til signalet digitizer tidsenhed og vice versa.
Lys & baggrund. Billedoptagelse gennem vand kan være teknisk udfordrende på grund af lysreflekser på vandoverfladen. Vandoverfladen kan fungere som et spejl for at afspejle en visuel scene over vand, og obskure visuelle funktioner under vandet, og dermed scenen over vandet skal gøres konturløse at forhindre visuel interferens. For at billedet hele akvariet, et kamera skal placeres direkte over vandet, og det skal være skjult bag loftet over en lille visning hul for at forhindre sine overvejelser på vandoverfladen. Desuden kan vandoverfladen producere glares og uensartet belysning hvis lyskilder forkert projiceres. Indirekte belysning kan opnå en ensartet lysstyrke over hele akvariet ved at sigte lyskilderne mod loftet, således at loftet og omgivende walls kan reflektere og sprede lyset stråler, før de når vandoverfladen. Vælg en IR lampe, der matcher en spektral respons på kameraet (f.eks 850 nm peak bølgelængde). Elektrisk støj fra lyskilderne kan minimeres ved hjælp af LED-lys og placere deres DC strømforsyninger uden for Faradays bur. Placer en hvid baggrund under beholderen, da fisk kontraster godt i en hvid baggrund på NIR bølgelængder. Tilsvarende anvendelse af mat hvid farve på de indre overflader af isolationskammeret giver en ensartet og lys baggrund belysning.
Video tracking. Efter en videooptagelse, kan en automatiseret billede sporing algoritme måle dyrets kropsstillinger og stillinger over tid. Videosporingssystemet kan udføres automatisk ved enten klar-til-brug software (Viewpoint eller Ethovision) eller bruger-programmerbar software (OpenCV eller Matlab Billedbehandling værktøjskasse). Som første trin i billedet tracking,et gyldigt tracking areal skal defineres ved at tegne en geometrisk form at udelukke området uden (maskering drift). Dernæst skal isoleres fra baggrunden ved at trække baggrundsbilledet fra et billede, der indeholder dyret dyrets billede. Det subtraherede billede konverteres til et binært format ved anvendelse af en intensitet tærskel, således at tyngdepunktet og orienteringen akse kan beregnes ud fra binære morfologiske operationer. I Gymnotiforms 27-29 og Mormyrids 30-32, den electroreceptor tæthed er den højeste i nærheden af hovedet regionen og dermed hovedet position på ethvert tidspunkt angiver en placering af højeste sensoriske skarphed. Hoved og hale steder automatisk kan fastsættes ved at anvende billedet rotation og omgivende boks operationer. Hoved og hale ender kunne skelnes fra hinanden ved manuelt at definere dem i den første ramme, og ved at holde styr på deres placeringer fra at sammenligne to på hinanden følgende rammer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne procedure opfylder kravene i University of Ottawa Animal Care udvalget. Ingen interessekonflikt deklareres. Der henvises til tabel af materialer og reagenser til de mærker og modeller af udstyr og materialer, der er anført nedenfor. Custom skrevet Spike2 og MATLAB scripts og prøve data findes i Supplemental File.
1.. Akvarium Tank Isolation Chamber Setup
- Anti-v ibration gulv. Konstruere en anti-vibration overflade (2,1 mx 2,1 m) ved at stable gummi puder, akustisk Styrofoam, marine krydsfiner, og polyurethan skumpuder fra bunden til toppen (figur 1A). Lay fire træstolper (5 cm x 10 cm) på krydsfiner panelet for at understøtte kanterne af akvariet tanken.
- Gulv varmelegeme. Lå en elektrisk afskærmet varmeelement løbet termisk gradueret skum polstring (se figur 1D nederst). Dæk varmeelement med et metallic mesh til elektrisk afskærmning.
- Spatial tank. Konstruer en bred og lavvandet akvarium tanken (1,8 mx 1,8 mx 30 cm) ved hjælp af 1,3 cm tykt hærdet glas paneler, L-formet aluminiumsramme og akvarium-silikone (se figur 1A). Dæk undersiden af tanken med en stor plade af hvid baggrund at tilvejebringe høj billedkvalitet kontrast protokollen (se 3).
- Opdel akvariet tanken ind i en central arena (1,5 mi diameter) og fire hjørne rum (se figur 1B) ved at installere vægge (22,5 cm høj) lavet af acrylplader (mat hvid, 0,64 cm tyk).
- Bend fire acrylplader (22,5 cm x 102,7 cm) ved at anvende varme til at skabe fire buede vægsektioner, og vedhæfte dem til bunden af tanken ved hjælp af silikone caulk at adskille den centrale arena fra de fire hjørne rum. Lad 20 cm mellemrum mellem de buede sektioner for porten installation.
- Separate tilstødende hjørne rum ved at installere fire dobbelte vægge with 15 cm huller, som giver ekstra elektrisk isolation og pladser til undervands sensorer som en hydrofon.
- Saml fire motoriserede porte, og installere dem mellem de hjørne rum og den centrale arena.
- Saml fire dørkarme som vist i figur 1C. Opret seks brønde (0,64 cm dyb) på hver dørkarm, indkapsle nylon agern nødder (0,64 cm i diameter gevind), og fastgør dem med epoxy.
- Skær fire dørpaneler fra akryl og gummiplader, og oprette seks huller (0,64 cm diameter) på akryl og gummi paneler til låsemekanisme. Deltag i akryl og gummi paneler ved hjælp af silikone fugemasse.
- Installer akryl hængsler at slutte dørpanelerne med dørkarme.
- Mount svingende arme på servomotorer, og installere dem på toppen af dørkarme (se figur 1C). Lav sløjfer med kabelstrips at sammenkæde de svingende arme til dørpanelerne.
- Placer gate forsamlinger på gaps skabt mellem de buede vægsektioner, og fastgør dem ved hjælp af silikone fugemasse.
- Tilslut alle servomotorer til en servo controller, og tilslut den til en strømkilde og en computer via en aktiv USB-forlængerkabel. Test portene hjælp control software leveres med servo controller.
- Efter silikone hærder, så tjek for vandtæthed ved at låse alle porte med skruer i nylon og fylde et rum ad gangen.
- Isolation kammer. Konstruere en isolation kammer at omgive akvariet og blokere eksterne kilder af lys, lyd og elektrisk støj (se figur 1D).
