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Neuroscience

A lungo termine comportamentale inseguimento di Liberamente Nuoto debolmente elettrico Pesce

doi: 10.3791/50962 Published: March 6, 2014

Summary

Descriviamo un insieme di tecniche per studiare il comportamento spontaneo di nuotare liberamente pesci debolmente elettrica per un periodo prolungato di tempo, in modo sincrono i misurando temporizzazione di scarico organo elettrico dell'animale, la posizione del corpo e la postura sia preciso e affidabile in un acquario appositamente progettato all'interno di un sensoriale camera di isolamento.

Abstract

Monitoraggio del comportamento a lungo termine in grado di catturare e quantificare comportamenti animali naturali, comprese quelle che si verificano di rado. Comportamenti come l'esplorazione e le interazioni sociali possono essere meglio studiate osservando sfrenato, gli animali si comportano liberamente. Pesci elettrici debolmente (WEF) di visualizzazione esplorativa facilmente osservabili e comportamenti sociali emettendo organo scarica elettrica (EOD). Qui, descriviamo tre tecniche efficaci per misurare in modo sincrono la EOD, posizione del corpo, e la postura di un WEF nuoto libero per un periodo di tempo prolungato. In primo luogo, si descrive la costruzione di un serbatoio sperimentale all'interno di una camera di isolamento progettato per bloccare fonti esterne di stimoli sensoriali come luce, suono e vibrazioni. L'acquario è stato suddiviso per ospitare quattro provini e porte automatiche controllare a distanza l'accesso degli animali per l'arena centrale. In secondo luogo, si descrive un metodo di misurazione di temporizzazione EOD in tempo reale, preciso e affidabile da banche di nuoto WEF. Distorsioni di segnale causate dai movimenti del corpo dell'animale sono corretti da media spaziale e fasi di lavorazione temporali. In terzo luogo, si descrive una configurazione subacquea di imaging nel vicino infrarosso per osservare i comportamenti degli animali notturni imperturbati. Impulsi di luce infrarossa sono stati usati per sincronizzare la temporizzazione tra il video e il segnale fisiologico per una durata di registrazione lunghi. Il nostro software di monitoraggio automatizzato di misura la posizione del corpo dell'animale e la postura in modo affidabile in una scena acquatica. In combinazione, queste tecniche consentono osservazione lungo termine del comportamento spontaneo di nuotare liberamente pesci debolmente elettrica in modo affidabile e preciso. Crediamo che il nostro metodo può essere applicato in modo simile allo studio di altri animali acquatici rapportando loro segnali fisiologici con comportamenti esplorativi o sociali.

Introduction

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Sfondo. Esperienze quantitative sul comportamento animale (ad esempio scelta forzata, shock evitamento, T-labirinto, ecc.) Sono tipicamente utilizzati per studiare ipotesi specifiche riguardanti le abilità senso-motorie, di apprendimento e di formazione della memoria. Tuttavia, questi esperimenti restrittive perdere gran parte della ricchezza del comportamento animale naturale e sono suscettibili di tradursi in modelli semplificate del sottostante basi neurali del comportamento. Esperimenti in condizioni più naturalistiche sono quindi un complemento importante con il quale possiamo esplorare più a fondo un repertorio comportamentale specie. Esperimenti su animali liberi di muoversi, tuttavia, devono affrontare sfide tecniche uniche come artefatti di registrazione indotti dal movimento. A differenza di risposte stimolo-evocato, che si verificano spontaneamente il comportamento esplorativo non può essere previsto; quindi soggetti sperimentali devono essere costantemente monitorati e tracciati per un periodo di tempo prolungato. Domande di ricerca specifiche can essere meglio affrontati da organismi accuratamente selezionati e gli strumenti tecnici disponibili. Ad esempio, la registrazione e la stimolazione tecniche ottiche come sensori di calcio geneticamente codificato 1 e optogenetics 2 sono state applicate con successo per muoversi liberamente organismi modello genetiche 3-5. In alternativa, sistemi di telemetria neurali miniaturizzati in grado di registrare e stimolare lo spostamento piccoli animali 6,7 liberamente.

Pesci elettrici. Specie WEF generano scariche elettriche organi (EOD), che consentono loro di percepire le loro immediate vicinanze o di comunicare su distanze maggiori. Pattern temporali di EOD variano in condizioni diverse, come auto-movimenti 8,9, stimoli sensoriali 10,11, 12,13 e le interazioni sociali. Pulse-specie tipo WEF producono un treno di impulsi discreti, a differenza delle specie di onda di tipo che generano forme d'onda quasi-sinusoidale continuo. In generale, di tipo impulsivo specie mostra more tasso variabile EOD rispetto alle specie d'onda di tipo e tassi EOD animali riflettere molto attentamente il contenuto della novità del loro ambiente sensoriali 10,14. Specie Pulse-tipo possono ridurre immediatamente l'intervallo tra impulsi (IPI) all'interno di un singolo ciclo di impulso in risposta a una perturbazione sensoriale romanzo (risposta novità 10,11,14). Il comportamento elettrico continuo di questi pesci può essere turbato da stimoli sensoriali incontrollate provenienti da fonti esterne, e diversi tipi di stimoli come vibrazione, suono, luce, e la luce sono noti risposte novità di trigger. Pertanto, speciali precauzioni devono essere adottate per bloccare o attenuare gli stimoli sensoriali esterni durante un'osservazione a lungo termine di nuotare liberamente WEF. In questo modo, variazioni della frequenza EOD e traiettorie di movimento possono essere specificamente attribuiti a stimoli presentati dallo sperimentatore.

Acquario serbatoio e camera di isolamento. Abbiamo quindi messo più strati di materiali ad assorbimento delle vibrazioni under un grande acquario (2,1 mx 2,1 mx 0,3 m), e circondato il serbatoio con un involucro isolante per bloccare le fonti esterne di luce, rumore elettrico, il suono e flusso di calore. Tasso EOD dipende dalla temperatura circostante 15,16, quindi la temperatura dell'acqua è strettamente regolata in un intervallo tropicale (25 ± 1 ° C) per le specie Sudamericana WEF. Abbiamo costruito un ampio e poco profondo (10 cm Profondità acqua) serbatoio per osservare i comportamenti esplorativi spaziali del WEF principalmente ristrette in due dimensioni (Figura 1A). Il serbatoio è stato ripartito in un'arena centrale di osservare i comportamenti spaziali, e quattro scomparti d'angolo per ospitare separatamente singoli pesci (Figura 1B). Ogni scompartimento è stato costruito a tenuta stagna per impedire la comunicazione elettrica tra gli individui. Accesso animali all'arena centrale è stato controllato dall'esterno da quattro porte motorizzate. I cancelli sono stati collocati tra i compartimenti, e divennero stagna quando è bloccatoda nylon ala-noci. L'assenza di parti metalliche sono stati usati sott'acqua dal WEF reagiscono sensibilmente ai metalli.

