Larven av vaxet moth Galleria mellon nyligen etablerat som en in vivo-modell för att studera Legionella pneumophila infektion. Här visar vi de grundläggande tekniker för att karakterisera patogenesen av Legionella i larverna, inklusive ympning, mätning av bakteriell virulens och replikering samt utvinning och analys av infekterade hemocyter.
Legionella pneumophila, är vilka smittämnen av en svår lunginflammation som heter legionärssjuka, en viktig mänsklig patogen som infekterar och replikerar i alveolära makrofager. Dess virulens beror på Dot / Icm typ IV sekretionssystem (T4SS), vilket är avgörande för att etablera en replikeringstillåt vacuole kallas Legionella innehåller vacuole (LCV). L. pneumophila infektion kan modelleras i möss men de flesta stammar mus är inte tillåtande, vilket leder till sökandet efter nya infektionsmodeller. Vi har nyligen visat att larverna av vaxet moth Galleria mellon är lämpliga för undersökning av L. pneumophila infektion. G. mellon används allt mer som en infektion modell för mänskliga patogener och en god korrelation mellan virulens av flera bakteriearter i insekten och i däggdjursmodeller. En viktig del av larver immunförsvar är hemocyter, yrkeal fagocyter, som tar upp och förstöra inkräktarna. L. pneumophila är i stånd att infektera, bildar en LCV och replikera i dessa celler. Här visar vi protokoll för analys av L. pneumophila virulens i G. mellon modellen, bland annat hur man odlar smitt L. pneumophila, förbehandla larverna med hämmare, infektera larver och hur man extraherar infekterade celler för kvantifiering och immunofluorescensmikroskopi. Vi beskriver också hur man kan kvantifiera bakteriell replikering och fitness i konkurrensanalyser. Dessa metoder möjliggör snabb screening av mutanter för att fastställa faktorer som är viktiga i L. pneumophila virulens, som beskriver ett nytt verktyg för att underlätta vår förståelse av denna komplexa patogen.
Djurmodeller av infektion har visat sig vara ovärderligt för bestämning av bakteriella virulensfaktorer. Dock har ryggradslösa modeller fått ökad uppmärksamhet som ett bärkraftigt alternativ till traditionella däggdjursmodeller infektion. Larverna av vax mal, är Galleria mellon alltmer för att studera ett antal viktiga humana patogener, inklusive grampositiva 1 och gramnegativa bakterier 2,3 och flera patogena svampar 4,5. Med användning av en insekt modell har ett antal fördelar jämfört med traditionella däggdjursmodeller, enligt en ryggradslös, G. mellon är inte föremål för de etiska begränsningarna i däggdjursmodeller. Dessutom kan larverna lätt underhållas, infekterades genom injektion utan bedövning genomgå förbehandling med kemiska inhibitorer 6 och upprätthålla inkubation vid 37 ° C 7. Intressant nog en god korrelation mellan patogenitet av flera mikroorganismer i G. mellonella och däggdjursmodeller av infektion har etablerats 2,8. Den ökade förståelsen av immunsystemet hos G. mellon har också hjälpt till karakteriseringen av denna modell organism. Även insekter inte har ett adaptivt immunsystem som finns i däggdjur, de har sofistikerade cellulära och humeralhuvuden försvar inklusive produktionen av antimikrobiella peptider 9. Hemocyter är den huvudsakliga förmedlaren av cellulära försvar och är de mest talrika celltypen som finns i hemolymfa (eller blod) av G. mellon 10, Dessa celler är professionella fagocyter och utföra liknande funktioner till humana makrofager och neutrofiler både att starta och förnedrande bakterier i ett phago-lysosomala fack 10,11 och bildar knölar runt invaderande bakterier, fysiskt begränsa bakteriell replikering 12.
Legionella pneumophila är en respiratorisk patogen som orsakar svår pneumonia (legionärssjuka) hos känsliga populationer som äldre eller nedsatt immunförsvar 13. Legionella finns överallt i både miljö-och konstgjorda vattenkällor, där det är en patogen av olika arter av sötvatten amöbor 14,15. Legionella överlever och replikerar inom dessa professionella fagocyter genom att använda en multi-proteinkomplex som kallas Dot / ICM (defekta i organellen trafficking / intracellulär förökning) typ 4-sekretionssystemet (T4SS) att translokera över 275 effektor-proteiner in i värdcellen 16 till 20. Dessa proteiner tjänar till att undergräva de normala värdcell fagocytiska vägar, vilket leder till skapandet av Legionella innehåller vacuole (LCV). Den LCV undviker fusion med lysosomer och istället rekryterar endoplasmatiska retiklet (ER)-härledda vesikler, vilket resulterar i ett specialiserat fack som liknar den grova ER 21,22. L. pneumophila anses vara en oavsiktlig mänsklig vägogen, samma strategier som gör det möjligt att replikera i amöbor, också tillåta replikering i mänskliga alveolära makrofager 23.