- Lav tre vægpaneler (2 mx 2 mx 5 cm) og fire dørpaneler (1,9 mx 0,95 mx 5 cm). For hvert panel, deltage aluminium lister (5 cm x 2,5 cm) til at oprette en rektangulær ramme, og nitte en hvid bølgeplast panel på aluminiumsramme. Fyld akustiske glasfiber batts i panelerne, og tæt med en sort bølgeplast panel.
- Installer tre vægpaneler på anti-vibration gulvet, og installere klaver hængsler at forbinde de fire dørpaneler på vægpaneler.
- Surround isolation kammer med aluminium masker, og jord masker på alle sider til at skabe et Faradays bur.
- Fugt kontrol. Installer en støjsvag udstødning ventilator (figur 1F øverst) for at fjerne overskydende fugt oprustning fra opvarmning. Placer udstødningsgas ventilator mindst 2 m væk fra optagelse site, og installere en luftkanal mellem isolation kammeret og udstødning fan.
- Rutinemæssigt overvåge og vedligeholde betingelserne for tank vand og dyr.
- Bevar konstante vandforhold ved 10 cm dybde, 100 uS / cm ledningsevne og pH 7,0 ved tilsætning af vand eller salt stamopløsning (se Knudsen 33 for opskriften). Tilføj en pose knust koral hvis pH falder til under 6,5.
- Installer lodrette akvarium filtre, som kan operere fra lavt vand til rengøring ogaerating formål (figur 1F nederst). Afbryd filtrene og tage dem ud af den centrale arena under indspilningerne.
- Levere levende melorme på bunden af tanken ved at fastgøre dem på sugekopper med elastikker. Undgå frit svævende byttedyr såsom blackworms at forhindre ukontrolleret fodring af herreløse byttedyr under optagelse.
2. EOD Tracking
- Elektroder installation. Saml otte grafitelektroder, og plads dem lige på den buede væg af den centrale arena.
- Opnå tegning ledninger (15 cm lang; Mars Carbon 2 mm typen HB), og barbere den ydre belægning af kundeemner.
- Skær otte 10 cm segmenter af koaksialkabel (RG-174), pak kabel kerne omkring den ene ende af grafit stænger, og anvende varmekrymperør over dem for en stærk og stabil elektrisk forbindelse. Vedhæft BNC jack stik på den modsatte ender (figur 2A venstre). </ Li>
- Placer elektroderne på væggen ved at tape og anvende tynde strimler af malertape på elektroden overflader for at beskytte mod silikone. Påfør silikone fugemasse til permanent at holde elektroderne, og fjerne alle bånd før silikone hærder (figur 2A højre).
- Byg otte kabel samlinger ved at måle afstanden fra hver elektrode til forstærkeren, og skære koaksialkabler (RG-54) i længder. Vedhæft BNC-stik i begge ender af kablerne.
- Brug kabel forsamlinger til wire alle elektroder til forstærkeren. Differentielt forstærke ved at parre to 90 ° orienterede elektroder (se figur 2B), og jorden alle koaksiale afskærmning ledninger ved at forbinde dem til Faradays bur.
- Indstil forstærkeren gevinst under signalmætning grænse, og anvende et band-pass filter (200 Hz-5 kHz) til at fjerne støj. Digitalisere fire optagelse elektrodepar ved 40 kS / sek.
- Onlinesignalbehandling. I vejledningen er skrevet til Spike2 software og parameterindstillingerne er optimeret til Gymnotus sp. (Se figur 2C for resumé).
- Tilføj en DC fjerne proces (τ = 0.1 sek) til alle optagekanaler.
- Tilføj en Afhjælp processen til alle optagelser kanaler.
- Opret en virtuel kanal ved at summere alle fire optagelse kanaler.
- Uddrag en unimodal kuvert per EOD puls ved at tilføje et RMS (root-mean-squared,
) Fremgangsmåde (τ = 0,25 msek) til den virtuelle kanal, til frembringelse af en enkelt top pr EOD cyklus til utvetydigt at bestemme impuls timing. - Opret en realmark kanal fra den virtuelle kanal og registrere tid og værdier af udsvingene, efter indstilling en passende tærskel at indfange alle EOD pulser without mangler en puls, og samtidig undgå falske positiver.
- Overvåg øjeblikkelige EOD sats i realtid ved at indstille kanaldisplayet indstilling af realmark kanal til en øjeblikkelig frekvens mode.
- Overvåg fisk bevægelse i real-tid ved at duplikere realmark kanal og indstille displayets mulighed for en bølgeform mode.
- Kvantificere et aktivitetsniveau fra RMS af EOD amplitude skråning ved at skabe en virtuel kanal fra realmark kanal (0,01 sek sampling periode), og tilføjer hældning (τ = 0,25 ms) og RMS (τ = 0,5 ms) processer.
- Eksporter realmark kanal i Spike2 softwaren til MATLAB format.
) Fremgangsmåde (τ = 0,25 msek) til den virtuelle kanal, til frembringelse af en enkelt top pr EOD cyklus til utvetydigt at bestemme impuls timing. 3. Synkroniseret Video Tracking
- Opret en baggrund scene.
- Skjul ethvert objekt, der kaster en refleksion på vandoverfladen ved at dække med mat hvid bordplade film.
- Installer en mat hvidbølgeplast panel 15 cm under loftet for at skjule kameraet og udluftningshul.
- Print gitter mønstre på et stort stykke hvidt papir til kalibrering af et kamera, og læg det under beholderen til at give en høj kontrast baggrund.
- Installere lyskilder.
- Anskaf IR LED lys og fjerne indbyggede blæsere for at reducere støjen. Kør LED med en løbende reguleret DC strømforsyning placeret uden for Faradays bur.
- Installer IR LED lys for billeddannelse i mørke, og hvide LED-lys til at køre en daglig lys cyklus i testen fisk. Direkte alle lyskilder mod loftet for at opnå indirekte og ensartet belysning (figur 3A).
- Regulere døgnets lys cyklus ved at køre den hvide LED-lys med en timer-styret switch (fx 12 timer on/12 hr off).
- Installér et kamera direkte over akvariet.
- Anskaf et NIR-følsomme kamera eller fjerne en IR blokering filter ved at bryde en tynd plade af tonet glas på bagsiden af linsesamlingen. Sørg for, at betragtningsvinkel er bred nok til at billedet hele central arena.