Registrazione EOD. EOD vengono generati in maniera stereotipata per l'attivazione di un singolo (in Mormiridi) o più organi elettrici spazialmente distribuiti (in Gymnotiforms) 17,18. Modulazioni temporali del tasso di EOD possono rivelare attività neurali di livello superiore, dal momento che il pacemaker midollare riceve gli input neurali diretti da regioni cerebrali superiori, come il nucleo prepacemaker diencefalica, che a sua volta riceve le proiezioni assonale dal prosencefalo 19. Tuttavia, i tempi EOD deve essere accuratamente estratta da una registrazione della forma d'onda prima e non polarizzato da distorsioni indotti dal movimento dell'animale. Il campo elettrico generato da un WEF può essere approssimato come un dipolo; quindi EOD ampiezze di impulso a elettrodi di registrazione dipendono dalle distanze relative e orientamenti tra l'animale e gli elettrodi 8,20. Self-movem di Animalgenitori cambiano la geometria relativa tra l'animale e gli elettrodi, così spostamenti causano le ampiezze EOD a diversi elettrodi a variare nel tempo in modo volatile (vedere la Figura 2B Giu et al. 8). Inoltre, l'auto-movimenti cambiano anche la forma delle forme d'onda registrate EOD, perché i contributi relativi da diverso insieme di organi elettrici dipendono dalle loro posizioni lungo la lunghezza del corpo e le loro curvature locali introdotta dalla coda flessione. Le distorsioni indotti dal movimento delle ampiezze e forme EOD possono portare a misure temporanee EOD imprecise e inaffidabili. Abbiamo superato questi problemi spazialmente media di forme d'onda multiple EOD registrate in luoghi diversi, e con l'aggiunta di un filtro di estrazione busta di determinare con precisione la tempistica EOD da un WEF nuotare liberamente. Inoltre, la nostra tecnica misura le ampiezze EOD, che indicano se un animale è a riposo o in movimento attivamente in base alla variazione della EODampiezze nel tempo (vedi figure 2E e 2F). Abbiamo registrato segnali differenziale amplificati dalle coppie di elettrodi di registrazione per ridurre il rumore di modo comune. Poiché gli impulsi EOD vengono generati a intervalli di tempo irregolari, l'evento time-series EOD hanno una frequenza di campionamento variabile. La serie temporale EOD può essere convertito in una frequenza di campionamento costante mediante interpolazione se richiesto da uno strumento analitico di scelta.

La registrazione del video. Sebbene la registrazione EOD può monitorare un'attività movimento lordo di un animale, registrazione video consente misurazioni dirette della posizione del corpo di un animale e la postura. Vicino infrarosso (NIR) illuminazione (λ = 800 ~ 900 nm) consente l'osservazione visiva imperturbabile di nuotare liberamente pesci 21,22, dal momento che WEFs sono più attivi nelle tenebre ei loro occhi non sono sensibili alle NIR dello spettro 23,24. La maggior parte dei sensori di immagini digitali (ad esempio, CMOS o CCD) in grado di acquisire spettro NIR con il wavelengtgamma h tra 800-900 nm, dopo aver rimosso una connessione a infrarossi (IR) bloccando il filtro 25. Alcuni webcam consumer di fascia alta offrono alta definizione, ampio angolo di visualizzazione e una buona sensibilità low-light, che può produrre una qualità d'immagine paragonabile o superiore al livello professionale telecamere IR disponibili a costi molto maggiori. Inoltre, alcune webcam consumer-grade sono in bundle con software di registrazione che permette una durata di registrazione esteso da comprimere il video senza perdita di qualità. La maggior parte delle fotocamere di livello professionale offrono sincronizzazione TTL uscite impulsi di tempo o ingressi impulsi TTL grilletto 26 per allineare i tempi tra il video con i segnali digitalizzati, ma questa caratteristica è generalmente assente in webcam consumer-grade. Tuttavia, i tempi tra una registrazione video e un digitalizzatore segnale può essere abbinato con precisione da concomitanza acquisizione di un IR periodicamente LED lampeggiante con la fotocamera e il digitalizzatore segnale. La sincronizzazione degli impulsi IR iniziale e finale può essere utilizzato uns due marcatori di calibrazione di tempo per convertire i numeri di fotogramma video l'unità di tempo segnale digitizer e viceversa.

Lighting & background. Cattura di immagini attraverso l'acqua può essere tecnicamente impegnativo a causa dei riflessi della luce sulla superficie dell'acqua. La superficie dell'acqua può agire come uno specchio per riflettere una scena visiva sopra l'acqua, e caratteristiche visive oscure subacqueo; quindi la scena di sopra dell'acqua deve essere reso featureless per evitare interferenza visiva. Per l'intera immagine acquario, una telecamera deve essere posizionato direttamente sopra l'acqua, e dovrebbe essere nascosto dietro il soffitto sopra un piccolo foro visualizzazione per impedire la sua riflessione sulla superficie dell'acqua. Inoltre, la superficie dell'acqua può produrre riflessi e illuminazione non uniforme se le sorgenti luminose sono proiettati in modo errato. Illuminazione indiretta può ottenere una luminosità uniforme su tutta acquario puntando le fonti di luce verso il soffitto, in modo tale che il soffitto e il wal circostantels può riflettere e diffondere i raggi di luce prima di raggiungere la superficie dell'acqua. Scegliere un illuminatore IR che corrisponde a una risposta spettrale della fotocamera (ad esempio 850 nm di lunghezza d'onda di picco). Il rumore elettrico dalle fonti di luce può essere minimizzato utilizzando luci a LED e piazzare i loro alimentatori in corrente continua al di fuori della gabbia di Faraday. Posizionare uno sfondo bianco sotto il serbatoio, dal pesce contrasta bene in uno sfondo bianco a lunghezze d'onda NIR. Analogamente, l'uso di colore bianco opaco sulle superfici interne della camera di isolamento fornisce uniforme e luminoso retroilluminazione.

Monitoraggio video. Dopo una registrazione video, un algoritmo di inseguimento automatico immagine può misurare posizioni e posture del corpo dell'animale nel tempo. Il monitoraggio video può essere eseguita automaticamente da una software pronto per l'uso (Viewpoint o Ethovision), o il software programmabile dall'utente (OpenCV o MATLAB Processing Toolbox Image). Come primo passo di inseguimento immagine,un'area inseguimento valido deve essere definito disegnando una forma geometrica di escludere l'area esterna (funzionamento mascheratura). Successivamente, l'immagine di un animale deve essere isolato dal contesto sottraendo un'immagine di sfondo da un'immagine contenente l'animale. L'immagine sottratta viene convertito in un formato binario applicando una soglia di intensità, in modo tale che il baricentro e l'asse di orientamento possono essere calcolate dalle operazioni morfologiche binarie. In Gymnotiforms 27-29 e 30-32 Mormiridi, la densità electroreceptor è il più alto vicino alla regione della testa, quindi la posizione della testa in qualsiasi momento, indica una posizione di massima acutezza sensoriale. Le posizioni di testa e di coda possono essere determinate automaticamente applicando le operazioni di rotazione dell'immagine e del riquadro di delimitazione. Le estremità di testa e di coda possono essere distinti l'uno dall'altro da essi definendo manualmente nel primo frame, e tenendo traccia delle rispettive posizioni dal confronto di due quadri successivi.