Däggdjursvärdar har karakteriserats som modeller för mänskligt Legionella infektion inklusive möss och marsvin 24,25. Men majoriteten av musstammar är resistenta mot Legionella infektion 26 med undantag för den inavlade albino A / J-mus, som utvecklar en mild, självbegränsande infektion 24. Även marsvinsmodellen mer liknar human sjukdom 25, bristen på mutanter och ökad kostnad avskräcker deras användning 27. Dessutom har flera ryggradslösa modeller utvecklats för Legionella pneumophila infektion inklusive Caenorhabditis elegans 28, Drosophila melanogaster 29 och flera arter av amöbor 30-32. Dessa modeller har svagheter, virulens i C. elegans </em> Systemet är inte Dot / ICM-beroende 28, vilket begränsar användbarheten av denna modell. Drosophila-modellen har visat sig effektiv i att undersöka bakterie virulensfaktorer 29 och verkar lovande men denna modell är inte helt karaktäriseras. Encelliga amöbor är miljö värdar för L. pneumophila och är idealiska för att undersöka effekten av virulensfaktorer på molekylär nivå 33 saknar dock flera viktiga förmedlare av den mammalievärdcell svar på infektion som t.ex. kaspaser 34. Bristerna i de nuvarande modellerna, tillsammans med den höga kostnaden och etiska frågor i samband med däggdjur experimenterande, har lett till sökandet efter andra lämpliga modellorganismer 29,35.
Vi har nyligen visat att G. mellon är en lämplig modell för L. pneumophila Pathogenesis 36,37. Detta protokoll detaljer de experimentella tekniker som används för smittaing G. mellon larver, analysera larv moral, utvinna hemocyter för räkning och immunofluorescens och bestämma replikation genom livskraftig CFU räknas från infekterade larver.
Galleria mellon larver modell för Legionella pneumophila infektion är ett användbart verktyg för in vivo-studier av patogenes. Här visas det att ett antal aspekter av makrofag infektion kan rekapituleras i G. mellon modellen, bland annat den roll som Dot / Icm T4BSS i virulens och bakteriell replikering och lokalisering av Dot / ICM-effektor SIDC. Dessutom visar vi att en kemisk hämmare av aktin polymerisation minskar avsevärt larvdödlighet, härma resultaten från macophages 47 och bevisningen att internalisering av bakterierna krävs för att orsaka larvdödligheten. Tidigare har det visats att variationerna i virulens mellan L. pneumophila stammar sett i andra infektionsmodeller kan verifieras i G. krävs mellon och induktion av virulensfaktorer i post-exponentiella tillväxtfasen för bakteriell virulens <sup> 36, bekräftar att G. mellon är en lämplig modell för L. pneumophila infektion.
Fastställande av CFU L. pneumophila från larver infekterade antingen var för sig eller i blandinfektioner kraftigt ökar användbarheten av modellen. Tidigare har flera faktorer upptäckts som har subtila effekter på bakteriell replikering i en eller flera modeller av infektion 29,48-51. Även om larverna inte har en adaptiv immunsystemet, närvaron av det medfödda immunsvaret ger starkare val jämfört med enbart makrofager, som kan tjäna till att amplifiera subtila fenotyper. Därför är det möjligt att även dessa stammar kommer sannolikt inte att påverka larvdödlighet, kan de visa minskad bakteriell replikering eller lämplighet i G. mellon modell. Samt replikering av L. pneumophila i larverna har vi visat betydande hemocyte utarmning sent i infektion. Som L.pneumophila väntas lysera värdceller vid slutet av sin replikationscykeln, mäta hemocyte utarmning kan också fungera som ett indirekt mått på bakteriell replikering. Hemocyte utarmning har tidigare satts i samband med insekts dödlighet i infektions 3,52, men nya resultat visar att bilden är mer komplex än först belived 37. Nyligen har det visats att svält av larver leder till ökad mottaglighet för infektion genom ett undertryckande av immunsvar 53. I de analyser som beskrivs här, har larverna inte matas under hela studien och det är inte känt hur väl matad larver skulle svara på L. pneumophila infektion.