- Lav et lille visning hul i midten af loftsplade, og placere kameraet direkte over hullet.
- Installer en hvid ring vagt omkring linsen, hvis lyskilderne generere glares.
- Lav en tidssynkroniseret videooptagelse.
- Placer en IR-LED på en af de fire tankens hjørner for at generere tidssynkronisering bælgfrugter (1 ms varighed, 10 sek periode). Tilføj en load-begrænsende modstand (1 kohm) i serien, og drive IR LED fra et digitalt output port på digitizer hardware.
- Brug videooptagelse software følger med kameraet, hvis tilgængelig. Vælg den højeste optagekvalitet (f.eks tabsfri komprimering) og de højeste opløsninger der understøttes.
- Start videooptagelsen umiddelbart før du starter EOD optagelse, og stoppe videooptagelse umiddelbart efter EOD optagelse.
- Efter optagelsen konvertere Billedramme numre til digitizer tidsenhed ved lineært at interpolere mellem den første og den sidste lysimpulser fanget af signal digitizer og videooptagelse.
- Automatiseret billede sporing
Vejledningen er skrevet til MATLAB Billedbehandling værktøjskasse, og gøre brug af sine funktioner. En brugerdefineret MATLAB script er forsynet med dette anbringende til automatiseret billede sporing.- Importer video. Importer en videooptagelse fil direkte til Matlab arbejdsområde ved hjælp af "Videoreader. Læse"-funktion.
- Opret en sammensat baggrundsbillede ved at kombinere to billedrammer. Udskift billedområdet besat af et dyr med et tomt billede af samme region fra en anden ramme (se figur 3B).
- Angiv et billede region at spore ved at tegne en cirkulær maske omkring den centrale arena for at udelukke enrea udenfor (figur 3B nederst), og ganges med en konstant (r int) for at indstille en minimumsgrænse for intensitet forskel. For eksempel vil indstilling dskriv = 0.85 vil undertrykke intensitetsfluktuationer 15% = (1 - r int) under baggrunden.
- Billede subtraktion. Fratræk en billedramme (= IM k) fra baggrundsbilledet (= IM 0) for at opnå forskellen billede (= ΔIM k). Brug heltal uden fortegn numerisk præcision til at lagre billedet intensitetsværdier som ikke-negative tal.
- Segment forskellen billedet ved at anvende en intensitet tærskel bestemmes ud fra graythresh funktion. Rengør det binære billede vha. bwmorph funktion, og vælg den største klat svarende til en dyr efter beregning alle blob områder vha. regionprops funktionen.
- Bestem tyngdepunkt og større orientering enxis af de største klat ved at anvende regionprops funktion og rotere billedet for at tilpasse hovedakse med x-aksen. Opdel billedet til hoved og hale dele ved centroiden (Figur 3D øverst).
- Bestem hovedakse hoveddelen og rotere hele billedet på linie med x-aksen (figur 3D nederst til venstre). Fit afgrænsningsrammer-bokse omkring hoved og hale dele parallelt med deres hovedakser vha. regionprops funktionen.
- Bestem medianen y-koordinaterne for klat til venstre, center og højre lodrette kanter afgrænsningsrammerne (grønne prikker i figur 3D bund), og tildele dem til fem karakteristiske punkter (hoved-tip, mid-hoved, mid-krop , mid-hale, hale-spids).
- Proces successive rammer efter klippe et billede ramme centreret ved dyrets tyngdepunkt bestemmes ud fra sin tidligere ramme.
- Manuelt at tildele hovedet orientering for første billede, og bruge en dot-produkt betweDA orientering vektorer fra to på hinanden følgende rammer automatisk skal fastslå hovedet orientering. Undersøg resultatet, og manuelt vende hovedet orientering hvis forkert tildelt.
- Plot et dyr bane ved at tilslutte sig hoved-tips, og glat at bruge median og gennemsnit filtre (n = 3), hvis det har en nervøs udseende. Oven på bane med et baggrundsbillede, og interpolere fisk midlines ved hjælp af de fem karakteristiske punkter (se figur 2E).
- Beregn den gennemsnitlige EOD hastighed hver billedoptagelse tid ved gensampling den øjeblikkelige EOD rate (100 Hz samplingfrekvens) og gennemsnit (0,0625 sek tid vindue). Plot bane i pseudo-farver bestemmes ud fra den tid-matchede EOD sats, og oven med et baggrundsbillede (se figur 2F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
EOD trackingresultater
De indspillede EOD waveforms fra forskellige elektrode par varierede i amplituder og former som forventet fra deres unikke positioner og orienteringer (figur 2C top). Brugen af flere elektrode par sikrede stærkt signal modtagelse på alle mulige positioner og orienteringer af WEF i tanken. Kuverten bølgeform (figur 2C bund, grøn trace) altid indeholdt en enkelt top per EOD cyklus, der fungerede som en pålidelig tid markør for præcis bestemmelse af inter-puls intervaller og den øjeblikkelige EOD sats (= IPI -1). De successive EOD toppe blev forenet og lineært interpoleret i faste tidsintervaller (figur 2D top, sort trace), og den øjeblikkelige EOD rente blev ligeledes interpoleret i faste tidsintervaller (figur 2D bund, lyserød spor). Den konstante tid resampling procedure letter tidssynkronisering værelem bevægelsestrajektorien og EOD-signal, og gør det muligt at udnytte fra et større antal analytiske værktøjer til tidsseriedata konstant stikprøven. EOD amplituder optaget ved de ydre elektroder forblevet konstant, mens et dyr var i hvile (Figur 2E øverst), men det varierede over tid, mens dyret flyttes grundet skiftende dipol placering og orientering (figur 2F øverst). Således kunne fisken bevægelse udledes observere ændringen af EOD amplituder over tid. Baseline-EOD forblev lav, mens fiskene var i hvile (Figur 2E nederst), men EOD rate blev signifikant højere, mens fiskene aktivt svømmede (figur 2F øverst). Vores observation er i overensstemmelse med den positive korrelation mellem EOD sats og fisk bevægelse som tidligere rapporteret 8,9,34,35.