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Protocol

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Questa procedura è conforme ai requisiti della Università di Ottawa Comitato Animal Care. Nessun conflitto di interessi è dichiarato. Si prega di fare riferimento alla Tabella dei Materiali e reagenti per le marche e modelli di attrezzature e materiali elencati di seguito. Sono forniti scritte personalizzate Spike2 e MATLAB script e dati di esempio nel file supplementare.

1. Acquario serbatoio e isolamento Camera Setup

  1. Anti-v piano ibration. Costruire una superficie anti-vibrazione (2,1 mx 2,1 m) impilando tamponi in gomma, polistirolo acustico, pannello di compensato marino e cuscinetti in schiuma di poliuretano dal basso verso l'alto (Figura 1A). Lay quattro perni di legno (5 cm x 10 cm) sul pannello compensato per sostenere i bordi della vasca acquario.
  2. Riscaldamento a pavimento. Posare un elemento di riscaldamento schermato elettricamente oltre classificato termicamente imbottitura in schiuma (vedi Figura 1D in basso). Coprire l'elemento riscaldante con un metallolic maglia di schermatura elettrica.
  3. Serbatoio spaziale. Costruire un ampio e poco profondo acquario (1.8 mx 1.8 mx 30 cm) con 1,3 centimetri di spessore pannelli di vetro temperato, telaio in alluminio a forma di L e silicone acquario-grade (vedere Figura 1A). Coprire la parte inferiore del serbatoio con un grande foglio di sfondo bianco per fornire contrasto elevato per immagini (vedi protocollo 3).
  4. Dividere il serbatoio acquario in un'arena centrale (1,5 m di diametro) e quattro scomparti angolari (vedi Figura 1B) da pareti installazione (altezza 22,5 centimetri) fatte di lastre acriliche (opaco bianco, spessore di 0,64 centimetri).
    1. Bend quattro lastre acriliche (22,5 centimetri x 102,7 centimetri) mediante l'applicazione di calore per creare quattro sezioni parete curva, e fissarle al fondo del serbatoio utilizzando mastice siliconico per separare l'arena centrale da quattro vani d'angolo. Lasciare 20 cm di spazio tra i tratti curvi per l'installazione del cancello.
    2. Separa i compartimenti angolo confinanti con l'installazione di quattro doppie pareti wi° 15 centimetri lacune, che forniscono l'isolamento elettrico supplementare e luoghi per sensori sottomarini come un idrofono.
  5. Montare quattro cancelli motorizzati, e installarli tra i vani d'angolo e l'arena centrale.
    1. Montare quattro telai come mostrato nella Figura 1C. Creare sei pozzi (0,64 centimetri di profondità) su ogni telaio della porta, incorporare le noci nylon ghianda (filo diametro 0,64 centimetri) e fissarli con resina epossidica.
    2. Tagliate quattro pannelli porta in acrilico e fogli di gomma, e creare sei fori (0,64 centimetri di diametro) sul acrilico e pannelli in gomma per il meccanismo di bloccaggio. Unisciti alla acrilico e pannelli in gomma con silicone sigillante.
    3. Installare acrilico cerniere per unire i pannelli delle porte con le cornici delle porte.
    4. Mount bracci oscillanti sui servomotori e le inserisce sulla parte superiore dei telai (vedere Figura 1C). Effettuare cicli con le fascette per collegare i bracci oscillanti per i pannelli delle porte.
    5. Posizionare le assemblee cancello sulla gaps creato tra le sezioni parete curva, e fissarle con silicone sigillante.
    6. Collegare tutti i servomotori a un controller servo, e collegarlo ad una fonte di alimentazione e un computer tramite un cavo di estensione USB attiva. Testare le porte utilizzando il software di controllo in dotazione con il controller servo.
    7. Dopo indurisce il silicone, verificare la presenza di impermeabilità bloccando tutti i cancelli con le viti in nylon e riempiendo uno scomparto alla volta.
  6. Camera di isolamento. Costruire una camera di isolamento per circondare l'acquario e bloccare le fonti esterne di luce, suono e rumore elettrico (vedi Figura 1D).
    1. Fare tre pannelli a muro (2 mx 2 mx 5 centimetri) e quattro pannelli delle portiere (1,9 mx 0,95 mx 5 cm). Per ogni pannello, unire modanature in alluminio (5 centimetri x 2,5 cm) per creare una cornice rettangolare, e rivetto bianco pannello di plastica ondulata sul telaio in alluminio. Riempire Batts vetroresina acustici nei pannelli, e chiudere con un pannello di plastica ondulata nera.
    2. Installare tre pannelli sul pavimento anti-vibrazione, e installare pianoforte cerniere per unire i quattro pannelli porta sui pannelli a parete.
    3. Circondano la camera di isolamento con maglie in alluminio, e la terra maglie su tutti i lati per creare una gabbia di Faraday.
  7. Il controllo dell'umidità. Installare una ventola di scarico a bassa rumorosità (Figura 1F in alto) per rimuovere l'eccesso di umidità accumulo da riscaldamento. Posizionare la ventola di scarico di almeno 2 m di distanza dal luogo di registrazione, e installare un condotto d'aria tra la camera di isolamento e la ventola di scarico.
  8. Ordinariamente monitorare e mantenere le condizioni dell'acqua della vasca e gli animali.
    1. Mantenere le condizioni dell'acqua costante a 10 cm di profondità, 100 S / cm di conducibilità e pH 7.0 con l'aggiunta di acqua o soluzione salina magazzino (fare riferimento alla Knudsen 33 per la ricetta). Aggiungere un sacchetto di corallo schiacciato se il pH è inferiore a 6,5.
    2. Installare filtri per acquari verticali che possono funzionare da acque poco profonde per la pulizia eAi fini di aerazione (Figura 1F basso). Staccare i filtri e portarli fuori l'arena centrale durante le sessioni di registrazione.
    3. Invia mealworms vivi sul fondo della vasca allegandoli a ventose con elastici. Evitare di prede free-floating come blackworms per impedire l'alimentazione incontrollata di prede randagi durante la registrazione.