En av fördelarna med G. mellon som modellorganism är enkel extraktion och kvantifiering av hemocyter från infekterade larver. Tidigare filmer har visat olika metoder för att extrahera hemocyter från insekter 54,55 dock träffathod presenteras här är enkla och lämpliga för omedelbar behandling. När extraherade, kan hemocyter lätt kvantifieras, som används för immunofluorescens, transmissionselektronmikroskopi 36 eller flödescytometri 56 eller odlade och infekterade ex vivo 3 vilket gör att cellernas respons på infektion ska undersökas i detalj. Detta ökar avsevärt flexibiliteten hos modellen. En varning för att immunofluorescens i G. mellon är det begränsade utbudet av antikroppar valideras mot G. mellon proteiner. Men studier har visat att skapa antikroppar mot larv proteiner 57 och antikroppar mot humana immunrelaterade proteiner befanns känna igen G. mellon proteiner 11 som visar potentialen för immunofluorescens på G. mellon hemocyter.
Enkelheten i G. mellon infektion möjliggör snabba, medel genomströmning skärmar som kundeanvändas för att jämföra virulensen hos olika Legionella-arter och stammar och kan användas för att ytterligare analysera tidigare identifierade virulensfaktorer såsom adhesionsmolekyler 58 eller typ 2-sekretionssystemet 59 som erfordras för virulens i andra modeller. Dessutom kommer användningen av denna modell för att möjliggöra identifiering och ytterligare karakterisering av nya virulensfaktorer inklusive utsöndrade och translokerade effektor-proteiner. Nyligen har det visats att fosfolipas C-aktiviteten hos L. pneumophila har en roll i G. mellon virulens 60 och att Dot / Icm effektorprotein SdhA krävs för virulens 37. Dessutom har vi nyligen visat att det finns ett samband mellan de fenotyper som observerats i G. mellon och i A / J mus-stam 37.
Detta understryker värdet av detta verktyg för att komplettera protozo miljö och encellig värd och murine infektionsmodeller. The G. mellon modell kommer att bli ännu mer värdefull i framtiden, när larver genomsekvensen kommer att finnas tillgängliga och fler genetiska verktyg är etablerade. Stegen i denna riktning omfattar den nyligen offentlig beskriver immunrelaterade transcriptome 61 och bildandet av ett initiativ för att främja geners uttryck i Lepidoptera spp. 62.
Genom att använda G. mellon larver, har vi ett antal enkla, snabba avläsningar av bakteriell virulens som kan användas för att undersöka patogenesen av L. pneumophila. Inrättande av dessa analyser och bredare screening av L. pneumophila stammar och serogrupper kommer att öka nyttan av detta nya verktyg och kommer att bidra till vår förståelse av L. pneumophila patogenes.
The authors have nothing to disclose.
CR Harding stöddes av Wellcome Trust student WT086724.
Material/ Equipment | |||
ACES yeast extract (AYE) broth | 4 g ACES, 4 g yeast extract, 0.4 g α-ketoglutarate, pH 6.9, 400 ml H2O, autoclaved, 4 ml iron solution*, 4 ml cysteine solution* *add sterile ingredients after autoclaving |
||
Charcoal buffered yeast extract (CYE) plates | As above, with the addition of 0.6 g activated charcoal and 6 g agar | ||
Sterile iron solution (Ferric Pyrophosphate) | Sigma | P6526 | 0.6 mM solution, sterile filtered |
Sterile cysteine solution | Sigma | C7880 | 3.3 mM solution, sterile filtered |
G. mellonella (waxworms) | Livefood UK | W250 | |
Anti-HA-Tetramethyl Rhodamine Isothiocyanate (TRITC) | Sigma | H9037 | |
Anti-Legionella LPS | Cambridge Biosciences | PA1-7227 | |
Anti-Rabbit IgG Alexa488 | Jackson Immunoreach | 711-485-152 | |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma | I6758 | |
Dulbeccos phosphate buffered saline (D-PBS) | Sigma | D8662 | |
Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1026 | |
Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma | A9434 | |
Trypan Blue solution | Sigma | T8154 | |
Digitonin | Sigma | D141 | |
Cytochalasin D | Biomol International | BML-T109-0001 | |
[header] | |||
Material | |||
Microtiter Syringe | Sigma | 24544 | |
Cell counter, double, Improved Neubauer | VWR | 631-0926 | |
Centrifuge | For centrifuging plates | ||
Fluorescence microscope | Any microscope with appropriate filters for the required fluorophores | ||
Inverted microscope | For viable cell counting | ||
Puncture-proof glove | Turtleskin |