Video trackingresultater
Dyrets bane og midlines er vist i fig ure 3E med den første og sidste billedrammer overlejret. Tidsforløbet af kropsholdning ændring blev taget, mens fisk brat vendte i to sekunder, og fisk midlines plottes hver 200 msek. Fisken midterlinjen korrekt startede på head-spids og afsluttes på halen-spidsen af fisk. Fisk billeder nøje aftalt med automatisk sporede midlines trods af skyggerne støbt af dyret. Figur 3F illustrerer tidsvarierende gennemsnit EOD sats (τ = 0,0625 sek) i farver, der er overlejret med den tid-matchede bane fisk hoved -tip. Under 2 sekunders drejning varighed nåede den gennemsnitlige EOD rate sit højdepunkt mens dyret var i midten af den drejende fase, og faldt i slutningen af drejningen. Dette repræsentativt resultat illustrerer, at vores metode med held kan anvendes til at studere forholdet mellem selvstændige guidede bevægelser og EOD rate modulation under fritsvømmende.
t "fo: keep-together.within-side =" altid ">
Figur 1. Akvarium tank og isolation kammer setup. A) Den eksperimentelle kammer består af en anti-vibration gulv, akvarium tank, og en isolation kammer. B) Akvariet tanken var opdelt i den centrale arena for at køre eksperimenter, og fire hjørne rum til boliger individuel fisk. Hvert rum er bygget vandtæt for at forhindre elektrisk forbindelse mellem dyr. C) Den motoriserede gate er illustreret på flere perspektiviske vinkler. Porten bliver vandtæt når låst af seks fløjmøtrikker der komprimerer gummipakningen (den lysebrune ark). Når låst, kan porten fjernbetjenes af servomotoren på toppen. D) Isoleringen kammer blev samlet ved at forbinde tre walle paneler og fire dørpaneler, som giver adgang til akvariet tanken fra to sider. Det nederste panel viser de træ skinner til at understøtte tanken kanter, og gulv varmelegeme placering. Et lag af aluminium mesh dækker varmelegeme til at beskytte sin elektrisk støj. E) Vægge og dørpaneler af isolation kammer blev bygget fra aluminiumsrammer til strukturel støtte (3). De indvendige overflader af kammeret er dækket af hvid plast-paneler (5) for at afspejle interne lyskilder, og udendørsbrug er dækket af sorte plast-paneler (2) for at blokere eksterne lyskilder. En aluminium mesh (1), dækker de udvendige vægge til at blokere ekstern elektrisk støj. Væggen er fyldt med akustiske glasfiber batts (4) F) Den øverste foto viser opsætning af ventilationsluften til at fjerne overskydende fugt genereres fra opvarmning. Og den nederste foto viser den vandfiltrering setup for rengøring, spreder og beluftning tank vand mellem eksperimentelsessioner. Klik her for at se større billede .
Figur 2. EOD optagelse setup og repræsentative resultater. A) Det venstre panel viser elektrodeaggregatet bestående af en tynd grafitelektrodesystemer, et kort segment af koaksial-kabel, og et BNC Jack. Det højre panel viser elektrode vedhæftede instruktioner. Afdækningstape bruges til midlertidigt at placere elektroden montage og silikone kalfatring blev anvendt til permanent at holde elektroden. B) Tilslutningsdiagrammet. To 90 ° orienterede elektroder er parret op, differentielt forstærkes og filtreres. Fire optagekanaler blev digitaliseret uden for Faraday calder. C) Illustration af EOD signalbehandlings trin. De øverste spor viser rå waveforms fra fire elektroder par, som er udbedret, og summeres for at producere den grå spor nedenfor. Unimodale kuverter er udvundet fra den grå bølgeform ved hjælp af "Root-Mean-Square" (RMS) filter (grøn trace). EOD amplituder og IPIS bestemmes af konvolutten toppe. D) tidsvarierende EOD amplituder (øverst) og den øjeblikkelige EOD rate (nederst) er vist på en længere tidshorisont end C). EOD amplituder og den øjeblikkelige sats (= IPI -1) interpoleres med regelmæssige tidsintervaller ved at deltage envelope toppe (sorte spor). E) Samme som D), men plottet på en længere tidshorisont, mens fiskene var i hvile. F) Samme som E), mens fisk var aktivt svømning. Klik her for at se større billede .
Figur 3. Video sporing opsætning og repræsentative resultater. A) belysning og kamera setup er illustreret. Den infrarøde (IR) og synlige lyskilder er fastgjort på væggene og pegede mod loftet, således at loftet overflade reflekterer og spreder lyset til projicering ensartet belysning over hele tanken. Kameraet er skjult over loftet panel for at forhindre refleksion på vandoverfladen. En IR LED er placeret på en af de fire tanke hjørner for at generere tidssynkronisering pulser. B) Generering af en sammensat baggrundsbillede illustreret. To billedfelter (billeder på toppen) er kombineret til dannelse af det sammensatte baggrundsbillede (nederst til venstre) ved at erstatte det område, der indeholder dyr (sålåg rød firkant) med regionen uden dyret (stiplet rød firkant). Område uden for den centrale arena maskeres sort (nederst til højre). C) Isolering af fisk omrids. En billedramme (øverst til venstre) subtraheres fra baggrundsbilledet (øverst til højre) for at fremstille forskellen billede (nederst til venstre), og omdannes til det binære billede (nederst til højre) ved anvendelse af en intensitet tærskel. D) Målinger af kropsstilling og kropsholdning er illustreret. Det binære billede af dyret (blob) blev drejet for at tilpasse sin hovedakse med x-aksen (øverst til højre), og centreret på sit tyngdepunkt. Den klat blev separeret til hovedet (rød) og hale (blå) dele, og hver del blev særskilt roteret til bestemmelse af dets omgivende boks. Den klat blev orienteret til dyrets referenceramme (nederst til venstre), og fem har punkter (head-end, mid-head, mid-krop, mid-hale, hale-end) blev bestemt ud fra midtpunkterne af omgivende boks kanter. E) Time-lapse imalder af fisk midlines plottet hver 200 msek. Den første og sidste billede rammer er overlejret i løbet af 2 sek drejning varighed. F) Den gennemsnitlige EOD sats er repræsenteret i pseudo-farve og overlejret med bane af fisk hoved. De samme billeder bruges som i E). Klik her for at se større billede .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Betydningen af vores teknikker. Sammenfattende vi først beskrevet konstruktionen af et stort akvarium tank og en isolation kammer at observere spontane sonderende adfærd produceret af WEF. Dernæst viste vi teknikken med at optage og spore EOD rente og bevægelsen stater fra uhæmmet fisk i realtid ved hjælp af flere elektrode par. Endelig beskrev vi den infrarøde videooptagelse teknik gennem vand i en tidssynkroniseret måde, og billedet sporingsalgoritmen at måle kropsstilling og kropsholdning. Som en eksperimentel forberedelse, WEF er en vigtig fordel for at undersøge aktive sensoriske-guidede adfærd ved at demonstrere umiddelbart kvantificerbare EOD sats, der svarer til den aktive electrosensory samplingfrekvens. Kombination af disse teknikker kan aktivere præcis og pålidelig langvarig observation 8 af spontane adfærd fra uhæmmet WEF. Endvidere kan de fleste af vores setup konstrueres frabout bredt tilgængelige byggematerialer og let kan indhentes elektroniske komponenter. De her beskrevne teknikker er blevet udviklet og testet til at opfylde vores eksperimentelle krav end de seneste år. Derfor anbefaler vi disse teknikker for fremtidige undersøgelser af spontane sonderende adfærd fra fritsvømmende WEF.