2. EOD inseguimento

  1. Installazione elettrodi. Montare otto elettrodi di grafite, e lo spazio in modo uniforme su parete curva dell'arena centrale.
    1. Ottenere disegno cavi (15 centimetri di lunghezza; Mars Carbon tipo 2 mm HB) e radersi il rivestimento esterno dei cavi.
    2. Tagliare otto dieci centimetri segmenti di cavo coassiale (RG-174), avvolgere il nucleo del cavo intorno un'estremità delle barre di grafite, e applicare guaina termoretraibile su di loro per il collegamento elettrico forte e stabile. Fissare i connettori jack BNC alle estremità opposte (figura 2A a sinistra). </ Li>
    3. Posizionare gli elettrodi sulla parete con nastro adesivo, e applicare sottili strisce di nastro adesivo sulle superfici degli elettrodi per proteggere da silicone. Applicare il silicone sigillante per tenere permanentemente gli elettrodi, e rimuovere tutto il nastro prima che la indurisce in silicone (Figura 2a a destra).
  2. Costruire otto gruppi di cavi misurando la distanza da ciascun elettrodo al amplificatore, e taglio cavi coassiali (RG-54) in lunghezze. Attaccare connettori BNC su entrambe le estremità dei cavi.
  3. Utilizzare i gruppi di cavi per collegare tutti gli elettrodi per l'amplificatore. Differenziale amplifica abbinando due 90 ° elettrodi orientati (vedi Figura 2B), e la terra tutti i fili di schermatura coassiali collegandoli alla gabbia di Faraday.
  4. Impostare il guadagno dell'amplificatore di sotto del limite di saturazione del segnale, e applicare un filtro passa-banda (200 Hz-5 kHz) per rimuovere il rumore. Digitalizzare le quattro coppie di elettrodi di registrazione a 40 kS / sec.
  5. Onlineelaborazione del segnale. Le istruzioni sono scritte per il software Spike2, e le impostazioni dei parametri sono ottimizzate per gimnoto sp. (Vedi Figura 2C per sintesi).
    1. Aggiungere un DC rimuovere processo (τ = 0.1 sec) per tutti i canali di registrazione.
    2. Aggiungere un processo di rettificare a tutti i canali registrazioni.
    3. Creare un canale virtuale sommando tutti e quattro i canali di registrazione.
    4. Estrarre una busta unimodale per EOD impulso con l'aggiunta di RMS (root-mean-squared, ) Processo (τ = 0,25 msec) al canale virtuale, per generare un singolo picco per ciclo EOD per determinare in modo univoco la sincronizzazione degli impulsi.
    5. Creare un canale realmark dal canale virtuale e registrare il tempo ei valori delle ampiezze di picco, dopo aver impostato una soglia appropriata per catturare tutta EOD impulsi wiThout manca un impulso, evitando i falsi positivi.
    6. Monitorare il tasso di EOD istantanea in tempo reale impostando l'opzione di visualizzazione del canale di realmark ad una modalità di frequenza istantanea.
    7. Monitorare il movimento del pesce in tempo reale duplicando il canale realmark, e impostare l'opzione di visualizzazione in una modalità forma d'onda.
    8. Quantificare un livello di attività dai RMS di ampiezza versante EOD creando un canale virtuale dal canale realmark (0.01 sec periodo di campionamento), e aggiungere pendenza (τ = 0.25 msec) e RMS (τ = 0.5 msec) processi.
    9. Esportare il canale realmark nel software Spike2 al formato MATLAB.

3. Sincronizzata Monitoraggio Video

  1. Creare una scena di sfondo.
    1. Nascondere qualsiasi oggetto che getta una riflessione sulla superficie dell'acqua coprendo con pellicola opaca controsoffitto bianco.
    2. Installare un bianco opacopannello di plastica ondulata 15 centimetri sotto il soffitto per nascondere la telecamera e lo sfiato.
    3. Stampa modelli di griglia su un grande foglio di carta bianca per calibrare una macchina fotografica, e posarlo sotto il serbatoio per fornire uno sfondo ad alto contrasto.
  2. Installare fonti di luce.
    1. Ottenere IR LED luci e rimuovere i fan built-in per ridurre il rumore. Guidare il led con alimentazione corrente continua regolata collocato al di fuori della gabbia di Faraday.
    2. Installare IR LED si illumina per l'imaging nelle tenebre, e di luci bianche a LED per la guida di un ciclo di luce diurna nel pesce di prova. Scalo tutte le sorgenti luminose verso il soffitto per ottenere l'illuminazione indiretta e uniforme (Figura 3A).
    3. Regolare il ciclo di luce diurna guidando il LED bianco con un timer controllato (ad esempio 12 ore on/12 ore off).
  3. Installare una telecamera direttamente sopra l'acquario.
    1. Ottenere una telecamera NIR-sensibili, o rimuovere un filte blocco IRr rompendo un sottile foglio di vetro colorato sul retro del gruppo ottico. Assicurarsi che l'angolo di visione è sufficientemente ampia per l'immagine tutta l'arena centrale.
    2. Fai un piccolo foro di osservazione nel centro del pannello del soffitto, e posizionare la telecamera direttamente sopra il foro.
    3. Installare una guardia anello bianco intorno alla lente se le sorgenti luminose generano riflessi.
  4. Effettuare una registrazione video sincronizzato.
    1. Inserire un IR LED in uno dei quattro angoli del serbatoio per generare impulsi di sincronizzazione di tempo (1 durata msec, 10 d'epoca sec). Aggiungere un resistore limitatore di carico (1 k) in serie, e guidare il LED IR da una porta di uscita digitale del digitalizzatore hardware.
    2. Utilizzare il software di registrazione video in dotazione con la fotocamera, se disponibile. Selezionare la più alta qualità di registrazione (ad esempio la compressione lossless) e le più alte risoluzioni supportate.
    3. Avviare la registrazione video immediatamente prima di iniziare la registrazione EOD, e fermare la immediata registrazione videodiatamente dopo la registrazione EOD.
    4. Dopo la registrazione, convertire i numeri di frame di immagine per l'unità di tempo digitalizzatore interpolando linearmente tra il primo e l'ultimo impulsi luminosi catturati dal digitalizzatore segnale e la registrazione video.
  5. Monitoraggio automatica delle immagini
    Le istruzioni sono scritte per l'elaborazione delle immagini MATLAB toolbox, e fare uso delle sue funzioni. Uno script MATLAB personalizzato è dotato di questo mezzo per il monitoraggio automatizzato di immagine.
    1. Importare video. Importare un file di registrazione video direttamente nell'area di lavoro MATLAB con "Videoreader. Leggere" la funzione.
    2. Creare un'immagine di sfondo composta dalla combinazione di due fotogrammi dell'immagine. Sostituire l'area di immagine occupata da un animale con un'immagine non occupata della stessa regione da un altro frame (vedere Figura 3B).
    3. Specificare un'area di immagine per tenere traccia disegnando una maschera circolare intorno alla scena centrale di escludere l'unarea all'esterno (Figura 3B basso), e moltiplicare per una costante (r int) di fissare una soglia minima per la differenza di intensità. Ad esempio, impostando tampa = 0.85 saranno sopprimere le fluttuazioni di intensità del 15% = (1 - r int) sotto lo sfondo.
    4. Sottrazione Immagine. Sottrarre una cornice immagine (= k IM) dalla immagine di sfondo (IM = 0) per ottenere l'immagine differenza (= ΔIM k). Utilizzare intero senza segno precisione numerica per memorizzare i valori di intensità di immagine come numeri interi non negativi.
    5. Segmento l'immagine differenza applicando una soglia di intensità determinata dalla funzione graythresh. Pulire l'immagine binaria utilizzando la funzione bwmorph e selezionare il più grande blob corrispondente ad un animale dopo aver calcolato tutte le aree blob utilizzando la funzione regionprops.
    6. Determinare il baricentro e l'orientamento principale di unxis del grande blob applicando la funzione regionprops, e ruotare l'immagine per allineare l'asse maggiore con l'asse x. Dividere l'immagine per le parti di testa e di coda del baricentro (top Figura 3D).
    7. Determinare l'asse maggiore della parte di testa, e ruotare l'intera immagine di allinearsi con l'asse x (Figura 3D in basso a sinistra). Montare delimitazione box intorno alla testa e le parti posteriori parallele al loro assi principali utilizzando la funzione regionprops.
    8. Determinare i mediani coordinate y del blob a sinistra, centro e bordi verticali destra delle caselle di delimitazione (punti verdi in fondo la figura in 3D), e assegnarli a cinque punti caratteristici (testa-punta, metà testa, metà corpo , mid-coda, punta della coda).
    9. Elaborare fotogrammi successivi dopo il ritaglio una cornice immagine centrata al baricentro dell'animale determinata dal suo fotogramma precedente.
    10. Assegnare manualmente l'orientamento della testa per il primo fotogramma, e utilizzare un betwe dot-prodottoen i vettori di orientamento di due fotogrammi successivi per determinare automaticamente l'orientamento della testa. Controllare il risultato, e capovolgere manualmente l'orientamento della testa se assegnato in modo errato.
  6. Tracciare una traiettoria animale unendo i testa-punte, e liscio con mediana e filtri medi (n = 3) se ha un aspetto nervoso. Sovrapporre la traiettoria con un'immagine di sfondo, e interpolare linee mediane di pesce con i cinque punti caratteristici (vedi Figura 2E).
  7. Calcolare il tasso medio EOD ad ogni immagine tempo di acquisizione da parte ricampionamento il tasso EOD istantanea (100 Hz frequenza di campionamento) e media (finestra di tempo 0,0625 sec). Tracciare la traiettoria in pseudo-colori determinate dal tasso EOD-time abbinati, e sovrapporre un'immagine di sfondo (vedi Figura 2F) con.