Isolation kammer. Isolationen kammer yder velkontrollerede eksperimentelle betingelser ved at blokere eksterne kilder af lys, vibrationer, lyd og elektrisk støj med varierende grader af effektivitet. Lyset blokerende ydeevne blev testet ved at placere en motoriseret kamera inde i den mørke isolation kammer, og ingen ekstern lys lækage blev observeret fra kameraet efter at scanne alle steder ved hjælp af fjernbetjening pan kontrol. Det vibrationsdæmpende overflade monteret under tanken forudsat dæmpning mod ydre vibrationer kanaliseret fra gulvet, og stabling af flere gummi og skum lag var effektiv til at blokere de flesteekstern vibration begivenheder. , Intermitterende vibrationer begivenheder såsom højt dørlukning på nærliggende steder gjorde dog udløse nyhed reaktioner i sjældne tilfælde. Selv om en anti-vibration luft bord kunne levere overlegen isolation ydelse fra baggrunden vibrationer, ville det være uoverkommeligt dyrt at købe en luft tabel store nok til vores akvarium tank. Derfor placerede vi en hydrofon vandet for at opdage og udelukke hændelser, når store eksterne vibrationer udløst nyhed svar. For yderligere at minimere indflydelsen af støj uden for laboratoriet blev vores eksperimenter udført i løbet af off-peak timer (efter 6 pm). Tilsvarende blev ekstern luftbåren akustisk støj dæmpes via isolation kammervæggene fyldt med glasfiber batts isolering. Selv om vi ikke objektivt kvantificere lyddæmpning ydeevne, var det meste af baggrunden lyd i et laboratorium miljø ikke udløse nyhed svar. I sjældne tilfælde, en pludselig høj lyd udefra triggered en nyhed reaktion, men en sådan begivenhed blev registreret af hydrofon optagelse, og de sjældent opstod under off-peak timer. Akvariet beholder leveres tilstrækkeligt stort område for vores dyr til frit at svømme og udforske. Tanken størrelse blev valgt i forhold til længden af arter, vi anvendte (op til 30 cm), men tanken størrelse kan skaleres ned, hvis der blev anvendt mindre dyr. Vi valgte Gymnotus sp. mellem forskellige puls-type arter for deres store kranie størrelse for at lette elektrofysiologiske optagelser under fritsvømmende 36.. Den elektriske optagekvalitet kan forbedres fra at bruge mere kostbare kobber masker, og afskærmning udstødningsgas ventilator bruges til fugtstyring.
EOD måleteknik. Vores multi-kanal EOD optagelse teknik tilladte præcise og pålidelige EOD timing måling fra svømning frit fisk. Ved hjælp af vores teknik blev alle EOD pulser som frit svømme WEF opdaget uden mangler eller tilføje en syndgle puls for en seks timers lang optagelse varighed (se figur 12 i Jun et al. 8). EOD optagelse foranstaltninger ikke blot EOD sats, men også aktivitetsniveauet fra den tidsvarierende EOD spidsamplituder optaget ved de ydre elektroder. De indspillede EOD amplituder bestemmes af den relative geometri mellem et dyr og registreringselektroderne dermed dyrevandringer fremkalde ændringer i EOD amplituder (figur 2F). Aktivitetsniveauet blev beregnet af variabiliteten (RMS) af EOD amplitude skråning i et bevægeligt vindue (0,5 sek.) Ved hjælp af denne metode, ville videooptagelse ikke påkrævet for at måle aktiviteten niveau over en lang periode, og EOD optagelse alene kan være tilstrækkeligt. I stedet for at bruge en video-optagelse, kan kroppen position og kropsholdning af WEF udledes EOD optagelse alene baseret på elektroderne steder, geometrien af en tank, og en teoretisk model af en aktuel dipol. Ved hjælp af en lignende recording setup, Jun et al. 20 foreslået en real-time elektrisk sporing metode til sporing af flere WEFs i tilstedeværelse af et objekt, som sammenligner målte signal intensiteter på flere optagelse elektrode par med Opslagstabelfiltre indgange, der indeholder forudsagte signalintensiteter på kendte aktuelle dipol steder. Den elektriske sporingsmetode giver forbedret sporing pålidelighed i en visuelt rodet miljø, hvor dyrene ofte bliver blokeret fra visning eller under sporing af flere dyr. WEF er naturalistiske levesteder indeholder mange visuelle forhindringer såsom vandplanter og rødder, hvor den elektriske sporing metode kan give mere pålidelig sporing med enklere setup krav end visuel sporing. I princippet vores metode er direkte anvendelse på bølge-type WEF arter efter skiftende filter tidskonstanter. Berigtigelse skridt vil introducere to tilstande pr EOD cyklus, da EOD bølgeform er tilnærmelsesvis sinusformet i bølge-type arter. I dette tilfælde, Kan den øjeblikkelige EOD sats bestemmes ved at springe hver anden EOD tidsmarkeringer at ignorere den negative EOD fase. WEF kan registrere registreringselektroderne når de svømmer i nærheden, og dermed undgik vi at bruge store eller metalliske elektroder, der kan sanses fra længere væk 37, og i stedet brugt tynde grafitelektroder (2 mm diameter). Tyndere koaksialkabler (RG-174) blev anvendt med elektrodeenhederne for fleksibilitet, men tykkere koaksialkabler (RG-54) blev anvendt til ledningsføring over længere afstande for overlegen elektrisk afskærmning. Længere EOD optagelse varighed kan opnås ved at sænke samplingfrekvens, men på et lavere tidslige opløsning som et trade-off. Den gennemsnitlige og variabilitet af EOD varierer mellem arterne, og dermed den tid, vinduet til udjævning den øjeblikkelige EOD sats skal justeres korrekt. Der anbefales en kortere tidsvindue for arter med kortere middelværdi og mindre variation i IPIS (f.eks Gymnotiforms), og en længere tid window anbefales til arter med længere middelværdi og højere variation i IPIS (f.eks Mormyrids).