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Representative Results

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Monitoraggio dei risultati EOD

Le forme d'onda EOD registrate da diverse coppie di elettrodi varia in ampiezze e forme come previsto dalle loro posizioni uniche e orientamenti (Figura 2C alto). L'uso di più coppie di elettrodi assicurata forte ricezione del segnale a tutte le possibili posizioni e orientamenti del WEF all'interno del serbatoio. La forma d'onda busta (Figura 2C sotto, tracce verde) conteneva sempre un unico picco per ciclo EOD, che serviva come un marcatore tempo affidabile per determinare con precisione gli intervalli tra impulsi e il tasso di EOD istantanea (IPI = -1). I picchi EOD successivi sono state riunite e interpolati linearmente ad intervalli di tempo costanti (Figura 2D migliori, traccia nera), e il tasso di EOD istantanea è stata simile interpolati a intervalli di tempo costanti (in basso figura 2D, traccia rosa). La procedura di ricampionamento costante di tempo facilita la sincronizzazione dell'ora siainterpolare la traiettoria di movimento e il segnale EOD, e permette di sfruttare da un maggior numero di strumenti analitici per dati in serie temporale costante nel campione. Le ampiezze EOD registrati a elettrodi esterni rimasto costante mentre un animale è a riposo (Figura 2E top), ma varia nel tempo mentre l'animale spostato a causa del cambio di posizione e orientamento dipolo (Figura 2F alto). Così, il movimento pesce potrebbe dedurre osservando la variazione delle ampiezze EOD nel tempo. Il tasso di EOD di base è rimasto basso durante pesce era a riposo (Figura 2E in basso), ma il tasso di EOD è diventato significativamente più alto, mentre il pesce nuotava attivamente (Figura 2F alto). La nostra osservazione è coerente con la correlazione positiva tra il tasso EOD e il movimento pesce come precedentemente riportato 8,9,34,35.

Risultati di monitoraggio video

Traiettoria e mediane dell'animale sono mostrati in Fig. ure 3E con il primo e l'ultimo fotogramma di immagine sovrapposti. Il tempo-corso di cambiamento della postura è stato catturato mentre il pesce è stato bruscamente girando per due secondi, e le linee mediane di pesce vengono tracciate ogni 200 msec. La linea mediana pesce avviato correttamente alla testa-punta e terminato alla punta della coda dei pesci. Le immagini di pesce strettamente concordati con le linee mediane cingolati automaticamente nonostante le ombre fuse dall'animale. Figura 3F illustra il tasso variabile nel tempo medio di EOD (τ = 0,0625 sec) di colore, che si sovrappone con la traiettoria in tempo abbinato della testa di pesce -tip. Durante la durata di svolta 2 sec, il tasso medio EOD raggiunto il suo picco mentre l'animale era nel mezzo della fase di tornitura, e il tasso diminuita verso la fine della rotazione. Questo risultato rappresentante dimostra che il nostro metodo può essere applicato con successo per studiare la relazione tra i movimenti autoguidati e la modulazione tasso EOD durante nuotare liberamente.