Lys og kamera setup. Videooptagelser giver kvantitative og kvalitative observationer af adfærd, og her vi beskrev procedurerne for etablering, registrering og behandling af billeddata. Belysning setup spiller en vigtig rolle i at producere billeder af høj kvalitet, og det lys projektion vinkel er en vigtig faktor til billeddannelse undersøiske dyr. Under suboptimale lysforhold kan vandoverfladen danner glares og refleksioner, som kan forstyrre billedet sporing, især når dyrene generere overflade bølger. De genskær problemer kan elimineres ved at projicere lyskilder fra bunden af en tank. For en lille tank, kan arrays af LED placeres direkte under beholderen og skinne igennem en diffuser panel til at generere ensartet lysstyrke 38. Tilsvarende for en større tank, en lyskilde cen placeres under tanken, og ensartet lysintensitet kan opnås ved at tillade tilstrækkelig afstand til let at diffundere 39.. I vores setup, var vi tvunget til at projicere lys fra oven tanken på grund af pladsmangel, strukturel stabilitet og varmelegemet placering under beholderen. Vi undgik blænding og refleksion problemer ved hjælp af indirekte belysning, således at lyskilderne blev fremskrevet mod loftet. Ved at gøre den øverste del af kammeret konturløse og mat hvid reflekser var synlige på vandoverfladen. Til billedet hele centrale arena, en vidvinkel linse kan monteres på kameraet, men nogle objektiver (fiskeøje linse) kan forårsage betydelige tønde forvrængning. Den tøndeforvrængning kan korrigeres ved hjælp af en kalibrering gitter ark nedenunder tanken at måle pixel koordinater gitter steder set på tankens center. Sammen med de tilsvarende gitter steder i centimeter, kan en transformation matrix beregnes til at samarbejderrect tønde forvrængning 40.. Vi anbefaler høj opløsning kameraer, hvis et dyr størrelse er meget mindre end tankens størrelse, således at tilstrækkeligt antal pixels kan fås fra dyret til korrekt måle sin kropsholdning.
Billede tracking og tid synkronisering. Billedet sporingsalgoritmen beskrevet her gør brug af region af interesse (ROI) drift til hurtigt at måle kropsstilling og kropsholdning. Drift ROI reducerer billedstørrelsen, der skal behandles, og begrænser tracking rækkevidde nær dyret placering fra den forrige ramme. Vi udvindes kropsholdning (midterlinjen) ved hjælp af rotering og omgivende boks operationer i stedet for den sædvanlige billede skeletonization operation, hvilket undertiden har undladt at producere en veldefineret enkelt midterlinjen. Dyrets referenceramme var placeret i midten af hovedet omgivende boks, som tillader egocentrisk adfærdsanalyse. Den største kilde til fejl i billedet tracking skyldtes den optiske projektion effekt ved en bred vinkel. Ideelt set bør dyrets lodrette bevægelser ikke påvirke 2D målepositionen, men jo længere væk fra den centrale billeddannende akse, er den større del af den vertikale dimension projiceres på kameraet. Den brydning ved vandoverfladen reducerede den optiske projektion effekt med 28% i vores imaging setup (kamera højde = 1,8 m, vanddybde = 10 cm, beholder radius = 75 cm), og den værste position fejl var ± 1,4 cm på den cirkulære hegn. Timingen mellem EOD og videooptagelser blev synkroniseret ved hjælp af infrarøde LED impulser til at redegøre for den tid, afdrift mellem video og signalet til digitalisering ure, og forskellige start optagelse tidspunkter. Den forventede usikkerhed i den tid synkronisering mellem video-og EOD optagelser er proportional med frame capture interval, for eksempel 15 frames per sekund (fps) frame capture rate vil resultere i tidsjusteringen usikkerhed på ± 33 msek. En sådan grad af time præcision er tilstrækkelig til sporing langsommere bevægende fisk, men kan være påkrævet et high-speed kamera til sporing hurtigere bevægelige dyr. Vi anbefaler lysere lysintensitet med en øget frame rate, da sensoren eksponeringstid er omvendt proportional med billedfrekvensen.