t "fo: keep-together.within-page =" always "> Figura 1
Figura 1. Installazione serbatoio e camera di isolamento Aquarium. A) La camera sperimentale è costituito da un piano anti-vibrazione, carro armato dell'acquario, ed una camera di isolamento. B) Il serbatoio acquario è stato diviso in arena centrale per l'esecuzione di esperimenti e quattro scomparti angolari per l'edilizia abitativa individuale pesce. Ogni scompartimento è stato costruito a tenuta stagna per impedire la comunicazione elettrica tra animali. C) Il cancello motorizzato è illustrato a più angolazioni prospettiche. Il cancello diventa impermeabile quando è bloccato da sei galletti che comprimono la guarnizione in gomma (il foglio marrone chiaro). Una volta sbloccato, il cancello può essere azionato a distanza dal servomotore sulla parte superiore. D) La camera di separazione è stato assemblato unendo tre wtutti i pannelli e quattro pannelli delle porte, che forniscono l'accesso al serbatoio acquario da due lati. Il pannello inferiore illustra le rotaie di legno per sostenere i bordi del serbatoio, e il posizionamento del riscaldatore pavimento. Uno strato di maglia di alluminio copre il riscaldatore per proteggere il suo rumore elettrico. E) Le pareti e pannelli porta della camera di isolamento sono stati costruiti da telai in alluminio per supporto strutturale (3). Le superfici interne della camera sono coperti da pannelli di plastica bianca (5) per riflettere sorgenti luminose interne, e gli esterni sono coperti da pannelli di plastica nera (2) per bloccare sorgenti luminose esterne. Una rete di alluminio (1) copre le pareti esterne di bloccare disturbi elettrici esterni. La parete è piena di Batts vetroresina acustici (4) F) La foto in alto mostra la configurazione ventilazione per rimuovere l'umidità in eccesso generata dal riscaldamento;. Ed la foto in basso mostra la configurazione di filtrazione dell'acqua per la pulizia, la diffusione, e aerare il serbatoio di acqua tra sperimentalesessioni. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 2
Figura 2. Impostazione della registrazione EOD e risultati rappresentativi. A) Il pannello di sinistra mostra l'assemblaggio di elettrodo costituito da un elettrodo sottile di grafite, un breve segmento di cavo coassiale, e un BNC Jack. Il pannello di destra mostra elettrodi istruzioni di fissaggio. Nastro adesivo è utilizzato per posizionare temporaneamente il gruppo elettrodi, e calafataggio silicone è stato applicato a tenere permanentemente l'elettrodo. B) Lo schema elettrico. Due elettrodi 90 ° orientati sono appaiati, differenziale amplificato e filtrato. Quattro canali di registrazione sono stati digitalizzati di fuori del Faraday cetà. C) Illustrazione delle fasi di elaborazione del segnale EOD. Le prime tracce mostrano le forme d'onda prime provenienti da quattro coppie di elettrodi, che vengono rettificati e sommate per produrre la traccia grigia sotto. Buste unimodali sono estratti dalla forma d'onda grigia con il "root-mean-Square" (RMS) Filtro (traccia verde). Le ampiezze EOD e IPI sono determinati dalle vette busta. D) Le variabili nel tempo EOD ampiezze (in alto) e il tasso di EOD istantanea (in basso) sono riportati su una scala temporale più lungo di C). Le ampiezze EOD ed il tasso istantaneo (IPI = -1) sono interpolati a intervalli di tempo regolari unendo i picchi busta (tracce nere). E) Uguale D), ma tracciati su una scala temporale più lungo, mentre pesce era a riposo. F) Stessa E), mentre i pesci attivamente nuotando. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 3
Figura 3. Impostazione del monitoraggio video e risultati rappresentativi. A) L'installazione di illuminazione e la fotocamera è illustrato. Il infrarossi (IR) e sorgenti di luce visibile sono attaccati alle pareti e puntati verso il soffitto, in modo tale che la superficie del soffitto riflette e diffonde la luce per proiettare un'illuminazione uniforme su tutta la vasca. La telecamera è nascosta sopra il pannello del soffitto per impedire la riflessione sulla superficie dell'acqua. Un LED IR è posizionato in uno dei quattro angoli del serbatoio per generare impulsi di sincronizzazione di tempo. B) di generazione di immagine di sfondo un composito è illustrato. Due cornici immagine (immagini in alto) sono combinati per formare l'immagine di sfondo composito (in basso a sinistra) sostituendo la regione contenente l'animale (cosìCoperchio quadrato rosso) con la regione, senza l'animale (tratteggiata quadrato rosso). Area di fuori dell'arena centrale è mascherato in nero (in basso a destra). C) Isolare il contorno di pesce. Una cornice immagine (in alto a sinistra) viene sottratta dalla immagine di sfondo (in alto a destra) per produrre l'immagine differenza (in basso a sinistra), e convertito l'immagine binaria (in basso a destra) applicando una soglia di intensità. D) Misura della posizione del corpo e la postura sono illustrati. L'immagine binaria dell'animale (blob) è stata ruotata per allineare l'asse maggiore con l'asse x (in alto a destra), e centrato al suo baricentro. Il blob stato separato alla testa (rosso) e coda (blu) parti, e ciascuna parte è stata ruotata separatamente per determinare la sua riquadro di delimitazione. Il blob è stato orientato al telaio dell'animale di riferimento (in basso a sinistra), e cinque punti caratteristici (head-end, mid-testa, metà corpo, metà-tail, coda-end) sono stati determinati dai punti medi del riquadro di delimitazione bordi. E) Time-lapse iml'età delle linee mediane di pesce tracciati ogni 200 msec. Il primo e l'ultimo fotogramma di immagine sono sovrapposte durante la durata di svolta 2 sec. F) Il tasso medio EOD è rappresentato in pseudo-colori e sovrapposto con la traiettoria della testa di pesce. Le stesse immagini sono utilizzate come in E). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

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Discussion

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Importanza delle nostre tecniche. In sintesi, abbiamo prima descritto la costruzione di un grande acquario e una camera di isolamento per osservare i comportamenti esplorativi spontanee prodotte dal WEF. Successivamente, abbiamo dimostrato la tecnica di registrazione e il monitoraggio del tasso di EOD e gli stati di movimento dal pesce sfrenato in tempo reale utilizzando più coppie di elettrodi. Infine, abbiamo descritto la tecnica dell'infrarosso registrazione video attraverso l'acqua in modo sincronizzato tempo, e l'algoritmo di inseguimento immagine per misurare la posizione del corpo e la postura. Come una preparazione sperimentale, WEF offre un vantaggio importante per lo studio dei comportamenti sensoriali guidati attivi dimostrando tasso EOD facilmente quantificabili, che equivale alla frequenza di campionamento electrosensory attiva. La combinazione di queste tecniche può consentire l'osservazione preciso e affidabile a lungo termine 8 di comportamenti spontanei di sfrenato WEF. Inoltre, la maggioranza del nostro setup può essere costruito from ampiamente disponibili materiali da costruzione e componenti elettronici facilmente ottenibili. Le tecniche descritte qui sono stati sviluppati e testati per soddisfare le nostre esigenze sperimentali negli ultimi anni. Pertanto, si consiglia queste tecniche per gli studi futuri di comportamenti esplorativi spontanee di nuotare liberamente WEF.

Camera di isolamento. La camera di isolamento prevede condizioni sperimentali ben controllate bloccando fonti esterne di luce, vibrazione, suono e rumore elettrico con diversi gradi di efficacia. La performance luce blocco è stato testato posizionando una telecamera motorizzata all'interno della camera di isolamento buio, e nessuna perdita di luce esterna è stata osservata dalla fotocamera dopo la scansione ubicazione utilizzando il controllo remoto pan. La superficie di smorzamento delle vibrazioni installato sotto l'attenuazione serbatoio fornito dalle vibrazioni esterne canalizzati dal pavimento, e la sovrapposizione di più strati di gomma e schiuma era efficace per bloccare la maggior parteeventi vibrazioni esterne. Tuttavia, gli eventi vibrazioni intermittenti come la chiusura della porta rumoroso di località vicine, hanno fatto scatenare reazioni novità in rare occasioni. Anche se una tabella di aria anti-vibrazione potrebbe fornire prestazioni di isolamento superiore da vibrazioni di fondo, sarebbe proibitivo per l'acquisto di un tavolo di aria abbastanza grande per il nostro acquario. Pertanto, abbiamo messo un sottomarino idrofono per individuare ed escludere gli eventi quando grandi vibrazioni esterne attivate risposte novità. Per ridurre ulteriormente l'influenza del rumore esterno del laboratorio, i nostri esperimenti sono stati condotti durante le ore di punta (dopo le 18:00). Allo stesso modo, il rumore acustico per via aerea esterna è stata attenuata attraverso le pareti della camera di isolamento riempiti con isolamento in fibra di vetro batte. Anche se non abbiamo oggettivamente quantificare le prestazioni di attenuazione del suono, la maggior parte del suono di sottofondo in un ambiente di laboratorio non ha innescato le risposte novità. In rare occasioni, un suono forte improvviso dal grilletto esternoEd una risposta novità, ma un evento del genere è stato rilevato dalla registrazione idrofono, e raramente si è verificato durante le ore di punta. L'acquario ha fornito sufficientemente grande area per i nostri animali di nuotare liberamente ed esplorare. La dimensione del serbatoio è stato scelto in proporzione alla lunghezza di specie abbiamo usato (fino a 30 cm), ma la dimensione del serbatoio può essere ridotta se sono stati usati animali più piccoli. Abbiamo scelto gimnoto sp. tra le diverse specie di impulso-tipo per le loro grandi dimensioni del cranio per facilitare le registrazioni elettrofisiologiche durante privo di nuoto 36. La qualità di registrazione elettrica può migliorare l'utilizzo più costosi maglie rame, e schermatura del ventilatore di scarico utilizzato per il controllo dell'umidità.

Tecnica di misura EOD. La nostra tecnica di registrazione EOD multi-canale permesso misurazione tempi EOD preciso e affidabile dal nuoto libero pesce. Usando la nostra tecnica, tutti gli impulsi generati EOD nuotando liberamente WEF sono stati rilevati senza perdere o l'aggiunta di un peccatoGLE impulso per una durata di registrazione lungo di sei ore (vedere Figura 12 giugno et al. 8). Le misure di registrazione EOD non solo il tasso EOD, ma anche il livello di attività del tempo variabile EOD ampiezze di picco registrati a elettrodi esterni. Le ampiezze EOD registrati sono determinate dalla geometria relativa tra gli elettrodi di registrazione di un animale e, quindi movimenti degli animali inducono variazioni delle ampiezze EOD (Figura 2F). Il livello di attività è stata calcolata dalla variabilità (RMS) della ampiezza pendenza EOD all'interno di una finestra mobile (0,5 sec). Usando questo metodo, la registrazione video non sarebbe necessaria per misurare il livello di attività per un lungo periodo di tempo, e la registrazione EOD solo può essere sufficiente. Invece di utilizzare una registrazione video, la posizione del corpo e la postura del WEF possono essere dedotte dalla registrazione EOD solo sulla base delle posizioni degli elettrodi, la geometria di un serbatoio, e un modello teorico di un dipolo corrente. Utilizzando un recordi simileinstallazione ng, Jun et al. 20 hanno proposto un metodo di monitoraggio elettrico in tempo reale per il monitoraggio di più WEFs in presenza di un oggetto, che mette a confronto intensità del segnale misurato ai più coppie di elettrodi di registrazione con le voci della tabella di ricerca contenenti intensità di segnale previsti in note località dipolo attuali. Il metodo di monitoraggio elettrico offre maggiore affidabilità di monitoraggio in un ambiente visivamente ingombra in cui gli animali vengono spesso ostruite dalla vista, o durante il monitoraggio di più animali. Habitat naturalistici del WEF contengono molti ostacoli visivi come piante acquatiche e radici, in cui il metodo di tracciamento elettrico potrebbe fornire monitoraggio più affidabile con i requisiti di installazione semplici di tracking visivo. In linea di principio, il nostro metodo è direttamente applicabile alla specie WEF onda di tipo dopo il cambio costanti di tempo del filtro. Il passo rettifica introdurrà due modi per ciclo EOD, dal momento che la forma d'onda EOD è approssimativamente sinusoidale in specie onda tipo. In questo caso, Il tasso di EOD istantanea può essere determinato saltando tutti gli altri marcatori di tempo EOD di ignorare la fase EOD negativo. WEF in grado di rilevare gli elettrodi di registrazione quando nuotano nelle vicinanze quindi abbiamo evitato di utilizzare grandi o metallici elettrodi che possono essere sentite da più lontano 37, e invece utilizzati elettrodi di grafite sottile (2 mm di diametro). Cavi coassiali sottili (RG-174) sono stati utilizzati con i gruppi di elettrodi per la flessibilità, ma cavi coassiali spessi (RG-54) sono stati utilizzati per il cablaggio su lunghe distanze per schermatura elettrica superiore. Tolto durata della registrazione EOD può essere raggiunto abbassando la frequenza di campionamento, ma con una risoluzione temporale inferiore come un trade-off. La media e la variabilità del tasso EOD varia tra le specie, così la finestra di tempo per il livellamento del tasso EOD istantanea deve essere regolato in modo appropriato. Una finestra di tempo più breve è raccomandato per specie aventi medio più breve e più piccola variabilità nel IPI (es Gymnotiforms), e un tempo più lungo window è raccomandato per le specie che hanno più media e più alta variabilità nella IPI (ad es Mormiridi).

Illuminazione e configurazione della telecamera. Registrazioni video forniscono osservazioni comportamentali quantitativi e qualitativi, e qui abbiamo descritto le modalità di costituzione, la registrazione e l'elaborazione dei dati di immagine. Installazione illuminazione gioca un ruolo importante nella produzione di immagini di alta qualità, e l'angolo di proiezione della luce è un fattore importante per l'imaging animali sottomarini. In condizioni di luce non ottimali, la superficie dell'acqua può formare riflessi e riflessioni, che possono interferire con l'inseguimento immagine soprattutto quando gli animali generano onde di superficie. I problemi dovuti ai riflessi possono essere eliminati proiettando sorgenti luminose dal fondo di una vasca. Per un piccolo serbatoio, matrici di LED possono essere posizionati direttamente sotto il serbatoio e brillano attraverso un pannello diffusore per generare l'intensità della luce uniforme 38. Allo stesso modo per un serbatoio più grande, una sorgente di luce cun essere posizionato sotto il serbatoio, e l'intensità della luce uniforme può essere realizzato consentendo distanza sufficiente per diffondere luce 39. Nella nostra impostazione, siamo stati costretti a proiettare la luce da sopra il serbatoio a causa di vincoli di spazio, stabilità strutturale, e il posizionamento di riscaldamento sotto il serbatoio. Abbiamo evitato i problemi di abbagliamento e di riflessione, utilizzando l'illuminazione indiretta, in modo tale che le sorgenti luminose sono state proiettate verso il soffitto. Rendendo la parte superiore della camera bianca informe e opaco, senza riflessi erano visibili sulla superficie dell'acqua. Per l'immagine tutta l'arena centrale, un obiettivo grandangolare può essere montato sulla fotocamera, ma alcuni obiettivi (lente fish-eye) possono causare una significativa distorsione a barilotto. La distorsione a barilotto può essere corretto utilizzando un foglio griglia di calibrazione sotto il serbatoio per misurare le coordinate di pixel dei punti della griglia visualizzate al centro del serbatoio. Insieme con i punti della griglia corrispondenti in centimetri, una matrice di trasformazione può essere calcolato per correct la distorsione a barilotto 40. Si consiglia di telecamere ad alta risoluzione se la dimensione animale è molto più piccola della dimensione del serbatoio, in modo che un numero sufficiente di pixel può essere ottenuto dall'animale per misurare correttamente la sua postura.