Det fremtidige arbejde. Sociale interaktioner mellem flere WEFs kan studeres ved at spore deres EOD-signaler og krop steder, og tracking system skal korrekt associere EOD med placeringen af det samme individ. Ifølge fremgangsmåden beskrevet af 20 a ved hjælp af lignende opsætning juni et al. Dipol lokalisering metode dyret steder udledes af deres EOD signaler modtaget på flere elektroder kan matches til den visuelle sporing output for korrekt at identificere EOD impulser fra forskellige individer. Billede sporing af flere dyr kan udføres én person ad gangen ved hjælp ROI drift. En ROI kan indledningsvis defineres omkring en person tilspores, og ROI vil blive omplaceret på hver ramme med en opdateret kropsstilling. De andre fisk vil blive udelukket fra billedet sporing analyse, når det vises uden for ROI, og hvis optrådte inde, kan de andre fisk image fjernes automatisk ved at kontrollere, om dens billede rører ROI grænse. Nogle gange, kan du kontakte to dyr hinanden, og deres billeder fusionere, og hvis ja, kan en maske manuelt trækkes for at adskille de andre fisk image. En anden interessant fremtidige arbejde er den tre-dimensionelle video sporing for at afsløre indviklede bevægelsesforløb under byttefangst 22 eller sociale interaktioner. MacIver et al. 22, der bruges to kameraer at se en rektangulær akvarium tanken fra toppen og fra siden til at rekonstruere et tredimensionalt legeme model. Dog ville denne fremgangsmåde ikke virker i vores tilfælde, da der er skillevægge, der blokerer side visninger og akvariet har meget større bredde end dybde. I stedet ville det være mere anvenkabel til at installere flere kameraer på loftet på forskellige perspektiv vinkler ligner opsætningen brugt af Hedrick 41. For større nøjagtighed, ville det refraktive effekt indført ved vandet og skrå kameravinkel skal rettes ved at kalibrere billeder i tre dimensioner. Vores visuel sporing metode kan anvendes til at studere den elektriske billede flow på fisk kropsoverflade 42,43 når fiskene svømmer i nærheden et objekt. Som undersøgt af Hofmann et al. 26., ville det være interessant at undersøge objektets elektriske billede flow i løbet af fritsvømmende afhængigt af objektets afstand, form, størrelse og materiale. I sidste ende kan vores metoder kombineret med neurale optagelser fra svømning frit fisk 44-46 afslører nye indsigter ved observationer af ændringer i neurale aktivitet og EOD rate mens fisken engagerer sig i objekt udforskning eller sociale interaktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde var generøst støttet af naturvidenskab og teknik Forskningsråd Canada (NSERC) og den canadiske Institutes of Health Research (CIHR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aquarium Construction | |||
| Electrically shielded floor heater | ThermoSoft Corp., IL, USA | ThermoTile | www.thermosoft.com |
| Tempered glass panel | generic | 0.5 in thick, used for the aquarium construction | |
| Aquarium grade silicone | generic | ||
| Acrylic sheet | generic | 0.25 in thick, matte white | |
| Natural rubber sheet | generic | 0.25 in thick | |
| Servomotor | HTECHRCD Inc., Korea | HS-325HB, 180deg rotation | www.servocity.com |
| Servomotor arm mount | HITECHRCD Inc., Korea | 56362 Large Spline | www.servocity.com |
| Servomotor controller (6 channels) | Sparkfun | ROB-09664 | Micro Maestro 6-channel USB Servo Controller |
| Active USB extension cable | C2G | 38990 | 12 m USB 2.0 A Male to A Female 4-Port Active Extension Cable |
| Exhaust fan | Nutone | ILFK120 | www.homedepot.com |
| Vertical aquarium filter | Tetra, Germany | Whisper Internal Power Filter - 40i | |
| Crushed coral | Used to increase the pH of the tank water | ||
| EOD Recording Setup | |||
| Graphite Electrodes | Staedtler, Germany | Mars Carbon 2-mm type HB | Shave the outer coating |
| Physiological Amplifier/Filter | Intronix, Canada | 2015F | |
| Coaxial Cable | generic | RG174 | For electrodes assembly |
| Coaxial Cable | generic | RG54 | For wiring use |
| BNC jack connector for RG-174 | Amphenol Connex | 112160 | For electrodes assembly |
| BNC plug connector for RG-54 | Amphenol Connex | 112116 | For wiring use |
| Signal digitizer hardware | Cambridge Electronic Design, UK | Power MKII 1401 | |
| Signal digitizer software | Cambridge Electronic Design, UK | Spike 2. ver 7 | |
| Visual Tracking Setup | |||
| White LED light | IKEA, Sweden | DIODER 201.194.18 | www.ikea.com |
| Infrared LED light (850 nm) | Scene Electronics, China | S8100-60-B/C-IR | Remove built-in fan |
| USB webcam | Logitech Inc., CA, USA | C910 | Remove Infrared blocking filter |
| Motorized camera | Logitech Inc., CA, USA | Quickcam Orbit | Remove Infrared blocking filter |
| Video recording software | Logitech Inc., CA, USA | Logitech Quickcam Software | Download from www.logitech.com |
| MATLAB | Mathworks, MA, USA | 2012a | Image processing toolbox |
References
- Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat. Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., De Lecea, L. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature. 450 (7168), 420-424 (2007).
- Naumann, E. A., Kampff, A. R., Prober, D. A., Schier, A. F., Engert, F. Monitoring neural activity with bioluminescence during natural behavior. Nat. Neurosci. 13 (4), 513-520 (2010).
- Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8 (2), 147-152 (2011).
- Mavoori, J., Millard, B., Longnion, J., Daniel, T., Diorio, C. A miniature implantable computer for functional electrical stimulation and recording of neuromuscular activity. In IEEE international workshop on biomedical circuits and systems (BioCAS) 2004; Session: Functional Electrical Stimulators and Related Sensing Techniques. , (2004).
- Harrison, R. R., Fotowat, H., Chan, R., Kier, R. J., Olberg, R., Leonardo, A., Gabbiani, F. Wireless neural/EMG telemetry systems for small freely moving animals. IEEE TBioCAS. 5 (2), 103-111 (2011).
- Jun, J. J., Longtin, A., Maler, L. Precision measurement of electric organ discharge timing from freely moving weakly electric fish. J. Neurophys. 107 (7), 1996-2007 (2012).
- Forlim, C. G., Pinto, R. D. Noninvasive Realistic Stimulation/Recording of Freely Swimming Weakly Electric Fish: Movement Detection and Discharge Entropy to Infer Fish Behavior. , (2012).
- Caputi, A. A., Aguilera, P. A., Castelló, M. E. Probability and amplitude of novelty responses as a function of the change in contrast of the reafferent image in G. carapo. J. Exp. Biol. 206 (6), 999-1010 (2003).
- Pluta, S. R., Kawasaki, M. Multisensory enhancement of electromotor responses to a single moving object. J. Exp. Biol. 211 (18), 2919-2930 (2008).
- Heiligenberg, W. Electrolocation and jamming avoidance in a Hypopygus (Rhamphichthyidae, Gymnotoidei), an electric fish with pulse-type discharges. J. Comp. Phys. A. 91 (3), 223-240 (1974).
- Capurro, A., Malta, C. P. Noise autocorrelation and jamming avoidance performance in pulse type electric fish. Bull. Math. Biol. 66 (4), 885-905 (2004).
- Post, N., von der Emde, G. The "novelty response" in an electric fish: response properties and habituation. Phys. Behav. 68 (1), 115-128 (1999).
- Toerring, M. J., Serrier, J. Influence of water temperature on the electric organ discharge (EOD) of the weakly electric fish Marcusenius cyprinoides (Mormyridae). J. Exp. Biol. 74 (1), 133-150 (1978).
- Ardanaz, J. L., Silva, A., Macadar, O. Temperature sensitivity of the electric organ discharge waveform in Gymnotus carapo. J. Comp. Phys. A. 187 (11), 853-864 (2001).