Monitoraggio Immagine e sincronizzazione del tempo. L'algoritmo di inseguimento immagine qui descritto fa uso dell'operazione regione di interesse (ROI) per misurare rapidamente la posizione del corpo e la postura. L'operazione ROI riduce la dimensione dell'immagine da elaborare, e limita la gamma di inseguimento vicino alla posizione animale dal fotogramma precedente. Abbiamo estratto la postura del corpo (linea mediana) utilizzando la rotazione delle immagini e le operazioni di delimitazione-box anziché l'operazione di immagine scheletrizzazione al solito, che a volte non è riuscito a produrre una singola linea mediana ben definito. Cornice dell'animale di riferimento è situato al centro del riquadro di delimitazione testa, che consente l'analisi del comportamento egocentrico. La principale fonte di errore nella tracki immagineng è dovuto all'effetto ottico di proiezione a grandangolo. Idealmente, i movimenti verticali di animali non dovrebbero influenzare la misurazione della posizione in 2D, ma il più lontano dall'asse di imaging centrali, la maggior parte della dimensione verticale è proiettata alla fotocamera. La rifrazione sulla superficie dell'acqua ha ridotto l'effetto ottico di proiezione del 28% nel nostro setup di imaging (altezza fotocamera = 1.8 m, profondità = 10 cm, raggio serbatoio = 75 cm), e il peggiore errore di posizione era ± 1,4 centimetri alla circolare recinzione. La tempistica tra la EOD e registrazioni video sono stati sincronizzati utilizzando impulsi LED infrarossi per spiegare la deriva di tempo tra il video e gli orologi di digitalizzazione del segnale, e diversi tempi di avvio della registrazione. L'incertezza previsto nella sincronizzazione tra il video e registrazioni EOD è proporzionale all'intervallo di cattura della trama, ad esempio, 15 fotogrammi al secondo (fps) Frame Rate cattura comporterà l'allineamento incertezza tempo di ± 33 msec. Tale grado di time precisione è sufficiente per tracciare i pesci in movimento lento, ma una telecamera ad alta velocità può essere richiesto per il monitoraggio rapido animali in movimento. Si consiglia brillante intensità della luce con un aumento del frame rate, dal momento che il tempo di esposizione del sensore è inversamente proporzionale alla frequenza dei fotogrammi.

Lavoro futuro. Interazioni sociali tra più WEFs possono essere studiate tenendo traccia dei loro segnali EOD e le posizioni del corpo, e il sistema di tracciamento deve associare correttamente il EOD l'ubicazione dello stesso individuo. Secondo il metodo di localizzazione dipolo descritto da giugno et al. Un 20 con configurazione simile, le posizioni degli animali desunti dai loro segnali EOD ricevuti elettrodi multipli possono essere abbinati all'uscita tracciamento visivo per identificare correttamente gli impulsi EOD da diversi individui. Monitoraggio Immagine di molteplici animali può essere effettuata una sola persona alla volta utilizzando l'operazione di ROI. Un ROI può essere inizialmente definito attorno a un individuo diessere rintracciato, e il ROI sarà riposizionato in ogni fotogramma con il corpo una posizione aggiornata. Gli altri pesci saranno esclusi dall'analisi inseguimento immagine quando appare al di fuori del ROI, e se è apparso dentro, l'immagine di altri pesci possono essere rimossi automaticamente controllando se la sua immagine tocca il confine ROI. A volte, due animali contattarsi e le loro immagini fondono, e se così, una maschera possono essere disegnati manualmente per separare l'immagine dell'altro pesce. Un altro lavoro interessante futuro è il video tracking tridimensionale per rivelare le sequenze complesse di movimento durante la cattura prede 22 o interazioni sociali. MacIver et al. 22 usato due telecamere per visualizzare un acquario rettangolare dalla parte superiore e la parte per ricostruire un modello di corpo tridimensionale. Tuttavia, questo approccio non funzionerebbe nel nostro caso, poiché ci sono pareti divisorie che bloccano viste laterali e l'acquario ha molto larghezza maggiore profondità. Invece, sarebbe più appliCavo di installare più telecamere sul soffitto in prospettiva diversa angoli simile a quella di installazione utilizzato da Hedrick 41. Per maggiore precisione, l'effetto di rifrazione introdotto dall'acqua e l'angolo della telecamera obliquo dovrebbe essere corretta calibrando immagini in tre dimensioni. Il nostro metodo di monitoraggio visivo potrebbe essere applicato per studiare il flusso elettrico immagine sulla superficie del corpo di pesce 42,43 quando il pesce nuota vicino un oggetto. Come studiato da Hofmann et al. 26, sarebbe interessante indagare flusso elettrico l'immagine dell'oggetto durante il nuoto libero in funzione della distanza dell'oggetto, forma, dimensione e materiale. In definitiva, i nostri metodi combinati con le registrazioni neurali dal nuoto liberamente pesce 44-46 possono rivelare nuove intuizioni da osservazioni di cambiamenti nell'attività neuronale e il tasso EOD mentre il pesce si impegna in esplorazione oggetto o interazioni sociali.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato generosamente sostenuto dalle scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada (NSERC) e Canadian Institutes of Health Research (CIHR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aquarium Construction
Electrically shielded floor heater ThermoSoft Corp., IL, USA ThermoTile www.thermosoft.com
Tempered glass panel generic 0.5 in thick, used for the aquarium construction
Aquarium grade silicone generic  
Acrylic sheet generic 0.25 in thick, matte white
Natural rubber sheet generic 0.25 in thick
Servomotor HTECHRCD Inc., Korea HS-325HB, 180deg rotation www.servocity.com
Servomotor arm mount HITECHRCD Inc., Korea 56362 Large Spline www.servocity.com
Servomotor controller (6 channels) Sparkfun ROB-09664 Micro Maestro 6-channel USB Servo Controller
Active USB extension cable C2G 38990 12 m USB 2.0 A Male to A Female 4-Port Active Extension Cable
Exhaust fan Nutone ILFK120 www.homedepot.com
Vertical aquarium filter Tetra, Germany Whisper Internal Power Filter - 40i  
Crushed coral Used to increase the pH of the tank water
EOD Recording Setup
Graphite Electrodes Staedtler, Germany Mars Carbon 2-mm type HB Shave the outer coating
Physiological Amplifier/Filter Intronix, Canada 2015F  
Coaxial Cable generic RG174 For electrodes assembly
Coaxial Cable generic RG54 For wiring use
BNC jack connector for RG-174 Amphenol Connex 112160 For electrodes assembly
BNC plug connector for RG-54 Amphenol Connex 112116 For wiring use
Signal digitizer hardware Cambridge Electronic Design, UK Power MKII 1401  
Signal digitizer software Cambridge Electronic Design, UK Spike 2. ver 7  
Visual Tracking Setup
White LED light IKEA, Sweden DIODER 201.194.18 www.ikea.com
Infrared LED light (850 nm) Scene Electronics, China S8100-60-B/C-IR Remove built-in fan
USB webcam Logitech Inc., CA, USA C910 Remove Infrared blocking filter
Motorized camera Logitech Inc., CA, USA Quickcam Orbit Remove Infrared blocking filter
Video recording software Logitech Inc., CA, USA Logitech Quickcam Software Download from www.logitech.com
MATLAB Mathworks, MA, USA 2012a Image processing toolbox

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Jun, J. J., Longtin, A., Maler, L. Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish. J. Vis. Exp. (85), e50962, doi:10.3791/50962 (2014).More

Jun, J. J., Longtin, A., Maler, L. Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish. J. Vis. Exp. (85), e50962, doi:10.3791/50962 (2014).

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