- Rodríguez-Cattaneo, A., Pereira, A. C., Aguilera, P. A., Crampton, W. G., Caputi, A. A. Species-specific diversity of a fixed motor pattern: the electric organ discharge of Gymnotus. PLoS One. 3 (5), (2008).
- Bennett, M. V. L. Fish physiology. Hoar, W. S., Randall, D. J. , Academic Press. NY. 493-574 (1971).
- Wong, C. J. Afferent and efferent connections of the diencephalic prepacemaker nucleus in the weakly electric fish, Eigenmannia virescens: interactions between the electromotor system and the neuroendocrine axis. J. Comp. Neurol. 383 (1), 18-41 (1997).
- Jun, J. J., Longtin, A., Maler, L. Real-time localization of moving dipole sources for tracking multiple free-swimming weakly electric fish. PLoS One. 8 (6), (2013).
- Rasnow, B., Assad, C., Hartmann, M. J., Bower, J. M. Applications of multimedia computers and video mixing to neuroethology. J. Neuro. Methods. 76 (1), 83-91 (1997).
- MacIver, M. A., Nelson, M. E. Body modeling and model-based tracking for neuroethology. J. Neuro. Methods. 95 (2), 133-143 (2000).
- Douglas, R. H., Hawryshyn, C. W. Behavioral studies of fish vision: an analysis of visual capabilities. In The Visual System of Fish. Douglas, R., Djamgoz, M. , Chapman & Hall. London. 373-418 (1990).
- Ciali, S., Gordon, J., Moller, P. Spectral sensitivity of the weakly discharging electric fish Gnathonemus petersi using its electric organ discharges as the response measure. J. Fish Biol. 50 (5), 1074-1087 (1997).
- Ratledge, D. An Introduction to Webcam Imaging. Digital Astrophotography: The State of the Art. , 31-44 (2005).
- Hofmann, V., Sanguinetti-Scheck, J. I., Gómez-Sena, L., Engelmann, J. From static electric images to electric flow: Towards dynamic perceptual cues in active electroreception. J. Phys. Paris. 107, 95-106 (2013).
- Castelló, M. E., Aguilera, P. A., Trujillo-Cenóz, O., Caputi, A. A. Electroreception in Gymnotus carapo: pre-receptor processing and the distribution of electroreceptor types. J. Exp. Biol. 203 (21), 3279-3287 (2000).
- Caputi, A. A., Castelló, M. E., Aguilera, P., Trujillo-Cenóz, O. Electrolocation and electrocommunication in pulse gymnotids: signal carriers, pre-receptor mechanisms and the electrosensory mosaic. J. Phys. 96 (5), 493-505 (2002).
- Pusch, R., et al. Active sensing in a mormyrid fish: electric images and peripheral modifications of the signal carrier. J. Exp. Biol. 211 (6), 921-934 (2008).
- Harder, W. Die beziehungen zwischen elektrorezeptoren, elektrischem organ, seitenlinienorganen und nervensystem bei den Mormyridae (Teleostei, Pisces). Z. Vgl. Physiol. 59 (3), 272-318 (1968).
- Bacelo, J., Engelmann, J., Hollmann, M., Gvonder Emde,, Grant, K. Functional foveae in an electrosensory system. J. Comp. Neurol. 511 (3), 342-359 (2008).
- Hollmann, M., Engelmann, J., Von Der Emde, G. Distribution, density and morphology of electroreceptor organs in mormyrid weakly electric fish: anatomical investigations of a receptor mosaic. J. Zool. 276 (2), 1469-7998 (2008).
- Knudsen, E. I. Spatial aspects of electric fields generated by weakly electric fish. J. Comp. Phys. 99 (2), 103-118 (1975).
- Kramer, B. Spontaneous discharge rhythms and social signalling in the weakly electric fish Pollimyrus isidori (Cuvier et Valenciennes) (Mormyridae, Teleostei). Behav. Ecol. Sociobiol. 4 (1), 66-74 (1978).
- Stoddard, P. K., Markham, M. R., Salazar, V. L., Allee, S. Circadian rhythms in electric waveform structure and rate in the electric fish Brachyhypopomus pinnicaudatus. Physiol. Behav. 90 (1), 11-20 (2007).
- Canfield, J. G. Methods for chronic neural recording in the telencephalon of freely behaving fish. J. Neurosci. Methods. 133 (1-2), 127-134 (2004).
- Chen, L., House, J. L., Krahe, R., Nelson, M. E. Modeling signal and background components of electrosensory scenes. J. Comp. Physiol. A. 191 (4), 331-345 (2005).
- Emran, F., Rihel, J., Dowling, J. E. A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities. J. Vis. Exp. (20), (2008).
- Windsor, S. P., Tan, D., Montgomery, J. C. Swimming kinematics and hydrodynamic imaging in the blind Mexican cave fish (Astyanax fasciatus). J. Exp. Biol. 211 (18), 2950-2959 (2008).
- Shapiro, L. G., Stockman, G. C. Computer vision. , Prentice Hall. Upper Saddle River, NJ. 367-368 (2001).
- Hedrick, T. L. Software techniques for two- and three-dimensional kinematic measurements of biological and biomimetic systems. Bioinsp. Biomim. 3 (3), 034001 (2001).
- Babineau, D., Lewis, J. E., Longtin, A. Spatial acuity and prey detection in weakly electric fish. PLoS Comp. Biol. 3 (3), (2007).
- Sanguinetti-Scheck, J. I., Pedraja, E. F., Cilleruelo, E., Migliaro, A., Aguilera, P., Caputi, A. A., Budelli, R. Fish geometry and electric organ discharge determine functional organization of the electrosensory epithelium. PLoS One. 6 (11), (2011).
- Castello, M. E., Caputi, A., Trujillo‐Cenóz, O. Structural and functional aspects of the fast electrosensory pathway in the electrosensory lateral line lobe of the pulse fish Gymnotus carapo. J. Comp. Neurol. 401 (4), 549-563 (1998).
- Canfield, J. G., Mizumori, S. J. Y. Methods for chronic neural recording in the telencephalon of freely behaving fish. J. Neurosci. Methods. 133 (1), 127-134 (2004).
- Pereira, A. C., Centurión, V., Caputi, A. A. Contextual effects of small environments on the electric images of objects and their brain evoked responses in weakly electric fish. J. Exp. Biol. 208 (5), 961-972 (2005).
